高溫干旱下縮節胺通過調節碳和氨基酸代謝提高Bt棉殺蟲蛋白含量的生理機制

邢羽桐，滕永康，吳天凡，劉媛媛，陳源，陳媛，陳德華，張祥

高溫干旱下縮節胺通過調節碳和氨基酸代謝提高棉殺蟲蛋白含量的生理機制

揚州大學農學院/江蘇省作物遺傳生理國家重點實驗室培育點，江蘇揚州 225009

【目的】探討高溫干旱脅迫下縮節胺（mepiquat chloride，DPC）調控（）棉殺蟲蛋白含量的生理機制，為高抗蟲性棉品種選育及高產高效栽培提供理論依據。【方法】2020—2021年以轉抗蟲基因抗蟲棉品種泗抗3號為材料，采用盆栽法，在人工氣候室進行高溫干旱脅迫，脅迫開始后立即用20 mg·L-1DPC和清水（對照）噴施。7 d后測定鈴殼殺蟲蛋白含量、α-酮戊二酸含量、丙酮酸含量以及谷氨酸合酶活性、谷氨酸草酰乙酸轉氨酶活性、可溶性蛋白含量、游離氨基酸含量。并進行轉錄組測序，利用DESeq進行差異基因分析，通過GO富集和KEGG Pathway數據庫注釋參與DPC調節殺蟲蛋白含量的差異表達基因。【結果】與清水對照相比，DPC可顯著提高高溫干旱條件下棉鈴殼中殺蟲蛋白含量，提高幅度達4.7%—11.9%。在碳代謝方面，α-酮戊二酸含量、丙酮酸含量提高46%—57%和25%—29%；在氨基酸代謝方面，谷氨酸合酶活性、谷氨酸草酰乙酸轉氨酶活性、可溶性蛋白含量、游離氨基酸含量分別提高32%—44%、30%—40%、28%和22%—27%。轉錄組分析結果表明，DPC處理后上調基因7 542條，下調基因10 449條。GO和KEGG結果顯示，差異基因主要涉及氨基酸代謝、碳代謝等生物過程。其中編碼6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶、谷氨酸丙酮酸轉氨酶、丙酮酸脫氫酶、檸檬酸合酶、異檸檬酸脫氫酶和α-酮戊二酸脫氫酶、谷氨酸合酶、吡咯啉-5-羧酸脫氫酶、谷氨酸草酰乙酸轉氨酶、N-乙酰谷氨酸合成酶、乙酰鳥氨酸脫乙酰酶基因表達顯著上調。【結論】高溫干旱下，DPC通過調節碳、氨基酸代謝增加丙氨酸、α-酮戊二酸含量，提高天冬氨酸、谷氨酸、丙酮酸和精氨酸合成能力，進而提高棉殺蟲蛋白含量。

