齊墩果酸衍生物DKS26對非酒精性脂肪肝病模型小鼠肝組織Fndc5表達的影響*

韓蕭蕭,李晨馳,劉冉陽,唐爽,馮琳琳,韓冰,謝汝佳,楊勤,***

(1.貴州醫科大學 基礎醫學院 病理生理學教研室,貴州 貴陽 550025;2.貴州省常見慢性疾病發病機制及藥物研究重點實驗室,貴州 貴陽 550025;3.貴州醫科大學 醫學檢驗學院 臨床微生物免疫教研室,貴州 貴陽 550025)

非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty live diseaser,NAFLD)是指在沒有大量飲酒的情況下、以廣泛的肝細胞內脂質顯著沉積與持續的肝臟酶異常為特征的一種臨床綜合征[1],歐美地區NAFLD的發病率在20%以上,我國NAFLD發病率約為15%[2-3]。Ⅲ型纖連蛋白組件包含蛋白(type Ⅲ domain-containing protein 5,Fndc5)是由2個纖維蛋白結構域、1個信號肽和1個嵌入細胞膜的C末端疏水結構域構成,其在細胞膜上水解為鳶尾素(irisin)[4]。irisin作為一種新發現的可分泌性代謝調控因子[5],主要在骨骼肌和脂肪組織中表達,少量表達于腎臟、肝臟、胰腺及肺中[6-7]。irisin是促進白色脂肪轉變為棕色脂肪的重要調節因子,具有調節細胞脂肪氧化的能力和抑制白色脂肪沉積的作用,還可抑制肝臟糖異生[8]。研究認為,采用腺苷5′-氨酸磷酸活化蛋白激酶(adenosine 5′-momophosphate-activated protein kinase,AMPK)激動劑干預敲除Fndc5基因小鼠,發現缺失Fndc5基因小鼠的肝臟脂肪酸氧化功能受損狀況得到改善、甘油三脂含量下降,而采用過氧化物酶體增值激活受體ɑ(PPARα)激動劑可上調Fndc5基因缺失小鼠肝臟PPARα靶基因的表達,體外實驗亦證實此激動劑抑制棕櫚酸誘導的肝細胞脂質沉積[9]。齊墩果酸是一種被臨床用于治療急慢性肝炎的藥物,臨床應用過程中被發現具有不可避免的毒副作用,國內外學者開始研發齊墩果酸衍生物,到目前為止已有11種的齊墩果酸衍生物問世,DKS26是其中的一種。本實驗采用齊墩果酸衍生物DKS26作用于NAFLD模型小鼠,檢測小鼠肝臟Fndc5的表達,探究Fndc5是否可以作為NAFLD防治藥物的重要靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 4～5周齡C57/BL小鼠40只,體質量18～20 g,購自貴州醫科大學實驗動物中心,動物使用許可證NO 2000059。

1.1.2主要試劑與儀器 齊墩果酸衍生物DKS26(純度99%,結構式見圖1)由貴州醫科大學藥學院提供,四氯化碳(純度99%,100 mL)購自羅恩試劑公司,鹽酸二甲雙胍(melbine,MET,純度98%,5 g)購自北京索萊寶生物有限公司,丙氨酸氨基轉移酶 (ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)和甘油三脂(TG)試劑盒均購自南京建成生物有限公司,Fndc5Ⅰ抗購自Novus Biologicals Europe公司,兔抗β-肌動蛋白(β-actin)購自ABclone公司,油紅(Oil red)購自美國Sigma公司。垂直電泳儀購于北京六一生物有限公司,凝膠成像系統購于BIO-BAD公司,全波長酶標儀與高速冷凍離心機購于Thermo公司,冰凍切片機與石蠟切片機購于Leica Biosystems公司。

圖1 齊墩果酸衍生物DKS26結構式Fig.1 Chemical structure of oleanolic acid derivative DKS26

1.2 研究方法

1.2.1高脂飲食配方及DKS26配制 普通飼料添加10%豬油、2%膽固醇、0.2%丙基硫氧嘧啶、0.5%膽酸鈉。DKS26配制:稱取DKS26粉末500 mg溶于羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液1 L中,配置成濃度為0.5 g/L的混合溶液。鹽酸MET配制:稱取鹽酸MET粉末500 mg溶于 CMC-Na溶液1 L中,配置成濃度為0.5 g/L的混合溶液。

