納米藥物在肺癌免疫治療中的研究進展

張輝標,唐東方,高文

復旦大學附屬華東醫院胸外科,上海 200040

肺癌是全球發病率和死亡率最高的惡性腫瘤,同時也是老年人最好發的惡性腫瘤之一,每年導致近百萬人死亡,其5年生存率小于20%[1-3]。不同階段和病理類型的肺癌需要不同的治療策略,目前手術、化療和放療仍是首選的一線治療策略[4-6]。然而,手術和放射治療都是局部治療方法,主要針對原發病灶和局部浸潤;而化療的全身毒性和耐藥性是其無法避免的問題,同時這些傳統療法對于老年患者的生存質量影響較大[7-8]。此外,一些針對肺癌的小分子藥物也存在一定的缺陷,如血漿濃度峰值持續時間短、藥物的靶向性差等,導致其臨床應用的受限。

免疫療法為惡性腫瘤治療帶來了革命性的變化,已經在一些腫瘤(如黑色素瘤、肺癌等)患者的治療中顯現出了一定的療效。不過,值得注意的是,盡管一些免疫療法是部分特定患者群體(特別是部分老年患者)的一線用藥。但這些免疫藥物,如抗程序性細胞死亡蛋白 1(anti-PD-1)的總體反應率仍較低、并存在全身毒性等不良反應[9-10]。因此,如何提高腫瘤抗原呈遞率、如何提高腫瘤抗原呈遞、增強免疫應答、克服免疫抑制、降低免疫毒性程度成為開發免疫藥物的重點和難點。

納米技術為藥物開發、設計提供了巨大契機,同時也為肺癌治療提供了新思路。納米材料可通過增強滲透性和滯留性(EPR)效應有效提高腫瘤部位的藥物濃度,具有降低全身毒性和增加給藥劑量的功能[11-12]。此外,一些基于納米藥物的吸入治療也是一種極具代表性的肺癌治療模式[13]。吸入可將高劑量藥物直接輸送到肺部,減少全身分布和毒性,這類藥物或許會為一般情況較差的晚期/老年肺癌患者延長生存期、改善生存質量帶來一絲希望。目前,已經獲批上市的用于肺癌治療的納米藥物包有 Abraxane?(紫杉醇白蛋白納米粒子)和Genexol?(紫杉醇 PEG-PLGANP 制劑)[14-15]。納米醫學在肺癌免疫治療中的應用潛力也正不斷被發現。在此,本文重點簡述納米材料在肺癌免疫治療中的相關研究進展。

1 基于免疫檢查點抑制納米藥物

在肺癌等腫瘤的病理狀態下, PD-1、 CTLA-4、 LAG-3和TIM-3等幾種免疫檢查點分子會在T細胞上表達,這被認為是一類T細胞衰竭的標志。一般來說, T細胞激活分為兩步,首先是通過T細胞受體識別MHC呈遞的肽抗原,然后進一步通過抗原提呈細胞(antigen-presenting cells, APCs)的B7-1 (CD80)和B7-2 (CD86)連接T細胞的CD28。CTLA-4的結構與CD28相似,可以與CD80和 CD86相互作用,但與CD28相比具有更大的親和力。另一方面,表達在 T 細胞上的 PD-1 與表達在腫瘤細胞上的 PD-L1/L2 結合會導致 T 細胞發出抑制信號[16-17]。由于這些免疫檢查點活性上調,耗竭的 T 細胞在對抗入侵細胞時而功能失調。腫瘤利用這一缺陷,誘導免疫檢查點衍生的信號通路來抑制 T 細胞的抗腫瘤功能[18-20]。目前最受認可的基于免疫檢查點的免疫療法是使用免疫檢查點抑制劑(ICIs)。目前,免疫檢查點機制多集中于CTLA-4 和 PD-1,并進行了大量的研究和分析。這兩種機制以不同的方式在不同的水平上抑制 T 細胞的活化。然而,目前的ICIs的大量的臨床實驗以及臨床應用中仍存在一定的問題。例如, PD-1/PD-L1抗體由于結合或抑制效果不足而受到療效限制;在治療后,免疫檢查點分子表達不均勻,配體重新分布,導致總體應答率較低,僅為20%～40%[21]。因此,一些基于納米載體的ICIs也不斷被開發并嘗試在臨床應用,以克服現有ICIs的治療弊端,提高治療療效。