棉；縮節胺；殺蟲蛋白；氨基酸代謝；碳代謝

0 引言

【研究意義】轉（）基因棉花（棉）是一種將蘇云金芽孢桿菌中殺蟲蛋白基因，經過改造后轉入棉花體內，從而使棉株表達殺蟲蛋白，防治鱗翅目害蟲的一種棉花。并且殺蟲蛋白含量高低決定棉的抗蟲效果。因此，種植棉可減少棉田農藥的使用，產生良好的經濟效益和生態效益。【前人研究進展】研究人員發現在棉生長過程中植株各器官尤其是生殖器官殺蟲蛋白表達易受外部不良環境的影響，從而降低了其應用效果。在全球棉花主產國，棉花花鈴期常出現極端高溫與土壤干旱現象，造成棉殺蟲蛋白含量下降和抗蟲性顯著下降。如夏蘭芹等[1]發現高溫可導致棉殺蟲蛋白含量急劇降低。CHEN等[2]和WANG等[3]則進一步明確37℃和38℃分別是導致葉片和棉蕾中殺蟲蛋白表達量顯著下降的臨界溫度。BENEDICT等[4]和SACHS等[5]發現當降水量較少時土壤含水量降低，土壤水分壓力會降低植株中殺蟲蛋白的含量。MARTINS等[6]和ROCHESTER[7]研究發現干旱脅迫導致棉葉殺蟲蛋白表達下降，并最終引起棉鈴蟲分布發生變化。在棉殺蟲蛋白表達調節方面，近年來有研究表明，噴施生長調節劑可提高棉殺蟲蛋白含量。董志強等[8]研究發現縮節胺（mepiquat chloride，DPC）能提高細胞膜的穩定性，增加植株抗逆性。鄭青松等[9]研究發現DPC有利于緩解鹽漬對棉苗生長的抑制。董志強等[8]則研究發現棉花專用生長調節劑B1P1S1（油菜素內酯、DPC、水楊酸各1份）能提高棉盛蕾期上部葉片、花鈴期下部葉片和果枝葉中殺蟲蛋白含量；ZHANG等[10]進一步證實了單施DPC亦可顯著調節殺蟲蛋白含量。但目前，DPC對高溫與干旱互作脅迫下棉殺蟲蛋白含量的影響及相關生理機制還未見系統報道。【本研究切入點】本文將以高溫干旱逆境下棉植株為材料，應用轉錄組分析技術和相關生理測定分析，來明晰DPC對逆境下殺蟲蛋白表達的調節效應及其機制。【擬解決的關鍵問題】利用轉錄組數據和相關生理數據，分析外源調節劑DPC對高溫干旱逆境下棉殺蟲蛋白表達的影響及其生理機制，從而獲得提升逆境下棉自身抗蟲性的調節技術，緩解逆境對抗蟲性的負面影響，進而減少棉田農藥用量。研究結果對于基因育種提高棉自身殺蟲蛋白穩定性具有重要意義，同時也可為生產上抗蟲棉的安全應用提供技術指導和理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

試驗于2020—2021年在揚州大學農學院試驗溫室進行。以生產上應用較廣的轉基因抗蟲棉常規品種泗抗3號（以下簡稱為SK-3）為材料。采用盆栽試驗，所用盆缽直徑40 cm，盆高50 cm，每盆裝25 kg過篩的砂壤土（取自大田試驗田）。采用育苗移栽方式種植，兩年均于4月6日播種，出苗41 d后，選擇長勢一致的壯苗移栽至盆缽中，每盆1株。其他生長管理措施按大田高產栽培要求進行。

盛花期（7月20日）控制澆水，并標記植株中部果枝內圍當日花。7月30日，在人工氣候室進行高溫干旱脅迫，其中白天（7：00—19：00）溫度設為38℃，夜間（19：00—7：00）設為28℃。土壤含水量為最大持水量的50%。于早晨、中午、傍晚使用WET土壤三參數速測儀監測土壤水分，用稱重法控制土壤水分，即當監測發現土壤水分低于設計值時，進行定量補水，達到預期水分指標。開始脅迫后立即用 20 mg·L-1DPC和清水（Water）噴施植株。持續脅迫7 d，脅迫結束后，取棉株相同部位棉鈴，帶回實驗室立即用無菌刀將棉花分為鈴殼、棉籽、纖維等三部分，分別液氮冷凍后在-80℃條件下保存，待測。

1.2 測定內容和方法

1.2.1 殺蟲蛋白含量 應用酶聯免疫法（ELISA）測定，試劑盒由中國農業大學提供。測定方法參見文獻[11]。

1.2.2 碳、氨基酸代謝相關物質含量 采用文獻[12]的方法測定谷氨酸合酶活性、谷氨酸草酰乙酸轉氨酶活性、可溶性蛋白含量、游離氨基酸含量。按照Hodges[13]的方法測定α-酮戊二酸的含量。按照Mustroph等[14]的方法測定丙酮酸含量。

1.2.3 鈴殼轉錄組測序

1.2.3.1 cDNA文庫的構建及轉錄組測序 處理7 d后取標記棉鈴鈴殼用于cDNA文庫構建和轉錄組測序。樣品cDNA由上海鹿明生物科技有限公司制備，然后進行轉錄組測序。所得原始數據經過濾得到有效數據，利用hisat2[15]比對到棉花基因組得到總映射和唯一映射。

