Toll樣受體4在對乙酰氨基酚致小鼠肝損傷過程中對肝臟再生的影響

陳明月, 鄭秀良, 喬亞琴, 沈海濤, 路 燕

安徽醫科大學第二附屬醫院消化內科, 合肥 230601

近年來藥物性肝損傷發病率逐漸上升,日益受到人們的關注。引起藥物性肝損傷的原因較多,例如中草藥、抗菌藥、非甾體類抗炎藥等,且可能在正常劑量使用下引起藥物性肝損傷[1],嚴重的可導致急性肝衰竭甚至需要肝移植[2],因此藥物性肝損傷也逐漸引起全球公共衛生系統關注并成為加重肝病醫療系統經濟負擔的因素之一[3]。對乙酰氨基酚(Acetaminophen, APAP)是引起藥物性肝損傷的主要病因之一,也是導致急性肝衰竭的重要原因[4-5]。肝臟再生對肝損傷修復和預后極為關鍵,藥物性肝損傷后肝再生失敗可能會導致嚴重的后果[6-7]。Toll樣受體4(TLR4)是模式識別受體的一種,主要參與機體免疫和炎癥反應的調節[8],但Marlini等[9]研究發現,TLR4可能對肝臟修復和再生過程有影響。與野生型小鼠相比,C3H/HeJ小鼠(TLR4基因發生錯義突變而導致TLR4表達缺陷型小鼠[10])行部分肝臟切除術后肝臟重量恢復和肝細胞增殖所需時間明顯延長。TLR4是否在APAP引起的肝損傷過程肝臟再生中發揮作用,目前研究甚少。TAK-242是目前較常用的小分子TLR4抑制劑,可以特異性阻斷TLR4信號傳導[11]。因此,本研究利用TAK-242來初步探索TLR4在APAP肝損傷過程肝臟再生中的作用,以期為研究肝再生機制以及藥物性肝損傷治療提供新的見解。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 APAP(HY-66005)、TAK-242(HY-11109)購買于中國MedChemExpress公司;DMSO(D8371)購買于北京索萊寶科技有限公司;ALT檢測試劑盒(C009-2-1)購買于南京建成生物工程研究所;RT-PCR逆轉錄試劑盒(R-202)、SYBR Green染料(Q204)購買于新貝生物科技有限公司;Trizol(15596026)購買于美國Thermo Fisher Scientific公司;GAPDH抗體(TA-08)、免疫組化試劑盒(SP-9001)、DAB顯色試劑盒(ZLI-9018)購買于北京中杉金橋生物技術有限公司;4%多聚甲醛組織固定液(BL539A)購買于中國白鯊生物科技有限公司;PCNA抗體(2586)、Ki-67抗體(12202)、STAT3抗體(9139)和p-STAT3抗體(9145)購買于美國Cell Signaling Technology公司;Cyclin D1抗體(26939-1-AP)購買于武漢三鷹生物技術有限公司;WB超敏顯影液(K-12043-D10)購買于美國Advansta公司;引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 動物分組及造模 雄性CD-1(ICR)小鼠78只,6～8周齡,購買于維通利華實驗動物技術有限公司[生產許可證編號:SCXK(浙)2019-0001;使用許可證編號:SYXK(皖)2017-006]。采用隨機數字表法將小鼠分為9組:對照組(正常對照組、溶劑對照組、抑制劑對照組)每組6只,實驗組(APAP 24 h組、TAK-242+APAP 24 h組、APAP 48 h組、TAK-242+APAP 48 h組、APAP 72 h組、TAK-242+APAP 72 h組)每組10只。APAP溶液用生理鹽水配置,TAK-242溶液用0.5% DMSO配置。所有小鼠適應性喂養1周后再進行造模。給藥前所有小鼠禁食12 h。實驗組小鼠給予單劑量腹腔注射APAP(300 mg/kg),TAK-242在APAP注射前3 h以3 mg/kg劑量腹腔注射于相應組小鼠(劑量參照文獻[12-13])。正常對照組小鼠腹腔注射與APAP組等體積生理鹽水,抑制劑對照組小鼠注射與實驗組小鼠等體積TAK-242溶液,溶劑對照組小鼠注射與抑制劑對照組等體積的0.5% DMSO溶液。在注射APAP后24 h、48 h、72 h麻醉后處理小鼠,收集小鼠血液和肝臟并及時冷凍保存,以便進行后續實驗。

1.3 實驗方法

1.3.1 血清ALT檢測 將血液樣本在室溫下靜置2 h,3 000 r/min離心20 min,將血清轉移至另一EP管保存。按照ALT檢測試劑盒說明測定ALT水平。

1.3.2 肝臟組織病理觀察 使用4%多聚甲醛組織固定液對肝左葉進行固定,按照常規步驟進行脫水、浸蠟、包埋和切片。將肝組織切片進行HE染色,然后在顯微鏡下觀察組織損傷情況并進行拍照。