1.1改善ICIs藥物在腫瘤內攝取度目前的多數PD-1/L1免疫藥物通常缺乏靶向遞送能力,常常導致治療效果低,毒性嚴重。此外,肺癌的異質性和腫瘤微環境的復雜性阻礙了藥物在臨床中的廣泛應用。通過構建具有特異性和靶向功能的納米載藥體系,旨在減輕免疫反應的細胞工程技術,通過增強免疫藥物的靶向能力和血液濃度,來增強在癌癥免疫治療中的應用是一種有潛力的策略。生物仿生細胞膜包覆的數控材料因其配體識別性強、血液循環時間長、免疫避避能力強等特點成為藥物輸送系統的熱點[22]。各種合成納米材料(如聚乳酸共聚乙二醇、介孔二氧化硅、成像劑)與藥物和核酸等治療劑可被封裝在各種來源的細胞膜中[23]。由于細胞膜上存在的各種配體,這類細胞膜,如紅細胞膜、腫瘤細胞膜、免疫細胞膜等,具有內在一定的獨特性,如免疫原性和天然靶向性等。因此,基于細胞膜的納米藥物可能是提高藥物富集、增加療效的有效策略。

Yimin Zhu團隊[24]利用肺癌H460細胞膜包覆超順磁性氧化鐵納米顆粒(SPIO NPs),并將將TPP1肽偶聯到SPIO表面NP@M,制備SPIO NP@M。在TPP1和DSPEPEG之間插入金屬基質蛋白酶2 (Metallomatrix protease 2, MMP2)底物短肽(-PLGLLG-),可悲腫瘤內的MMP2識別并切斷,從而將TPP1肽從SPIO NP@M釋放到腫瘤微環境中。這種新型的PD-L1抑制肽遞送納米藥物能有效延長肽的半衰期(比單獨使用肽的半衰期長60倍),并能在體外和體內保持重新激活T細胞和抑制腫瘤生長的能力。這不僅證明了這類基于細胞膜的遞送系統具有低毒性、靶向釋放和體內循環壽命長的優點,從而顯示出作為腫瘤PD-L1免疫治療的優越納米平臺的潛力。

1.2緩解免疫藥物毒性磷酸激酶 1(Polo-like kinase 1, PLK1)是一種關鍵的有絲分裂激酶,研究表明PLK1的表達有助于免疫抑制性 TME,抑制免疫細胞浸潤和抗腫瘤免疫[25]。在 NSCLC 中, PLK1 的表達與免疫評分、主要組織相容性復合體(MHC)I 類活性和 TILs 的表達呈負相關。抑制 PLK1 可降低 STAT3 的磷酸化,從而抑制其在 NSCLC 細胞中的活性。此外, PLK1 抑制還可增加多種細胞系中 MHC-I 表達,表明其在適應性免疫中也具有一定作用[26]。目前已有幾種 PLK1 小分子抑制劑進入臨床試驗階段。然而,由于劑量限制性毒性和單藥療效不佳, PLK1 抑制劑的臨床應用尚未實現。