1.2.3.2 差異基因的篩選、功能富集及聚類分析 使用DESeq[16]（2012）R package對數據進行標準化，并使用nbinom Test函數計算差異比較的值和fold change值，挑選出值小于0.05，差異倍數大于2的差異基因，并進行差異基因的GO基因本體（gene ontology）和KEGG[17]（kyoto encyclopedia of gene and genomes，京都基因與基因組百科全書）富集分析，以判定差異基因主要影響的生物學功能或者通路。同時對差異基因進行非監督層次聚類，利用熱圖的形式展示差異基因在不同樣本間的表達模式。

1.3 數據統計分析

采用Excel 2019進行數據處理和繪圖。應用SPSS20.0進行數據方差分析，采用Duncan’s多重比較法檢驗處理間的差異顯著性（＜0.05）。試驗數據為3次重復的均值，用平均值±標準誤表示。

2 結果

2.1 DPC對高溫干旱脅迫下Bt棉殺蟲蛋白含量影響

圖1表明，與清水（對照）相比，DPC可顯著提高高溫干旱條件下棉鈴殼中殺蟲蛋白含量，兩年提高幅度達4.7%和11.9%。

不同小寫字母表示處理間差異顯著（p＜0.05）

2.2 DPC對高溫干旱脅迫下Bt棉碳代謝、氨基酸代謝相關酶活性和物質含量影響

與清水（對照）相比，DPC可提高高溫干旱脅迫下棉鈴殼碳代謝、氨基酸代謝相關酶活性和物質含量（表1）。在碳代謝方面，DPC處理α-酮戊二酸含量、丙酮酸含量分別比清水處理高46%—57%和25%—29%；在氨基酸代謝方面，DPC處理谷氨酸合酶活性、谷氨酸草酰乙酸轉氨酶活性、可溶性蛋白含量、游離氨基酸含量分別提高32%—44%、30%—40%、28%和22%—27%。

2.3 DPC處理前后的轉錄組質量評估

由表2可知，在RNA序列中，過濾后得到的有效數據為48 769 270—53 204 746，Q30比例（錯誤率＜0.1%）在94.72%—95.25%，GC比例均大于43%，說明測序結果質量良好。測序結果與棉花基因組數據庫進行比對結果說明，97%以上的測序序列可以映射到基因組，并且唯一映射率達89%以上。

表1 DPC對高溫干旱脅迫下Bt棉碳、氨基酸代謝和可溶性蛋白含量影響

每列數據后不同小寫字母表示同一年份處理間差異顯著（＜0.05）

Different small letters after each column of data meant significant difference at＜0.05 level among treatments

表2 Bt棉轉錄組數據質量統計

2.4 DPC處理前后的Bt棉差異表達基因分析

以fold change（FC）≥2且value＜0.05為篩選標準，DPC和清水處理間差異表達基因數目達17 991條（圖2），其中與清水處理（對照）相比，DPC處理后上調基因7 542條，下調基因10 449條。說明DPC處理后棉鈴殼中多數基因表達受到了抑制。

2.5 DPC處理前后的Bt棉差異基因功能注釋和富集分析

對高溫干旱下DPC處理和清水處理差異基因進行基因本體GO功能分析，篩選GO分類的生物過程、細胞組分和分子功能中各值前10的主要基因功能信息見表3。

與清水對照相比，在生物過程分類下，DPC處理上調的差異表達基因主要富集到下列詞條：ATP水解耦合質子傳輸、三羧酸循環、對乙烯的反應、乙烯激活信號通路的負調控、亮氨酸分解代謝過程、脂肪酸β氧化、線粒體中電子傳遞（細胞色素c到氧）、鹽脅迫反應、糖酵解過程、氨基酸跨膜轉運。上述大多詞條與植株碳和氨基酸代謝密切相關。在細胞組成分類下，上調的差異表達基因主要富集在膜組成部分、高爾基體、內質網膜等。在分子功能分類下，質子轉運ATP酶活性，旋轉機制、細胞色素C氧化酶活性、氨基酸跨膜轉運蛋白活性、脂肪酰輔酶A結合、鈷離子結合、乙酰輔酶A C-酰基轉移酶活性、泛醌細胞色素C還原酶活性、烯醇輔酶A水合酶活性、蔗糖跨膜轉運蛋白活性等9個詞條與碳氮代謝關系密切。上述結果表明，DPC主要通過影響棉植株體內生物學過程來調控殺蟲蛋白表達，同時也涉及調控其分子功能來影響殺蟲蛋白含量，因此通過GO功能分類的富集途徑解釋DPC提高棉殺蟲蛋白含量的調控網絡具有較為積極的意義。

