冬小包腳菇適栽原種配方的篩選※

●黃 靜 李 鵬 熊 雪 和耀威 向 準(zhǔn)

（貴州省生物研究所 貴州 貴陽(yáng) 550009）

冬小包腳菇（Volvariella brumalisHe sp?nav?）又稱低溫草菇、雞絲菌和谷樁菌，隸屬于擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes）、傘菌目（Agaricales）、光柄菇科（Pluteaceae），包腳菇屬（Volvariella）[1]，是何紹昌先生在1987 年發(fā)現(xiàn)的新種[2]。全國(guó)僅貴州有分布，也是目前包腳菇屬中唯一一個(gè)低溫出菇種類，出菇溫度4～15℃，一般發(fā)生于每年的11月至翌年4 月，多發(fā)現(xiàn)于水稻收割后換茬種植小麥、豌豆、蠶豆、馬鈴薯、油菜或混種作物的地里[3]。冬小包腳菇對(duì)低溫環(huán)境具有較強(qiáng)的抗性和耐寒性，填補(bǔ)了該屬可食用種類均為中高溫型的缺陷[4]，對(duì)彌補(bǔ)傳統(tǒng)草菇在地域、季節(jié)上的空缺具有重要意義[5-9]。該菇肉質(zhì)鮮美可口，含有豐富的氨基酸和稀有的礦物元素，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和科研價(jià)值[10-12]。近年來(lái)，由于野生冬小包腳菇為土生菌，多數(shù)子實(shí)體帶有細(xì)菌等微生物，菌絲萌發(fā)慢，導(dǎo)致菌種分離難度大，因此多研究在野外生境[3，12]、形態(tài)特征[13]、營(yíng)養(yǎng)成分[10]和菌種分離鑒定[14]等方面，在菌種生產(chǎn)和栽培上基礎(chǔ)薄弱，代麗華利用冬小包腳菇的生長(zhǎng)習(xí)性，在小麥、馬鈴薯等種植地里套種改善土壤結(jié)構(gòu)和提高土壤養(yǎng)分，促進(jìn)菌物和農(nóng)作物共同生長(zhǎng)，增加農(nóng)業(yè)生產(chǎn)附加值的仿生態(tài)栽培模式[15]。因此，本試驗(yàn)選擇了9 種主料以冬小包腳菇菌絲培養(yǎng)特征對(duì)其原種培養(yǎng)基進(jìn)行了篩選，旨在解決冬小包腳菇?jīng)]有適宜的原種配方、菌絲弱、吃料慢、制種繁瑣且周期長(zhǎng)、生物轉(zhuǎn)化率低等問(wèn)題，為冬小包腳菇生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌種的產(chǎn)業(yè)化、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和樣品供試冬小包腳菇菌株A4 為野生冬小包腳菇子實(shí)體分離而來(lái)，現(xiàn)保藏于貴州省生物研究所。

主料：稻草、棉籽殼、玉米芯、木屑、椰磚、麥粒、巨菌草、麥稈、玉米稈。

1.1.2 培養(yǎng)基活化培養(yǎng)基[14]：馬鈴薯（去皮）200 g，稻草40 g（剪成2～3 cm 的段，沸水30 min），蔗 糖10 g， 麥 麩10 g， 磷 酸 二 氫 鉀0?5 g，KH2PO40?5 g，MgSO4·7H2O 0?5 g，牛 肉 膏2 g，維生素B110 mg，瓊脂粉20 g，去離子水1000 mL，pH 8。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：麥麩10%，復(fù)合肥1%，石膏1%，石灰3%，含水量60%，pH 8～9。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化在無(wú)菌環(huán)境下將試管母種接種到PDA 培養(yǎng)皿上，活化A4 菌株30 個(gè)培養(yǎng)皿，15℃條件下暗光培養(yǎng)20 d 備用。

1.2.2 初篩培養(yǎng)基的制備分別稱取9 種主料，其他輔料成分不變，等量分裝于350 mL 的原種瓶（組培瓶）中，壓實(shí)，置于1×105Pa、121℃下高壓蒸汽滅菌120 min，冷卻至室溫備用。

1.2.3 接種培養(yǎng)將滅菌后的原種瓶置于無(wú)菌室冷卻至20℃以下接種。用8 mm 的打孔器沿菌落邊緣打圓片放置原種瓶中間，每瓶接種1 片，接種后于15℃下恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。每個(gè)原種配方處理18 瓶，分3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6 瓶?？刂婆囵B(yǎng)室二氧化碳濃度不超過(guò)3‰。觀察記錄菌絲長(zhǎng)勢(shì)、菌絲顏色。

1.2.4 菌絲生長(zhǎng)速率測(cè)定每5 d 測(cè)量并記錄冬小包腳菇菌絲生長(zhǎng)情況，菌絲長(zhǎng)勢(shì)用“+”號(hào)表示，“+”越多，表示菌絲長(zhǎng)勢(shì)越強(qiáng)、密度越大、均勻度越好。菌絲生長(zhǎng)速度計(jì)算公式：

菌絲豎面生長(zhǎng)速度=菌絲豎面高度/豎面滿瓶時(shí)間。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)利用SPSS 軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同主料對(duì)冬小包腳菇菌絲生長(zhǎng)的影響