Moataz Reda等[27]報道了一種一種名為ARAC(抗原釋放劑和檢查點抑制劑)的納米免疫療法,用于聯合遞送PLK1 抑制劑(volasertib)和 PD-L1 抗體。ARAC 以聚合物包覆介孔二氧化硅納米粒子作為納米載體。在侵襲性轉移性肺腫瘤模型中, ARAC遞送PLK1抑制劑(volasertib)和PDL1抗體可以將有效藥物劑量減少5倍。這大大降低了每種藥物的毒性問題,同時實現了兩種藥物的治療協同作用。ARAC中通過抑制PLK1誘導癌細胞死亡,同時也上調存活癌細胞的 PD-L1表達;這使得肺癌對ARAC上PD-L1抗體阻斷PD-1/PDL1反應更靈敏。細胞通過內吞作用攝取 PD-L1結合的ARAC也會降低膜PD-L1的表達水平,使癌細胞進一步受到細胞毒性T細胞的攻擊。這項研究將通過構建新型的納米免疫藥物,將協同PLK1抑制劑和PD-L1抑制劑治療作為一種肺癌免疫潛在的治療選擇,并體現出了利用納米粒子平臺作為遞送載體可以在不增加毒性的情況下增強現有協同靶向藥物療法療效的優勢。

整合素β3(β3-int)在脊柱轉移的非小細胞肺癌(NSCLC-SM)中明顯上調[28]。其抑制劑RGDyK可促進PD-L1泛素化,提示RGDyK作為一種新型的PD-L1納米抑制劑和治療NSCLC-SM的靶向肽具有潛在的應用前景。Lei Zhou等[29]制備了一種RGDyK修飾和負載原卟啉鋅(ZnPP)的介孔硅納米顆粒(ZnPP@MSN-RGDyK)。ZnPP@MSN-RGDyK納米顆粒精確靶向β3-int并抑制PD-L1表達,同時可以通過除了通過光敏劑(如原卟啉鋅, ZnPP)產生活性氧(ROS) 直接殺死腫瘤細胞、促進腫瘤特異性抗原釋放,增加T細胞含量。在NSCLC-SM小鼠模型的治療結果顯示, ZnPP@MSN-RGDyK不僅可以提高光動力治療效率,同時可以降低免疫藥物用量的同時顯示出相當的免疫療效。

2 基于巨噬細胞(TAM)的納米藥物

巨噬細胞存在多種表型,一端是抗炎(M2)表型,另一端是促炎經典(M1)表型。TAMs主要是M2表型,它通過誘導免疫抑制、血管生成和轉移來幫助腫瘤發生[30-31]。在NSCLC中,高達70%的TAMs可能是M2巨噬細胞。多項研究表明, NSCLC組織中的M1巨噬細胞含量與患者的存活時間有關[32]。因此, TAMs從M2表型向M1表型的再極化有助于提高NSCLC治療藥物的抗腫瘤療效。

某些微小RNA(miR),如miR-125b,可將巨噬細胞重編程為抗腫瘤/炎癥(M1)表型。Mansoor M. Amiji教授團隊[33]使用了非免疫原性的,可生物降解的,非炎癥性的透明質酸(HA) 納米顆粒構建了miR-125b的遞送系統。其利用陽離子聚(甲基亞胺)(PEI)修飾了HA 骨架,以促進miR封裝到自組裝的HA-PEI納米顆粒中。腹腔注射后,這些HA-PEI自組裝納米顆粒可以迅速被腹膜巨噬細胞吸收。利用腹腔巨噬細胞向炎癥/損傷部位遷移的固有能力,腹腔注射HA-PEI 納米粒子后在KRAS/p53雙突變基因工程(KP-GEM)NSCLC小鼠的巨噬細胞損傷肺組織中聚集。此外,接受HA-PEI治療后的小鼠, TAMs 中巨噬細胞的M1與M2比率增加了6倍以上, iNOS(M1標記)/Arg-1(M2標記)比率增加了300倍。這些研究結果表明,經靜脈注射的巨噬細胞特異性HA-PEI納米顆粒可成功轉染小鼠模型肺組織中的TAMs。同時,這種TAM向M1表型的成功再極化對肺癌免疫療法具有重要意義。