圖2 DPC和清水處理Bt棉鈴殼差異表達基因的火山圖

表3 高溫干旱下DPC處理 vs 清水處理鈴殼中差異表達基因的GO富集

2.6 DPC處理前后的Bt棉差異基因的KEGG生物通路分類及富集分析

在生物體內，不同的基因產物相互協調來行使生物學功能，對差異表達基因的通路（pathway）注釋分析有助于了解棉殺蟲蛋白合成所涉及的途徑，從而進一步了解DPC提高高溫干旱逆境下棉殺蟲蛋白含量的分子機理。對差異表達基因（7 765個）進行 KEGG功能注釋分析，發現它們被富集到194條代謝通路，本文挑選值較小的前20 條 pathway 條目在圖中進行展示（圖 3），分別屬于代謝（19條）和環境信息處理（1條）KEGG分支。而在代謝分支中，5條屬于氨基酸代謝，7條屬于碳代謝，3條屬于全局和總覽圖，2條脂質代謝，萜類和聚酮的代謝、能量代謝各1條。可見DPC主要是通過調節代謝分支，尤其是碳代謝和氨基酸代謝來調節殺蟲蛋白表達。

糖酵解是將葡萄糖降解為丙酮酸并伴隨著ATP生成的一系列反應，是生物體內普遍存在的葡萄糖降解的途徑。糖酵解的關鍵酶有3個，即己糖激酶、6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶，它們催化的反應基本上都是不可逆的[18]。圖4表明，DPC處理對棉植株糖酵解途徑有明顯的影響。編碼6-磷酸果糖激酶（6-phosphofructokinase）10個基因（GH_A02G1558、GH_A05G1771、GH_A06G0746、GH_A07G0253、GH_A07G0497、GH_D03G0426、GH_D05G0280、GH_D05G1804、GH_D06G0723、GH_D07G0262）表達全部顯著上調，其中GH_A07G0253、GH_D07G0262 log2FC 分別達62.94和29.83；編碼丙酮酸激酶（pyruvate kinase）10個基因，其中6個（GH_A03G0315、GH_A08G0889、GH_A09G1595、GH_A10G2189、GH_D03G1659、GH_D09G1539）基因表達顯著上調，4個基因表達顯著下調，但上調基因數量和上調幅度均大于下調基因。綜上，DPC處理后可加速糖酵解途徑的運行速率，利于丙酮酸的形成，并且主要是通過上調6-磷酸果糖激酶表達實現。

氣泡顏色代表p值大小，p值越小代表富集結果越顯著。氣泡大小代表差異表達基因的數目，氣泡大代表差異基因數目多，氣泡小代表差異基因數目少

方格中紅色代表差異上調基因；深綠色代表差異下調基因；黃色代表同一個基因不同轉錄本，既有差異上調也有差異下調基因；淺綠色或紫色代表物種特有基因，非差異顯著性基因；白色代表該物種沒有的基因或未檢測到的基因。下同

檸檬酸循環（三羧酸循環）是需氧生物體內普遍存在的代謝途徑，不但為機體提供能量，同時檸檬酸循環是三大營養物質的共同氧化途徑：乙酰CoA，不但是糖氧化分解的產物，也是脂肪酸和氨基酸代謝的產物。此外，檸檬酸循環是三大物質代謝聯系的樞紐：糖有氧氧化過程中產生的α-酮戊二酸、丙酮酸和草酰乙酸等與氨結合可轉變成相應的氨基酸；這些氨基酸脫去氨基又可轉變成相應的酮酸而進入糖的有氧氧化途徑。同時脂類物質分解代謝產生的甘油、脂肪酸代謝產生的乙酰CoA也可進入糖的有氧氧化途徑進行代謝。