1.3.3 RT-PCR檢測mRNA水平 取40 mg肝組織放入玻璃研磨器中,同時加入1 mL Trizol,在冰上充分研磨,經過氯仿、異丙醇、75%乙醇萃取、沉淀和洗滌等步驟,提取總RNA。檢測RNA濃度后,按照逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄得到cDNA。以GAPDH為內參,使用RT-PCR方法檢測并以2-△△Ct法計算PCNA、Ki-67、Cyclin D1的mRNA水平。引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.3.4 Western blot檢測蛋白水平 在玻璃研磨器中加入70 mg肝臟組織及1 mL RIPA裂解液,充分研磨并經過離心后,得到總蛋白。利用BCA法測定蛋白濃度,加入上樣緩沖液后將蛋白放在加熱器上100 ℃加熱10 min使其變性。將蛋白樣品加入到SDS-PAGE凝膠樣品孔中進行電泳,結束后在冰上進行轉膜,將蛋白轉移至PVDF膜上。室溫下使用脫脂牛奶封閉2～3 h,TBST溶液清洗3次,一抗4 ℃孵育過夜(GAPDH,1∶1 000;STAT3,1∶1 000;p-STAT3,1∶2 000;PCNA,1∶1 000;Cyclin D1,1∶5 000)。第2天PVDF洗滌干凈后,二抗室溫孵育1 h。最后顯影,使用Image J進行灰度值分析。

1.3.5 免疫組化檢測 肝臟組織切片進行常規的烘烤、脫蠟、水化,使用檸檬酸鈉進行抗原修復,然后阻斷內源性過氧化物酶,經過封閉后,一抗(Ki-67,1∶300)4 ℃孵育過夜。第2天室溫下復溫30 min,洗滌后二抗孵育45 min。DAB顯色,最后使用中性樹膠封片并拍照。

2 結果

2.1 觀察抑制劑和溶劑對正常小鼠肝臟的影響 結果顯示,正常對照組、溶劑對照組和抑制劑對照組小鼠血清ALT水平差異無統計學意義(P>0.05)(圖1),且與正常對照組相比,溶劑對照組和抑制劑對照組小鼠的肝臟HE染色未發現明顯的病理改變(圖2)。

圖1 小鼠血清ALT水平比較

2.2 抑制TLR4可能延遲APAP誘導的肝損傷過程中肝臟的恢復 APAP 24 h組和APAP 48 h組血清ALT水平均明顯高于正常對照組(P值均<0.05),而TAK-242+APAP 24 h組及TAK-242+APAP 48 h組的ALT水平明顯高于同時間點APAP組(P值均<0.05);小鼠肝組織HE染色結果顯示,正常對照組小鼠肝小葉結構清晰,肝細胞排列整齊,APAP處理的小鼠肝臟可見典型的小葉中心性壞死。與相同時間點APAP組相比,TAK-242+APAP 24 h組和TAK-242+APAP 48 h組小鼠肝臟壞死面積明顯較大(P值均<0.05)(表2、3,圖3)。

注:a,正常對照組;b,溶劑對照組;c,抑制劑對照組。

2.3 抑制TLR4下調肝臟Cyclin D1、PCNA、Ki-67的mRNA水平和蛋白表達 APAP 48 h組和APAP72 h 組Cyclin D1、PCNA、Ki-67 mRNA水平均明顯高于正常對照組(P值均<0.05),APAP 24 h組PCNA mRNA水平顯著高于正常對照組(P<0.05);TAK-242+APAP 24 h組、TAK-242+APAP 48 h組和TAK-242+APAP 72 h組的Cyclin D1、PCNA mRNA水平均低于同時間點APAP組,TAK-242+APAP 24 h組和TAK-242+APAP 72 h組的Ki-67 mRNA水平均低于同時間點APAP組,差異均有統計學意義(P值均<0.05)(表4、5)。Western blot檢測Cyclin D1、PCNA蛋白表達結果顯示,TAK-242+APAP 24 h組和TAK-242+APAP 48 h組的Cyclin D1、PCNA蛋白表達明顯低于同時間點APAP組(P值均<0.05)(圖4)。免疫組化染色及Ki-67陽性細胞累積光密度值比較結果顯示,APAP 48 h組和APAP 72 h組Ki-67蛋白表達顯著高于正常對照組(P值均<0.05),而TAK-242+APAP 24 h組、TAK-242+APAP 48 h組及TAK-242+APAP 72 h組的Ki-67蛋白表達明顯低于同時間點APAP組(P值均<0.05)(圖5、6)。

表2 APAP對小鼠血清ALT及肝臟組織的影響

表3 抑制TLR4在各時間點對APAP肝損傷小鼠血清ALT及肝臟組織的影響

表4 APAP對小鼠肝組織Ki-67 mRNA、Cyclin D1 mRNA、PCNA mRNA表達的影響

注:a,正常對照組;b,APAP 24 h組;c,TAK-242+APAP 24 h組;d,APAP 48 h組;e,TAK-242+APAP 48 h組;f,APAP 72 h組;g,TAK-242+APAP 72 h組。