3 基于TLR9的納米藥物

Toll樣受體(TLR)激動劑是一種能夠誘導先天性免疫反應和控制適應性免疫的免疫調節劑,在臨床開發的早期階段作為抗癌分子已經受到了研究者們的關注[34]。TLR9位于人B細胞、漿細胞樣樹突狀細胞(pDCs)、單核細胞、單核細胞源性巨噬細胞、肺泡巨噬細胞、中性粒細胞和自然殺傷細胞(NK)的內體中[35]。B類CpG (CpG-B)是一種有效的pDCs和B細胞激活劑,被廣泛用于抗癌治療[36-37]。其可以刺激樹突狀細胞,產生促炎細胞因子分泌、自然殺傷細胞活化和T細胞擴增等次生效應;在局部遞送至腫瘤時,具有良好的抗腫瘤作用[38]。

Jillian L. Perry教授團隊[39]利用PRINT(非潤濕模板中的顆粒復制)納米顆粒作為載體,通過氣管注入法將CpG輸送到小鼠肺部。在兩種非小細胞肺癌-344SQ(肺腺癌)和KAL-LN2E1(肺鱗狀癌)的小鼠原位轉移模型中,局部遞送到肺部的PRINT-CpG有效地促進了實質性的腫瘤消退,也限制了與可溶性CpG相關的全身毒性。此外,完全治愈小鼠可以抵抗腫瘤再次侵襲。此外,納米遞送結果顯示這里納米遞送體系可以提高CpG在肺部的滯留時間,肺部抗腫瘤細胞因子的升高時間延長,但血清中促炎細胞因子的水平沒有升高。這些結果表明, PRINT-CpG是一種有效的納米平臺,可用于局部治療肺癌,對全身性疾病具有輔助治療作用和較低的毒性,并且可能具有治療其他癌癥類型肺轉移的潛力。

4 基于病毒載體的納米藥物

一些基于病毒的載體也被用作納米技術工具用于癌癥的免疫治療[40]。例如, VIPER是一種病毒激發的內體釋放聚合物,由一個多陽離子片段組成,用于核酸縮聚,以及一個pH敏感片段,將膜裂解肽(蜂毒肽)暴露在酸性環境中,以促進內體逃逸。Olivia M. Merkel團隊[41]設計了一個腺病毒激發的聚合物系統(VIPER/siRNA)用于內體釋放,并將該納米顆粒與siRNA連接,將其傳遞給NCI-H1299 細胞, VIPER/siRNA 多聚物能在體內高效遞送 siRNA,從而在肺部產生強大的基因沉默效應(>75%的基因敲除率)。

5 納米疫苗

納米疫苗逐漸成為在腫瘤治療的研究熱點之一, 增強疫苗抗原和添加佐劑有助于淋巴系統和免疫細胞的傳遞療效[42]。更重要的是,肺是眾多惡性腫瘤的轉移好發部位,轉移性肺癌是腫瘤相關死亡的重要原因。目前對大多數原發性腫瘤的常規治療也會對免疫人群產生不良的脫靶效應[43]。因此構建腫瘤疫苗以預防和/或減少肺轉移是一種潛在有前景的肺癌治療策略。例如,有學者提出針對轉移部位設計癌癥納米疫苗有機會防止轉移性肺癌的發展。

Michael Donkor等[44]構建了一種經鼻遞送的納米疫苗,是由工程化CpG包覆的腫瘤抗原(Tag)納米顆粒(NPs),可顯著減少肺外腫瘤靜脈轉移。對腫瘤細胞肺定植的保護作用與誘導局部黏膜相關效應細胞和常駐記憶T細胞以及增加細支氣管肺泡灌洗液IgA和血清IgG抗體反應有關。鼻腔納米疫苗誘導T細胞介導的抗腫瘤黏膜免疫反應被證明可以增加肺源性CD8+T細胞的腫瘤特異性IFN-γ和顆粒酶B的產生。這項研究結果顯示這種鼻納米疫苗有可能在腫瘤在肺部播種之前起到預防性的作用,從而防止現有的惡性腫瘤出現肺轉移。