糖酵解的產物丙酮酸，在有氧條件下進入線粒體，開始檸檬酸循環，形成水和二氧化碳并釋放能量。檸檬酸共有10步反應，其中檸檬酸合酶（citrate synthase）是檸檬酸循環的限速酶。異檸檬酸脫氫酶、α-酮戊二酸脫氫酶系是另外兩種關鍵酶。DPC總體上提高了所有步驟的反應速率（圖5）。其中編碼丙酮酸脫氫酶E1α亞單位（pyruvate dehydrogenase E1 component alpha subunit）共7個基因，其中6個表達上調，編碼丙酮酸脫氫酶E1β亞單位（pyruvate dehydrogenase E1 component beta subunit）共5個基因，其中4個表達上調；編碼丙酮酸脫氫酶E2共4個基因，表達全部上調。說明DPC可以加快催化丙酮酸向乙酰輔酶A轉變，增加了進入檸檬酸循環的底物乙酰輔酶A的可獲得性。

編碼檸檬酸合酶（GH_A05G1609、GH_A11G0627、GH_D05G1636、GH_D11G0654）的基因顯著上調表達；編碼異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase）4個基因中3個顯著上調表達；編碼α-酮戊二酸脫氫酶（2-oxoglutarate dehydrogenase）（GH_A05G3704）基因顯著上調表達。綜上，DPC提高了高溫干旱逆境下棉檸檬酸循環反應速率。

圖5 高溫干旱下DPC處理對鈴殼中檸檬酸（三羧酸）循環通路（ko00020）的影響

檸檬酸循環的中間產物丙酮酸、α-酮戊二酸、草酰乙酸也是合成氨基酸的原料。而谷氨酸在氮素合成代謝中起關鍵作用，同時也是其他氨基酸的氨基主要供體。谷氨酸合酶（glutamate synthase）可催化谷氨酰胺和α-酮戊二酸形成谷氨酸（Glu）。圖6可見，編碼谷氨酸合酶基因2個（GH_A12G2700、GH_D12G2727）顯著上調，1個（GH_D08G1115）下調；編碼谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase）基因6個顯著下調2個顯著上調，但下調幅度顯著高于上調幅度。說明DPC處理促進谷氨酸的形成，并抑制其向谷氨酰胺的轉化。此外，高等植物體內脯氨酸首先可以被脯氨酸脫氫酶（PDH）氧化成吡咯啉-5-羧酸（P5C），后者在吡咯啉-5-羧酸脫氫酶的作用下也可生成谷氨酸。而本文中編碼吡咯啉-5-羧酸脫氫酶（GH_A03G0786、GH_D03G1048）基因顯著上調。綜上，DPC處理有利于谷氨酸的積累。

圖6 高溫干旱下DPC處理對鈴殼中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路（ko00250）的影響

谷氨酸草酰乙酸轉氨酶（GOT）在植物體內催化草酰乙酸合成天冬氨酸，且催化天冬氨酸與α-酮戊二酸間的氨基轉換反應，與蛋白質及氨基酸含量有關[19-20]。編碼谷氨酸草酰乙酸轉氨酶11個基因，其中9個（GH_A09G0041、GH_A10G1610、GH_D09G0044、GH_D10G1279、GH_D05G0584、GH_A06G0690、GH_A07G0277、GH_D06G0665、GH_D07G0289）基因顯著上調，如GH_A10G1610、GH_D10G1279 log2FC 分別達38.44和18.74，僅有2個（GH_A07G276、GH_D07G0288）基因顯著下調，上調基因無論是數量還是上調幅度均明顯高于下調基因。可見DPC處理可加快草酰乙酸向天冬氨酸的轉變，促進天冬氨酸合成。

由圖6可知，編碼谷氨酸丙酮酸轉氨酶（GPT）（GH_A10G0511、GH_D05G1444、GH_D10G0537）基因顯著上調表達，加快了丙酮酸向丙氨酸的轉化，這利于丙氨酸的積累。