表5 抑制TLR4對小鼠肝組織Ki-67 mRNA、Cyclin D1 mRNA、PCNA mRNA表達的影響

注:a,Cyclin D1蛋白表達水平;b,PCNA蛋白表達水平。

圖6 各組Ki-67陽性細胞累積光密度值比較

2.4 抑制TLR4下調p-STAT3水平 課題組前期體外研究[14]發現,STAT3在APAP肝損傷后肝細胞再生過程中發揮重要作用,為探索TLR4參與肝臟再生過程是否與STAT3有關,應用Western blot方法檢測STAT3蛋白磷酸化(p-STAT3)水平。結果顯示,APAP 24 h組和APAP 48 h組p-STAT3水平均顯著高于正常對照組(P值均<0.01),而TAK-242+APAP 24 h組及TAK-242+APAP 48 h組p-STAT3水平均明顯低于同時間點APAP組(P值均<0.05)(圖7)。

圖7 肝組織STAT3磷酸化蛋白的表達

3 討論

肝臟是具有極強再生能力的器官,也是唯一能夠在被部分/大部分切除后恢復原有重量的內臟器官[15]。據報道[16],存在肝臟炎癥和肝細胞壞死的肝臟疾病都可能發生肝再生,包括藥物性肝損傷。N-乙酰半胱氨酸(NAC)是最常用于治療藥物性肝損傷的藥物,特別是對于APAP肝損傷,治療效果較好。但是NAC的治療時間窗較短,對晚期發現的肝損傷治療效果較差,甚至長時間高劑量使用NAC會不利于APAP肝損傷恢復[17]。在毒性化學物引起的肝損傷中,肝損傷和再生是此消彼長的關系。一項急性肝損傷的動態研究[18]發現,在輕度急性肝損傷小鼠體內,肝損傷進展時,肝再生也在增強,當肝再生強于肝損傷,即開始進入恢復階段;而在重度肝損傷小鼠模型中,肝再生一開始即受到抑制,因肝再生速度不及損傷的速度,損傷加速進展,造成小鼠死亡。據報道[19-20],在APAP肝損傷中,明顯的肝再生發現在24 h以后,因此本研究選擇分別于24 h、48 h和72 h處死小鼠。

TLR4是一種跨膜多功能分子,可以與來自細胞內外的配體結合,在肝、腎、心、肺、皮膚等多個器官和組織中表達,參與炎癥反應、免疫調控和組織修復等過程[21]。有研究[22]報道,早期阻斷TLR4可以預防腎小管壞死和急性腎損傷,但是在愈合期阻斷TLR4會導致IL-22生成減少,從而損害腎再生。與野生型小鼠相比,TLR4敲除的小鼠對博來霉素引起的肺損傷更敏感,肺泡上皮損傷也更嚴重,Ⅱ型肺泡上皮細胞增殖數較少[23]。最近一項研究[24]發現,在行部分肝切除術小鼠體內,TLR4與脂多糖結合可以激活肝細胞轉化,促進肝再生。TLR4敲除小鼠行部分肝切除術后,細胞增殖指標Ki-67和PCNA的表達明顯受到抑制。本文利用TLR4特異性抑制劑TAK-242進行研究發現,與24 h和48 h的APAP組相比,使用抑制劑組處理的小鼠ALT水平和肝臟壞死面積恢復均較慢,這表明抑制TLR4可能會阻礙APAP肝損傷過程肝臟的修復。進一步檢測再生相關指標發現,在APAP誘導小鼠肝損傷中,抑制TLR4后小鼠肝臟的Cyclin D1、PCNA和Ki-67 mRNA及蛋白水平均下降,提示TLR4可能參與APAP肝損傷過程中肝再生,并對肝再生起到一定的促進作用。

STAT3是細胞增殖和組織再生過程的重要分子,在肝臟再生過程中發揮重要作用。在行部分肝切除術的小鼠體內,STAT3信號通路激活增加,肝細胞STAT3特異性敲除的小鼠肝臟再生會受到抑制[25-26]。此外,在四氯化碳誘導的肝損傷小鼠模型中發現,STAT3表達顯著增加,抑制STAT3后,肝臟增殖指標表達明顯降低[27]。在本研究過程中,筆者發現與正常對照組相比,APAP 24 h組和APAP 48 h組STAT3磷酸化水平明顯升高,但同時間點TAK-242+APAP組STAT3磷酸化水平降低,這提示p-STAT3可能參與了TLR4在APAP肝損傷中促進肝臟再生的過程。

肝臟再生的機制比較復雜,涉及的分子及通路眾多。本研究僅對TLR4在APAP肝損傷過程肝再生中的作用進行了初步探討,更深層的機制有待課題組后期進一步研究。

綜上所述,TLR4可能通過STAT3信號通路對APAP誘導的小鼠肝損傷過程中的肝臟再生起到一定的促進作用。

倫理學聲明：本研究方案于2018年3月經由安徽醫科大學實驗動物倫理委員會審批,批號:LLSC20180080,符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：陳明月負責分析數據,撰寫論文和參與課題設計;鄭秀良、喬亞琴、沈海濤參與實驗操作和修改論文;路燕負責課題設計和修改論文。