水飛薊素通過(guò)共同抑制TLR4/NF-κB和TNF-α/ROS/P38MAPK通路減輕糖尿病腎病大鼠腎臟損傷的研究〔1〕

陳祎,楊太旺,王明生

(1.九江市第一人民醫(yī)院,江西 九江 332000;2.九江市中醫(yī)醫(yī)院,江西 九江 332002)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病的常見(jiàn)并發(fā)癥,且伴隨著我國(guó)人口老齡化的加劇,糖尿病患者的日益增多,DN的發(fā)病率也逐年增加[1]。DN病理特征以腎小球?yàn)V過(guò)率增加、基底膜和系膜增厚以及晚期的腎小球硬化和腎小管纖維化為主,是終末期腎臟疾病的主要原因之一[2-4]。研究證實(shí)[5],持續(xù)的高血糖會(huì)導(dǎo)致活性氧簇的過(guò)度產(chǎn)生和炎癥介質(zhì)的激活,引起氧化應(yīng)激損傷,進(jìn)而導(dǎo)致糖尿病患者的血管和腎臟受損。目前,由于氧化應(yīng)激發(fā)生的相關(guān)通路復(fù)雜且靶點(diǎn)較多,所以DN發(fā)病的氧化應(yīng)激機(jī)制仍未闡明。天然黃酮木脂素類(lèi)化合物水飛薊素是從菊科藥用植物水飛薊中提取出來(lái)的一種生物活性的物質(zhì)。研究表明[6],水飛薊素具有抗炎、抗氧化、抗纖維化、抗病毒和抗腫瘤等作用。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)于藥用植物對(duì)腎臟的保護(hù)作用給予了更多關(guān)注。研究表明[7]水飛薊素對(duì)糖尿病和抗腎小管間質(zhì)纖維化和腎小球硬化也有預(yù)防和治療作用。本研究擬采用鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠動(dòng)物模型探討水飛薊素通過(guò)共同抑制Toll樣受體4/核因子-κB(TLR4/NF-κB)和腫瘤壞死因子/活性氧簇/p38絲裂原活化蛋白激酶(TNF-α/ROS/P38MAPK)通路減輕糖尿病腎病大鼠腎臟損傷的機(jī)制,為治療DN提供新思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

鏈脲佐菌素(美國(guó)Sigma公司)、檸檬酸鹽緩沖液(福建飛凈)、水飛薊素(上海安博)、磷酸鹽緩沖液(PBS)(HyClone公司)、AU640型全自動(dòng)生化分析儀(Ltd公司)、F6/10型勻漿機(jī)(上海凈信)、丙二醛(MDA)和總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒(南京建成)、引物(Sangon公司)。

1.2 STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型的建立及分組

健康SD大鼠50 只,雌雄各25 只,8～12 周齡,體質(zhì)量170～200 g。無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)環(huán)境,光照、室溫、濕度符合要求,自由飲水,進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)普通飼料,收集尿液檢測(cè)尿蛋白陰性,在九江學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng),動(dòng)物福利和實(shí)驗(yàn)程序均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理標(biāo)準(zhǔn)。

將50 只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為建模組40 只和對(duì)照組10 只。建模組大鼠在隔夜禁食后給予高脂飼料喂養(yǎng)4 周后,通過(guò)腹腔注射溶于0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 4.5)中新鮮制備的STZ(30 mg/kg)誘發(fā)糖尿病,對(duì)照組大鼠腹腔注射等量的檸檬酸鹽緩沖液。4 周后測(cè)24 h尿白蛋白排泄率>20 mg且尿糖陽(yáng)性提示糖尿病腎病建模成功。建模成功后將建模大鼠40 只按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、低劑量水飛薊素組、中劑量水飛薊素組及高劑量水飛薊素組,每組10 只,分別用0,100,300,900 μg/kg水飛薊素治療8 周。所有動(dòng)物均按照實(shí)驗(yàn)室指南進(jìn)行養(yǎng)殖。

1.3 生化分析

治療結(jié)束后24 h采集尾靜脈血,利用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定各組大鼠空腹血糖(FBG)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、胱抑素C(Cys-C)、β2微球蛋白(β2-MG)水平。收集24 h大鼠尿液,測(cè)定24 h尿蛋白(UTP)。

1.4 腎臟指數(shù)

腹腔注射麻醉,于冰上迅速摘取大鼠雙側(cè)腎臟組織,以預(yù)冷的PBS清洗干凈后,用濾紙吸干、稱重,計(jì)算腎臟指數(shù)。腎臟指數(shù)=雙腎重之和(mg)/體質(zhì)量(g)。

1.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定

根據(jù)重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例,稱取大鼠腎皮質(zhì)剪碎,放入勻漿機(jī),加入相應(yīng)量的生理鹽水或PBS,勻漿機(jī)30 HZ×1 min×3 次進(jìn)行勻漿后用高速離心機(jī)12 000 r/min離心10 min,取上清分裝,參照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定反映氧化應(yīng)激水平的MDA,T-AOC等氧化應(yīng)激指標(biāo)。

1.6 RT-PCR檢測(cè)信號(hào)通路相關(guān)mRNA

測(cè)定TLR4,NF-κB,TNF-α和P38MAPK等mRNA的表達(dá):Trizol法提取腎臟組織中RNA,應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)合成,按比例加入cDNA、引物和染料,95 ℃ 3 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s循環(huán)40 次擴(kuò)增,采用2-ΔΔCt方程計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量[7]。mRNA的數(shù)量用內(nèi)部參照標(biāo)準(zhǔn)化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 水飛薊素對(duì)各組大鼠體質(zhì)量及腎臟指數(shù)的影響