在植物細胞核內，精氨酸的生物合成起始于L-谷氨酸乙酰化作用并涉及連續的8個酶的催化過程，其中第一個酶乙酰谷氨酸合成酶是精氨酸反饋抑制的靶點[21-22]。圖7表明，DPC上調了編碼N-乙酰谷氨酸合成酶（amino acid N-acetyltransferase，argAB）（GH_A10G0898、GH_D11G2171）基因表達量，其中GH_D11G2171 log2FC達21.30。此外，編碼乙酰鳥氨酸脫乙酰酶（acetylornithine deacetylase，argE）（GH_A03G0060、GH_D03G1904）基因也顯著上調，這利于鳥氨酸的形成從而也進一步為精氨酸合成提供前體。可見DPC可促進了精氨酸的合成。

圖7 高溫干旱下DPC處理對鈴殼中精氨酶合成通路（ko00220）的影響

3 討論

3.1 DPC可提高高溫干旱脅迫下Bt棉殺蟲蛋白含量

前人研究表明，高溫干旱可顯著抑制棉殺蟲蛋白合成，導致其含量下降。而縮節胺可調節作物碳、氮代謝，且能提高細胞膜的穩定性，增加植株抗逆性[23]。本研究發現，在晝夜38℃/28℃、土壤含水量為最大持水量的50%脅迫條件下，噴施20 mg·L-1DPC可顯著提高棉鈴殼中殺蟲蛋白含量，這與前人研究結果基本一致[8,10]。此外，結合筆者前期研究結果[24]，本文發現高溫干旱逆境下DPC處理后棉鈴殼中殺蟲蛋白含量絕對值與正常溫度和土壤水分條件下的含量基本相似，說明施用外源調節劑可以降低甚至抵消本文逆境環境條件對棉抗蟲性的負面影響。因此，在大田生產中，若遇高溫干旱天氣可采用噴施DPC的方法提高棉自身抗蟲性，從而減少農藥使用，提高棉花生產經濟效益和生態效益。

3.2 高溫干旱脅迫下Bt棉響應DPC處理的轉錄組水平差異

植物根系吸收硝態氮（NO3-），通過硝酸還原酶和亞硝酸還原酶將NO3-還原成NH3，再經谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶同化為谷氨酸，后者與來自碳代謝中間物的各種碳骨架（α-酮戊二酸、草酰乙酸）之間轉氨形成各種氨基酸。而蛋白質生物合成即把mRNA分子中堿基排列順序轉變為蛋白質或多肽鏈中的氨基酸排列順序的過程[25-26]。本文認為基因作為一種外源基因，其翻譯表達的殺蟲蛋白合成也應依托棉花自身原有的代謝體系，可能并不涉及特有的酶。

本文采用RNA-seq技術對DPC處理后的棉基因表達譜進行比較發現，差異表達基因（7 765個）被富集到194 條代謝通路，其中值較小的前20 條 pathway 條目（圖3）主要屬于代謝KEGG分支（19條）。進一步分析發現在上述代謝分支中，5條屬于氨基酸代謝，7條屬于碳代謝，3條屬于全局和總覽圖，2條脂質代謝，萜類和聚酮的代謝、能量代謝各1條。因此，本文認為DPC主要是通過調節代謝分支，尤其是碳代謝和氨基酸代謝來調節殺蟲蛋白表達。這也驗證了前人關于棉碳氮代謝能力與殺蟲蛋白含量密切相關的結論[27]。這可能是由于外源基因的高效表達，必然影響宿主的生長和代謝，合理地調節宿主細胞的代謝負荷與外源基因高效表達的關系，是提高外源基因表達水平不可缺少的一個環節。本文中高溫干旱脅迫使得棉細胞代謝損傷，必然影響外源基因的表達，而DPC可以合理地調節棉細胞的代謝負荷，從而利于外源基因高效表達。

進一步分析發現，在糖酵解途徑中，DPC處理中6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶基因表達顯著上調，加速了糖酵解途徑的運行速率，利于丙酮酸的形成（圖4）。隨后谷氨酸丙酮酸轉氨酶基因也顯著上調表達（圖6），這加快了丙酮酸向丙氨酸的轉化，最終利于丙氨酸的積累。