1.2.2分組與建模 將40只C57/BL小鼠采用隨機雙盲法分為對照組(CON組)、模型組(MOD組)、MET組與DKS26組,每組10只。按參考文獻[10-12]用40%四氯化碳皮下注射加高脂飲食喂養方法建立脂肪肝模型,除CON組外,其余3組小鼠高脂飲食喂養,皮下注射40%四氯化碳植物油、1次/3 d、共4次;共8周建立小鼠NAFLD模型。成模后,正常飲食喂養,MET組和DKS26組小鼠分別給予100 mg/(kg·d)的MET和DKS26灌胃,CON組和MOD組小鼠給予100mg/(kg·d)的CMC-Na灌胃,1次/d,共6周。

1.2.3血清ALT、AST及肝臟TG含量 末次干預后,小鼠禁食禁水12 h,眼球取血1～1.5 mL,室溫下靜置15 min,以3 000 r/min離心8 min,取血清,采用試劑盒檢測小鼠血清ALT、AST;取各小鼠右葉相同部位的肝組織,行TG含量檢測。

1.2.4肝組織學觀察 末次干預后,小鼠麻醉后處死,無菌條件下剖腹取肝臟,采集各小鼠肝右葉相同部位4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片、HE染色;另取肝右葉新鮮組織制作冰凍切片,進行油紅O染色后在鏡下觀察。

1.2.5肝組織Fndc5蛋白表達 取小鼠肝組織,加細胞裂解液制備組織勻漿,提取總蛋白、BCA法定量。12%SDA-PEGA蛋白凝膠分離,轉膜,脫脂牛奶封閉,加入兔Ⅰ抗[β-actin(1∶5 000)、Fndc5(1∶1 000)]置4 ℃孵育過夜。次日用TBST洗膜后加入羊抗兔Ⅱ抗(1∶5 000)室溫孵育1 h,TBST洗膜,ECL曝光顯示特異性條帶。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 小鼠肝臟中Fndc5蛋白表達

如圖2所示,與CON組比較,MOD組Fndc5小鼠肝臟蛋白表達下調(P<0.05),與MOD組比較,MET組與DKS26組小鼠肝臟蛋白表達上調(P<0.05),且DKS26組的Fndc5小鼠肝臟蛋白表達較MET組上調更為明顯(P<0.05)。

注:A為Fndc5蛋白條帶結果;B為Fndc5蛋白相對表達量結果;(1)與CON組比較,P<0.05;(2)與MOD組比較P<0.05;(3)與MET組比較,P<0.05。圖2 小鼠肝臟中Fndc5蛋白表達水平(Western blot)Fig.2 Expression level of Fndc5 protein in mice livers (Western blot)

2.2 小鼠肝臟外觀

CON組小鼠肝臟呈現紅色,無脂肪變性;MOD組小鼠肝臟相較于CON組體積變大,顏色變黃、質地變硬,肝臟表面黏膩不光滑,呈現脂肪變性;MET組與DKS26組小鼠肝臟與MOD組相比,體積變小、顏色變紅、表面光滑、無明顯脂肪變性。見圖3。

圖3 各組小鼠肝臟外觀Fig.3 Liver appearance of mice in each group

2.3 小鼠肝組織學變化

HE染色顯示MOD組小鼠肝細胞腫脹,胞核移至細胞邊緣,部分肝細胞內出現空泡變性及少量炎癥細胞;MET組和DKS26組肝小葉結構及肝細胞形態趨于正常,肝細胞輕微腫脹,空泡變性幾乎不可見,炎性細胞減少。見圖4。

注:紅色箭頭指示空泡變性。圖4 各組小鼠肝細胞結構(HE,×100)Fig.4 Liver cells structure of mice in each group (HE,×100)

2.4 小鼠肝細胞脂質沉積

MOD組肝細胞胞質中出現較多大小不一的橘紅色脂滴,MET組和DKS26組肝細胞胞質內橘紅色脂滴數量較MOD組明顯減少。見圖5。

注:紅色箭頭指示橘紅色脂滴。圖5 各組小鼠肝細胞脂質沉積(油紅O染色,×200)Fig.5 Lipid deposition in liver cells of mice in each group (oil red O staining,×200)

2.5 血清ALT、AST水平及肝臟TG含量

MOD組小鼠血清ALT、AST值明顯高于CON組(P<0.01),MET組和DKS26組ALT、AST值明顯低于MOD組(P<0.01),且DKS26組AST值明顯低于MET組(P<0.01);MOD組小鼠肝組織TG含量較CON組明顯增加(P<0.01),MET組和DKS26組小鼠肝組織TG含量較MOD組明顯下降(P<0.01),但MET組和DKS26組小鼠肝組織TG含量相比差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠血清ALT、AST水平及肝組織TG含量Tab.1 Serum ALT,AST levels and liver tissue TG content in each group of