6協同免疫治療

6.1協同化學治療二甲雙胍(MET),通常用于治療Ⅱ型糖尿病,最近被確定為一種潛在的抗癌藥物[45-46]。作為 “老藥新用”, MET通過激活單磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMPK)和抑制哺乳動物霉素靶標(mTOR)信號通路,抑制腫瘤細胞增殖和遷移,調節腫瘤免疫微環境,增加免疫細胞因子的產生,從而在化療免疫療法中發揮雙重抗腫瘤作用[47-48]。

Shuxian Cai等[49]開發了一種基于雙重治療藥物自組裝的無載體納米藥物,通過結合化療以增強抗腫瘤免疫治療療效。這個納米藥物由免疫佐劑二甲雙胍(Met)和抗癌劑羥基喜樹堿(SN38)通過氫鍵和靜電相互作用自組裝而成。MS NPs直接通過二甲雙胍降低PD-L1水平,達到免疫治療的目的。因此, MS納米粒子的化學免疫治療效果較其單一用藥明顯增強。MS納米粒子還可以通過重塑細胞外基質和恢復免疫監視功能,有效抑制腫瘤轉移。此外,接受MS納米粒子處理的小鼠主要器官未觀察到明顯的毒性,且小鼠的存活率很高。

類似的, Tong Yang等[50]開發了透明質酸-順鉑/聚苯乙烯-聚二甲雙胍(HA-CDDP/PMet)雙前藥共組裝納米顆粒,以精確的比例共遞送CDDP和MET用于肺癌的化學免疫治療。CDDP和MET的體外抗腫瘤效應提高了對Lewis肺癌細胞增殖抑制和凋亡誘導的協同作用。在體內,通過將HA-CDDP/PMet NPs與腫瘤細胞共培養, CDDP和MET在細胞內具有良好的裂解作用。這些納米顆粒在攜帶Lewis肺癌的小鼠體內表現出顯著的腫瘤富集和抑制腫瘤生長的作用,并顯著延長了動物的存活時間,同時具有無腎毒性、游離藥物和同源藥物過量的缺陷。此外,有趣的是,在HA-CDDP/PMet NPs中, MET和CDDP的協同作用導致上調裂解聚(ADP)核糖聚合酶(PARP)蛋白以誘導腫瘤細胞凋亡,并下調切除修復交叉補體組1(ERCC1)蛋白水平以降低對CDDP的耐藥性。HA-CDDP/PMet NPs中MET和CDDP的協同作用還能誘導單磷酸腺苷(AMP)激活蛋白激酶-α(AMPK-α)通路,抑制雷帕霉素哺乳動物靶標(mTOR)、最終發揮化療作用,并通過增加 CD4+ 和 CD8+ T 細胞、同時減少調節性 T(Treg)細胞以及增加細胞因子 IFN-γ 和 TNF-α 的表達來調節能動的免疫治療功能。因此,由這種協同化療/免疫治療的納米藥物體系可能會為肺癌免疫藥物的開發以及免疫治療提供一種新穎的思路和策略。

6.2協同放射治療放射治療(RT)目前已經在臨床中廣泛使用,但其在部分腫瘤治療中的療效仍然有限[51]。其中主要原因之一即,由于程序性死亡配體-1 (PD-L1)表達擴增,缺氧條件下DNA損傷減輕,可以導致免疫耐受[52]。然而,有研究顯示細胞內PD-L1表達抑制被證明可通過抑制DNA損傷修復而使RT更加敏感[53]。因此,構建良好的放射-免疫治療模式對于肺癌的治療具有良好的臨床應用前景。

Saijun Wang等[54]構建了一種TPP-LND納米顆粒,其通過將線粒體靶向的三苯基膦陽離子(TPP+)與抗腫瘤藥物lonidamine (LND)連接合成,可以顯著降低LND誘導有效氧化磷酸化抑制所需的劑量 (2 μMvs300 μM)。然后,用脂質體包裹TPP-LND形成TPP-LND@Lip納米顆粒。TPP-LND@Lip納米顆粒可以通過逆轉腫瘤的缺氧微環境來產生更多的DNA損傷,并通過增強腺苷5’-單磷酸活化蛋白激酶的激活來降低PD-L1的表達,從而使RT增敏。在肺癌小鼠模型中, TPP-LND@Lip介導的PD-L1下調和缺氧逆轉可有效致敏肺癌放療,實現有效的放療-免疫治療療效。