此外，糖酵解的產物丙酮酸，在有氧條件下可進入線粒體，經丙酮酸脫氫酶作用轉變為乙酰輔酶A從而進入檸檬酸循環（圖5）。其中檸檬酸合酶（citrate synthase）是檸檬酸循環的限速酶，異檸檬酸脫氫酶、α-酮戊二酸脫氫酶系是另外2種關鍵酶。DPC處理下編碼丙酮酸脫氫酶基因總體表達上調，催化丙酮酸向乙酰輔酶A轉變加快，進入檸檬酸循環的底物乙酰輔酶A的可獲得性增加。同時編碼檸檬酸合酶、異檸檬酸脫氫酶和α-酮戊二酸脫氫酶基因顯著上調表達。綜上，DPC提高了高溫干旱逆境下棉檸檬酸循環反應速率，利于α-酮戊二酸（表1）、草酰乙酸的積累，這為后期天冬氨酸和谷氨酸合成提供了充足的底物。

谷氨酸合酶是催化谷氨酰胺的酰胺上氨基轉移到α-酮戊二酸的酮基上，生成谷氨酸的氧化還原酶，而谷氨酰胺合成酶主要是催化依賴ATP的谷氨酰胺合成。本研究發現編碼谷氨酸合酶基因（GH_A12G2700、GH_D12G2727）和吡咯啉-5-羧酸脫氫酶（GH_A03G0786、GH_D03G1048）基因總體上也顯著上調，這與谷氨酸合酶活性顯著提高（表1）結果相一致，但編碼谷氨酰胺合成酶基因顯著下調。說明DPC處理不僅促進高溫干旱逆境下棉鈴殼中谷氨酸的形成，同時抑制其向谷氨酰胺的轉化，兩者共同促進了谷氨酸的積累。這與前人發現的谷氨酸合酶對殺蟲蛋白合成起主要作用結果相一致[28]。

谷氨酸草酰乙酸轉氨酶（GOT）是植物體內氮代謝合成的關鍵酶。DPC總體上促進GOT基因顯著上調（圖6），其中GH_A10G1610、GH_D10G1279 log2FC 分別達38.44和18.74，其活性顯著提高（表1）。說明DPC處理加快草酰乙酸向天冬氨酸的轉變，促進天冬氨酸合成。在精氨酸合成過程中，本研究發現DPC上調了精氨酸的生物合成過程中關鍵酶N-乙酰谷氨酸合成酶（argAB）基因表達量，其中GH_D11G2171 log2FC達21.30，以及編碼乙酰鳥氨酸脫乙酰酶（argE）基因表達量，這均利于精氨酸的合成。

綜上所述，DPC處理后顯著提高高溫干旱脅迫下棉碳代謝能力，這不僅為后期氨基酸的生物合成提供碳骨架，也為殺蟲蛋白的合成提供了充足的能量。同時，DPC利于丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸等的合成，這為后期殺蟲蛋白的合成提供充足底物。結合游離氨基酸含量增加結果（表1），本研究認為DPC處理總體而言提升了棉植物氨基酸合成能力。氨基酸是合成蛋白質的基本單位，其含量的多少和組分的比例影響蛋白質的合成效率[29]。殺蟲蛋白由18種共1 176個氨基酸及酰胺組成，其中天冬氨酸占氨基酸總數量比例最大（13.31%），其次為谷氨酸（11.98%）、精氨酸（7.65%）、亮氨酸（7.49%）、纈氨酸（7.32%）[30]。在本文DPC處理下，天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸表達量與殺蟲蛋白含量變化一致，但亮氨酸、纈氨酸卻與之相反。這可能是由于殺蟲蛋白合成需要較多的天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸，它們比例的增加更加促進殺蟲蛋白的合成，這也解釋了前人噴施外源氨基酸可提高棉殺蟲蛋白含量的結果[31-32]。因此，生產中棉農可以通過采取噴施外源生長調節劑等措施，調節棉碳氮代謝強度來提高殺蟲蛋白含量。