3 討論

齊墩果酸是我國科研人員首次從青葉膽植物中提取出的一種五環三萜類化合物,之后發現多種植物與水果中均有齊墩果酸的存在,并已有多項研究證實其具有保肝降脂的作用,可用于NAFLD的治療[13-16]。但有研究發現,齊墩果酸具有生物利用度低及高劑量會導致肝損傷的缺點[17-18]。因此眾多學者為規避其缺點,研發了11種齊墩果酸衍生物[19]。DKS26是貴州醫科大學藥學院人工合成的一種齊墩果酸衍生物,具有保肝、降糖、抗炎及降脂等作用[20],但是具體降脂的作用機制尚不清楚。本實驗通過采用40%四氯化碳橄欖油混合溶液皮下注射加高脂飲食方法建立小鼠NAFLD模型,觀察DKS26干預后小鼠脂肪肝的改善情況。

Fndc5的水解產物irisin是一種由小鼠和人類運動誘導的肌肉因子/脂肪因子,它被認為誘導白色脂肪組織棕色化,其主要目的是增加產熱和能量消耗。irisin自從被發現以來,就用于多種代謝性疾病的治療,如肥胖癥、2型糖尿病、脂質代謝性和心血管疾病、非酒精性脂肪肝疾病、多囊卵巢綜合征和代謝型骨骼疾病等[21]。但它是否作為治療NAFLD的藥物靶點目前尚不明確。有研究表明,irisin具有調節細胞脂肪酸氧化能力和抑制白色脂肪組織沉積的作用[8]。PPARα是調控脂質代謝和脂肪酸氧化的關鍵轉錄因子[22],同時也是Fndc5/irisin的下游靶點。AMPK可以上調PPARα基因從而促進脂肪酸氧化。Tateya等[23]發現,敲除Fndc5基因小鼠肝臟正常喂養和禁食誘導的脂肪酸有關基因表達和AMPK活性明顯降低,然而AICAR(AMPK激動劑)可改善Fndc5基因缺失造成的肝臟脂肪酸氧化功能受損,并且可降低肝臟TG含量。Liu等[9]也發現,WY14643(PPARα激動劑)可以上調敲除Fndc5基因小鼠肝臟PPARα靶基因的表達,并且體外實驗也表明,此激動劑也可以降低棕櫚酸誘導的肝細胞脂質沉積[9]。以上皆提示Fndc5對脂肪酸氧化的起著重要的調控作用。因此本實驗采用Western blot法檢測各組小鼠肝組織Fndc5蛋白的表達,結果顯示,MOD組小鼠肝組織Fndc5蛋白表達明顯少于CON組,MET組與DKS26組小鼠肝組織Fndc5蛋白表達較MOD組上調,提示DKS26與MET可能通過調控Fndc5的蛋白表達來改善小鼠NAFLD。

各組小鼠取肝臟外觀上:MOD組小鼠肝臟顏色變黃、體積變大、脂肪變性,而CON組肝臟顏色為紅色、表面光滑、無脂肪變性,與MOD相比,MET組和DKS26組小鼠肝臟顏色變紅、體積變小。HE染色結果顯示CON組小鼠肝細胞結構正常、肝小葉排列整齊,MOD組小鼠肝細胞表現為空泡樣變性、匯管區炎性細胞浸潤、肝小葉結構紊亂,MET組與DKS26組相比于MOD組肝細胞空泡變性減輕、匯管區炎性細胞浸潤減輕、肝小葉結構接近正常。油紅O染色結果顯示CON組小鼠肝細胞未見明顯脂質沉積,MOD組小鼠肝細胞內可見明顯紅色脂滴顆粒,相較于MOD組,MET組和DKS26組小鼠肝細胞內紅色脂滴數目減少。小鼠肝組織TG含量結果提示:MOD與CON組相比明顯上升,MET組與DKS26組小鼠相較于MOD組小鼠明顯下降。而且,MET組與DKS26組干預處理后小鼠血清ALT、AST水平相較于MOD組明顯減少。以上結果均提示DKS26治療之后NAFLD小鼠的肝組織學形態、功能指標及肝脂肪沉積均有所改善。

綜上所述,齊墩果酸衍生物DKS26具有護肝作用,其機制之一可能是通過irisin前體Fndc5這一靶點來調控脂質氧化分解的。