低、中、高水飛薊素組體質(zhì)量均低于對(duì)照組,均高于模型組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);低、中、高水飛薊素組腎臟指數(shù)均高于對(duì)照組,均低于模型組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 各組大鼠體質(zhì)量及腎臟指數(shù)比較

2.2 水飛薊素對(duì)各組大鼠血糖及腎臟功能的影響

模型組及低、中、高劑量水飛薊素組FBG,Hcy,Cys-C,β2-MG,24 h UTP水平均高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);模型組及低、中劑量水飛薊素組Scr,BUN水平均高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),高劑量水飛薊素組Scr,BUN水平均高于對(duì)照組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);低、中、高劑量水飛薊素組FBG,Scr,BUN,Hcy,Cys-C,β2-MG,24 h UTP水平均低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表2)。

表2 各組血糖及腎臟功能比較

2.3 水飛薊素對(duì)各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)影響

模型組及低、中、高劑量水飛薊素組MDA水平均高于對(duì)照組,T-AOC水平均低于對(duì)照組(P<0.05);低、中、高劑量水飛薊素組MDA水平均低于模型組(P<0.05),T-AOC水平均高于模型組(P<0.05)(見(jiàn)表3)。

表3 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較

2.4 水飛薊素對(duì)各組大鼠腎組織中mRNA表達(dá)水平的影響

模型組及低、中、高劑量水飛薊素組NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平均高于對(duì)照組(P<0.05);低、中、高劑量水飛薊素組NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平均低于模型組(P<0.05);模型組及低、中劑量水飛薊素組TLR4,TNF-α,P38MAPK mRNA表達(dá)水平均高于對(duì)照組(P<0.05),高劑量水飛薊素組TLR4,TNF-α,P38MAPK mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);低、中、高劑量水飛薊素組TLR4,TNF-α,P38MAPK mRNA表達(dá)水平均低于模型組(P<0.05)(見(jiàn)表4)。

表4 各組大鼠腎組織中mRNA的表達(dá)水平比較

3 討 論

腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、遺傳因素和炎癥是參與DN發(fā)展的重要原因。目前臨床治療手段主要為早中期采用控制飲食、降糖藥、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑和血管緊張素受體拮抗劑等藥物進(jìn)行治療,晚期治療方式為腎臟替代治療[8]。但目前的治療手段都不能改善終末期腎病患者的腎臟狀況,其生活質(zhì)量往往較差。水飛薊素是一種類(lèi)黃酮化合物,具有免疫調(diào)節(jié)、改善氧化應(yīng)激等作用。Sheela等[9]利用STZ和煙酰胺誘導(dǎo)制備了DN大鼠模型,接受水飛薊素治療大鼠的血糖、糖化血紅蛋白和尿白蛋白水平顯著降低,組織病理學(xué)評(píng)估顯示病理?yè)p傷減少。有研究表明[10],水飛薊素可以降低糖尿病腎病患者尿蛋白,改善腎臟損傷,是糖尿病腎病潛在的治療藥物。但有關(guān)水飛薊素對(duì)DN氧化應(yīng)激影響的作用機(jī)制研究較少。本研究采用STZ誘導(dǎo)糖尿病腎病大鼠動(dòng)物模型,將大鼠分為模型組、低劑量水飛薊素組、中劑量水飛薊素組及高劑量水飛薊素組,觀察水飛薊素對(duì)通過(guò)共同抑制TLR4/NF-κB和TNF-α/ROS/P38MAPK信號(hào)通路,減輕糖尿病腎病大鼠腎臟損傷的機(jī)制,以期為治療DN提供新思路。Scr,BUN是臨床評(píng)價(jià)腎功能損傷的常規(guī)指標(biāo)。近年來(lái)研究表明[11-12],Cys-C,β2-MG在腎小球?yàn)V過(guò)功能下降早期即可變化,是反映腎小球?yàn)V過(guò)率的理想指標(biāo)。張玉梅等[13]研究發(fā)現(xiàn),Hcy,Cys-C,β2-MG水平與DN的進(jìn)展密切相關(guān)。本研究中模型組大鼠Scr,BUN,Hcy,Cys-C,β2-MG,24 h UTP水平明顯高于對(duì)照組,不同劑量水飛薊素治療大鼠的Scr,BUN,Hcy,Cys-C,β2-MG,24 h UTP水平均低于模型組,并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性,表明水飛薊素可明顯減輕DN大鼠的腎臟損傷。TLR4/NF-κB通路是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵信號(hào)通路,TLR4能誘導(dǎo)NF-κB活性增加,NF-κB被激活后可刺激黏附分子和促炎因子的表達(dá),同時(shí)TNF-α可在DN中特異表達(dá),產(chǎn)生大量氧自由基,導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)受損[14]。過(guò)量的ROS導(dǎo)致的氧化應(yīng)激是DN發(fā)生的重要機(jī)制[15]。P38MAPK也可影響DN的進(jìn)展[16]。本研究中,模型組大鼠TLR4,NF-κB p65,TNF-α,P38MAPK mRNA表達(dá)及MDA水平明顯高于對(duì)照組,不同劑量水飛薊素組大鼠TLR4,NF-κB p65,TNF-α,P38MAPK mRNA表達(dá)及MDA水平均低于模型組,T-AOC水平高于模型組并呈一定程度的濃度依賴性,提示水飛薊素可調(diào)控TLR4/NF-κB和TNF-α/ROS/P38MAPK通路,可通過(guò)抑制其激活減輕氧化應(yīng)激,進(jìn)而減輕DN大鼠的腎臟損傷。

本研究的證據(jù)效力還存在一定不足,后續(xù)還需通過(guò)激活和抑制該通路進(jìn)行對(duì)照驗(yàn)證,進(jìn)而對(duì)水飛薊素治療DN的藥理機(jī)制進(jìn)行更全面明確的闡釋。