4 結論

噴施20 mg·L-1DPC可顯著提高高溫干旱脅迫下棉鈴殼中殺蟲蛋白含量。其主要是通過提高糖酵解途徑、檸檬酸循環的運行速率，增加丙酮酸、α-酮戊二酸、草酰乙酸等含量。同時顯著上調編碼谷氨酸合酶基因、吡咯啉-5-羧酸脫氫酶基因，下調編碼谷氨酰胺合成酶基因以及上調谷氨酸草酰乙酸轉氨酶、N-乙酰谷氨酸合成酶等編碼基因，從而利于谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸積累。最終通過改變棉鈴殼中的氨基酸含量和比例來調節殺蟲蛋白合成。

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Mepiquat Chloride Increases theProtein Content Through Regulating Carbon and Amino Acid Metabolism ofCotton Under High Temperature and Drought Stress

Agricultural college, Yangzhou University/Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology of Jiangsu Province, Yangzhou 225009, Jiangsu

【Objective】The effects of mepiquat chloride (DPC) on the insecticidal protein contents in() cotton shell under high temperature and drought stress were investigated to provide a theoretical reference for thecotton breeding as well as high-yield and high-efficiency cotton cultivation.【Method】The study was undertaken on thecotton cultivar Sikang 3 during the 2020 and 2021 growing seasons at the Yangzhou University Farm, Yangzhou, China. The potted cotton plants were exposed to high temperature and drought stress, and 20 mg·L-1DPC and water (CK) were sprayed to cotton plants. Seven days after treatment, the insecticidal protein content, α-ketoglutarate content, pyruvic acid content, glutamate synthase activity, glutamic oxaloacetic transaminase activity, soluble protein content, free amino acid content in boll shell were analyzed, and the transcriptome sequencing was performed. DESeq was used for differential gene analysis. The GO and KEGG pathway databases were used to analyze the differentially expressed genes involved in regulating the insecticidal protein content through DPC.【Result】Compared with the water treatment (CK), the insecticidal protein contents under DPC treatment increased by 4.7%-11.9%. In terms of carbon metabolism, the contents of α-ketoglutarate and pyruvic acid were increased by 46%-57% and 25%-29%, respectively. In terms of amino acid metabolism, the activities of glutamate synthase and glutamic oxaloacetic transaminase, and the contents of soluble protein and free amino acid were increased by 32%-44%, 30%-40%, and 28%, 22%-27%, respectively. The transcriptome analysis revealed that there were 7 542 upregulation genes and 10 449 downregulation genes for DPC vs water. The GO and KEGG analysis showed that the differentially expressed genes were mainly involved in biological process such as amino acid metabolism and carbon metabolism. The genes coding 6-phosphofructokinase, pyruvate kinase, glutamic pyruvate transaminase, pyruvate dehydrogenase,citrate synthase, isocitrate dehydrogenase, 2-oxoglutarate dehydrogenase,glutamate synthase, 1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase, glutamic oxaloacetic transaminase, amino-acid N-acetyltransferase, and acetylornithine deacetylase were all significantly up-regulated.【Conclusion】 Under the stress of high temperature and drought, the DPC treatment increased the contents of α-ketoglutarate and pyruvic acid, and improved the synthesis ability of aspartic acid, glutamic acid, pyruvate and arginine, then enhanced the insecticidal protein contents in boll shell by regulating the carbon and amino acid metabolism.

cotton; mepiquat chloride; insecticidal protein; amino acid metabolism; carbon metabolism

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.08.004

2022-08-08；

2022-12-05

國家自然科學基金（31901462）、江蘇省高等學校自然科學基金（22KJA210005）、江蘇省自然科學基金（BK20191439）、江蘇省高校優勢學科建設工程、江蘇高校品牌專業建設工程（PPZY2015A060）

邢羽桐，E-mail：xingyt0601_yzu@163.com。通信作者張祥，E-mail：zhangxiang@yzu.edu.cn。通信作者陳德華，E-mail：cdh@yzu.edu.cn

（責任編輯 楊鑫浩，岳梅）