不同主料冬小包腳菇菌絲生長(zhǎng)速度，見(jiàn)表1。

表1 不同主料冬小包腳菇菌絲生長(zhǎng)速度

由表1 可知，在9 種主料培養(yǎng)基上，冬小包腳菇菌絲都能很好的生長(zhǎng)，菌絲長(zhǎng)勢(shì)及菌絲生長(zhǎng)速率差異顯著（P＜0?05）。以木屑為主料時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速率最快，日均生長(zhǎng)速率為0?29 cm，平均35 d 長(zhǎng)滿瓶底，40 d 左右開(kāi)始有菌核形成，無(wú)色素分泌；以麥粒為主料時(shí)，菌絲發(fā)菌慢，日均生長(zhǎng)速率為0?21 cm，平均48 d 長(zhǎng)滿瓶底，有黃色色素分泌，無(wú)菌核形成，但菌絲長(zhǎng)勢(shì)最濃密、齊整，呈灰白色粗壯；稻草、玉米芯、麥稈、椰磚或玉米稈為主料時(shí)，菌絲長(zhǎng)速稍次之，菌絲發(fā)菌時(shí)間幾乎一致，日均生長(zhǎng)速率在0?24 cm 左右，平均40 d 長(zhǎng)滿，其中以稻草、玉米桿或椰磚為主料時(shí)，無(wú)色素分泌，玉米稈或麥稈為主料時(shí)，有色素分泌；棉籽殼或巨菌草為主料時(shí)，菌絲長(zhǎng)勢(shì)最次，均有色素分泌。

2.2 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

通過(guò)不同主料對(duì)冬小包腳菇菌絲生長(zhǎng)情況的分析，以應(yīng)用型廣泛、成本節(jié)約和透氣性等原則選擇菌絲長(zhǎng)速最優(yōu)和菌絲長(zhǎng)勢(shì)粗壯、濃密的木屑和麥粒兩種主料組合，作兩因素正交分析實(shí)驗(yàn)，設(shè)置4 個(gè)水平，共16 個(gè)組合（表2）。由表2 可知，不同組合配比對(duì)冬小包腳菇菌絲生長(zhǎng)速率存在顯著性差異（P＜0?05），且麥粒對(duì)冬小包腳菇的菌絲生長(zhǎng)沒(méi)有顯著性差異，木屑對(duì)冬小包腳菇的菌絲生長(zhǎng)是呈顯著性差異，因此決定菌絲生長(zhǎng)的主要因素是木屑（表3）。由此分析得出，適合冬小包腳菇菌絲培養(yǎng)的最佳配比組合為木屑、麥粒配比為70%和13%（按配方百分比折算為木屑、麥粒配比為79%和17%），菌絲生長(zhǎng)40 d 長(zhǎng)滿，且伴隨有菌核形成無(wú)色素的分泌。

表2 不同組合配比冬小包腳菇菌絲生長(zhǎng)速度

表3 冬小包腳菇正交試驗(yàn)方差分析表

3 討論與結(jié)論

通過(guò)木屑、玉米稈等9 種主料對(duì)冬小包腳菇菌絲生長(zhǎng)的試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著主料的不同，菌絲發(fā)菌時(shí)間不同，長(zhǎng)勢(shì)差異較大，長(zhǎng)滿時(shí)間、有無(wú)分泌色素、菌絲粗壯等不一致；添加木屑為主料時(shí)，菌絲發(fā)菌快，無(wú)色素分泌，菌絲發(fā)白粗壯齊整，日均生長(zhǎng)速率為0?29 cm，平均35 d 長(zhǎng)滿瓶底，40 d 左右開(kāi)始有菌核形成；添加麥粒為主料時(shí)，菌絲雖發(fā)菌時(shí)間慢，有黃色素分泌，但菌絲密集且粗壯，日均生長(zhǎng)速率為0?21 cm，平均48 d 長(zhǎng)滿瓶底；因此選擇木屑和麥粒，利用2 因素4 水平正交試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)16 個(gè)配比組合，經(jīng)驗(yàn)證分析，菌絲的長(zhǎng)勢(shì)與木屑比例呈顯著相關(guān)，與麥粒比例無(wú)顯著相關(guān)；隨著木屑比例過(guò)大，會(huì)導(dǎo)致菌絲生長(zhǎng)緩慢，菌絲纖細(xì)透明，菌核形成時(shí)間晚；麥粒比例過(guò)大時(shí)，培養(yǎng)基透氣性差，菌絲長(zhǎng)勢(shì)緩慢，有黃色素分泌且易老化形成厚菌皮致使后期不能快速長(zhǎng)滿瓶底等問(wèn)題。因此適當(dāng)添加木屑和麥粒時(shí)，可改善營(yíng)養(yǎng)和物理通透性，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)得到充分降解利用，促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)，也利于增強(qiáng)菌絲活性、縮短培養(yǎng)周期、促進(jìn)菌核形成，減少色素分泌和降低污染率、延長(zhǎng)菌種保藏期等[16-17]。結(jié)果得出木屑和麥粒的最優(yōu)配比為79%∶17%，再結(jié)合冬小包腳菇最佳碳氮比是30∶1[14]，最終確定冬小包腳菇最優(yōu)原種配方為木屑79%，麥粒17%，石灰3%，復(fù)合肥1%，含水量60%～65%，pH 8?0～9?0。該配方既可用于生產(chǎn)原種、栽培種，還可用于冬小包腳菇菌種保藏，不僅解決了傳統(tǒng)栽培菌種吃料慢、培養(yǎng)周期長(zhǎng)、制種繁瑣、易老化等問(wèn)題，還能為生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的的冬小包腳菇提供有力的保障，為冬小包腳菇良種繁育和示范推廣奠定基礎(chǔ)。