6.3多模態聯合治療鑒于納米載體的良好的修飾性、負載性等優勢,基于多模態聯合治療的納米體系在肺癌免疫治療中亦有開發[55-56]。

Xing Feng等[57]構建了一種多合一的納米藥物體系,由新型光熱劑、 Mn修飾的酞菁衍生物(MnⅢPC)、多西紫杉醇(DTX)和有效靶向分子透明質酸組成。該納米平臺可以通過MnⅢPC@DTX@PLGA@Mn2+@ HA(MDPMH)釋放Mn2+,并可能分別通過cGAS-STING 和化療激活腫瘤免疫。此外, DTX可以在殺滅腫瘤細胞的過程中釋放。結果顯示,這種納米藥物介導的光熱-化療-免疫的聯合療法在肺癌的體內外模型中均獲得了良好的腫瘤生長抑制的效果。

此外,Daxiang Cui教授團隊[58]構建新型納米平臺GNS@CaCO3/Ce6-NK的新型納米平臺。GNS表面的CaCO3在細胞富集過程中, GNS表面的CaCO3涂層顯示出突出的Ce6輸送和保護效果。制備的多功能GNS@CaCO3/Ce6-NK細胞不僅具有熒光成像和光聲成像的雙重功能,同時通過NK源性細胞外殼主動靶向腫瘤組織,實現光熱/光動力/免疫的三模態聯合治療。總而言之,這種新型的多模態納米平臺在體外和體內對A549肺癌細胞生長均具有良好的抑制效果。因此,通過結合納米載體的優勢,可以在一種納米藥物是實現多種治療方案,聯合多種治療模式的優勢,以實現更好的治療效果。這種“多合一”的納米藥物體系可能會為肺癌的免疫治療的發展提供一些新的啟示。

納米技術在免疫治療研發的早期就顯示出巨大的應用潛力和價值。納米粒子可將最佳劑量的免疫藥物、分子等輸送到靶區,并降低藥物的脫靶等副作用,這或將提高臨床免疫藥物的適用人群(如晚期或一般情況較差的老年患者);這些用途廣泛的納米平臺可以在形狀、大小、彈性、動力學、表面修飾和特異性靶向等方面進行改造,設計成為具有多種特性的納米載體;此外,一些新型智能化的納米粒子可與刺激響應性材料一起設計,實現在腫瘤特定微環境和特定時空下的免疫治療藥物釋放,實現可控制的免疫治療。

除了上述納米藥物的一些優勢和研究進展外,在納米藥物的肺癌免疫治療的研發方面仍具有一些可以改進的地方。(1)首先,應進一步優化納米粒子的參數,如負載率、藥代動力學、靶向特異性等。提高處于開發階段的納米免疫療法的治療效果,使其有在與傳統療法進行選擇時具有更大的優勢; (2)需要對設計的納米藥物進行機理、體外和體內深入研究,以確定對這種納米粒子介導的免疫反應在人體內如何隨時間演變,確定納米粒子在體內的尺寸變化,以及生物分布、毒性和安全性、納米載體及其攜帶分子的免疫原性,這些對于納米藥物的臨床應用、轉化具有重要意義; (3)要開發用于肺癌或者轉移性肺癌免疫治療的納米顆粒,必須對肺癌生物學、微環境以及癌細胞與納米顆粒之間的相互作用進行深入的探索和研究; (4)現階段的納米藥物多停留于細胞、動物實驗,制備過程較為苛刻、繁瑣,很難大規模生產應用。因此,需要以臨床應用為前提,鼓勵進行廣泛的臨床前實驗,重視開發具有高度可重復性特征的納米藥物,這對于未來的納米藥物臨床轉化、大規模生產具有重要的意義。