聚酮合酶基因島在肺炎克雷伯菌臨床分離株中的流行研究

陳艷淑, 羅陳爍, 楊濱

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)是臨床常見的革蘭氏陰性致病菌,易引起嚴重感染[1]。當前高毒力和高耐藥性的肺炎克雷伯菌均在世界范圍內流行。不同于普通肺炎克雷伯菌(classicKlebsiellapneumoniae,cKP),高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiellapneumoniae,hvKP)更易導致社區獲得性感染,引起肝膿腫、肺炎、腦膜炎等疾病[2-4]。近年來,以耐碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae,CRKP)為主的高耐藥性菌株比例也逐年上升[5],這些變化給臨床治療帶來極大的挑戰。而聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)基因島是編碼腸桿菌目毒素因子的重要基因,并與細菌的其他毒力因子存在聯系性[6]。PKS基因島編碼合成的基因毒素能夠誘導真核細胞 DNA 損傷斷裂[7]。研究[8]發現,感染PKS+肺炎克雷伯菌加劇患者淋巴細胞減少,并顯著增加患者的死亡率[9],同時在小鼠腦膜炎的發展過程中發揮毒性作用[10]。因此,PKS基因島與感染患者的病情進展存在關聯。目前關于PKS基因島在肺炎克雷伯菌中的研究主要集中在血流感染方面,對于PKS基因島臨床分布情況的分析相對較少。本研究收集臨床分離的肺炎克雷伯菌株,分析PKS基因島的臨床分布特征,探討PKS基因島對患者感染情況的影響,為臨床肺炎克雷伯菌感染的診療提供有效的實驗室依據。

1 材料與方法

1.1 材料 收集福建醫科大學附屬第一醫院(筆者醫院)2019—2021 年病原菌感染患者送檢的 234 株非重復肺炎克雷伯菌作為實驗菌株。根據基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorptionionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)鑒定結果判定為肺炎克雷伯菌,將其保存至細菌庫。查詢并記錄感染者的臨床資料。本研究獲得筆者醫院倫理委員會批準(倫理號:MTCA,ECFAH of FMU 〔2015〕 084-2)。

1.2 試劑與儀器 PCR 引物(福州尚亞生物技術有限公司);2×Taq PCR Master Mix(福州艾科瑞生物技術有限公司);4S GelRed 核酸染料[生工生物工程(上海)股份有限公司];DL2000 DNA Marker(福州艾科瑞生物技術有限公司);全自動快速生物質譜檢測系統(美國布魯克公司);全自動凝膠圖像系統(Tanon-1600R,上海天能科技有限公司);PCR 擴增儀[VeritiTM DX96well thermal,賽默飛世爾科技(中國)有限公司];數顯式穩壓穩流電泳儀(EPS-300,上海天能科技有限公司);全自動細菌鑒定與藥敏分析系統(Vitek-2 compact system,美國梅里埃公司)。

1.3 方法

1.3.1 菌落篩選、鑒定與保存 挑取臨床標本中的疑似肺炎克雷伯菌單菌落,通過MALDI-TOF MS 進行鑒定(分析范圍 0～15 000m/z),根據飛行質譜標志峰的特點,將飛行質譜鑒定分值>2.0 的菌株判定為肺炎克雷伯菌進行后續實驗。再采用分區劃線法涂布于培養基,置于 37 ℃ 恒溫箱過夜。將純菌落保存在凍存管中,蓋上蓋子密封,并注明患者的姓名、細菌名稱和保存日期后保存于-80 ℃ 冰箱。

1.3.2PKS基因檢測 熱裂解法提取 DNA,采用 PCR 篩查所有菌株的PKS基因。根據PKS基因的相關研究[11],其 4 個區域(clbA、clbB、clbN和clbQ)檢測陽性認為PKS基因存在,引物序列參考文獻 [12],具體信息見表 1。PCR 擴增條件:94 ℃ 預變性 5 min→95 ℃ 變性 30 s→53 ℃ 退火 30 s→72 ℃ 延伸 1 min,進行 30 個循環,最后 72 ℃ 延伸 10 min。擴增后的 PCR 產物加入 2% 瓊脂糖凝膠板。電泳參數:100 mA,180 V,40 min。電泳后進行凝膠成像檢測。將陽性擴增產物測序并比對分析。

1.3.3 資料收集 追蹤 234 例肺炎克雷伯菌感染患者的病例資料,根據有、無PKS基因島分為PKS+組和PKS-組。記錄患者的病史,包括患者的基本資料(性別、年齡和科室)、實驗室檢查數據、感染部位和出院診斷等。

1.3.4 MALDI-TOF MS 篩選與藥敏實驗 采用 MALDI-TOF MS 鑒定PKS+菌株和PKS-菌株標志峰是否存在差別,使用全自動細菌鑒定與藥敏分析系統進行臨床常見抗菌藥物的藥敏試驗。藥敏結果根據 2019 年美國臨床實驗室標準化研究所(clinical and laboratory standards institute, CLSI)標準判定。

1.4 統計學分析 采用 SPSS 21.0 軟件進行統計分析。分類變量采用χ2檢驗進行分析。連續變量呈非正態分布,采用 Mann-WhitneyU非參數檢驗分析差別。P<0.05 為差別有統計學意義。

2 結 果

2.1 PCR 驗證 根據PKS基因的相關研究[11],PKS基因 4 個區域(clbA、clbB、clbN和clbQ)檢測陽性為PKS基因陽性(圖 1)。

PKS:聚酮合酶。M:GLred DNA Marker。A:PKS基因島瓊脂糖凝膠電泳結果;B:PCR擴增產物的部分測序結果;C:部分菌株PKS 基因島瓊脂糖凝膠電泳結果。

2.2 MALDI-TOF MS 鑒定結果 采用現有 MALDI-TOF MS 方法分析PKS+菌株和PKS-菌株的質譜特征峰,并疊加兩者的飛行質譜結果(分析范圍為 0～15 000m/z),可見二者的主要標志峰近似(圖 2)。比較PKS基因表達的質譜圖特征峰,二者并無差別。

PKS:聚酮合酶。MALDI-TOF MS:基質輔助激光解析電離飛行時間質譜。

2.3 菌株來源樣本類型分布 本研究按照 MALDI-TOF MS 判定標準共納入菌株 234 株。菌株來源樣本類型包括痰液、血液、尿液、膿液、腹水和膽汁等 15 類,主要來源于痰液(70.1%,164/234)、血液(7.3%,17/234)、腹水/膽汁(5.6%,13/234)和膿液(4.3%,10/234)。

2.4PKS基因島臨床特征分布情況PKS+組與PKS-組感染者的性別、年齡構成上比較,差別無統計學意義(P>0.05)。PKS+組感染者中,來源于肝病中心(18.2%,16/88)較PKS-組感染者(6.2%,9/146)多(P=0.004),患有肝膿腫的比例(13.6%,12/88)較PKS-組感染者(1.4%,2/146)高(P<0.001)。其余結果見表 2。

表2 PKS 基因島臨床特征分布表

2.5PKS+肺炎克雷伯菌耐藥情況 抗菌藥物敏感性試驗結果可見,PKS+菌株的耐藥性較PKS-菌株低。PKS+菌株在氨曲南、亞胺培南、美羅培南、阿米卡星、妥布霉素、環丙沙星、左氧氟沙星和復方新諾明的抗菌藥物敏感性更高(P<0.001,表3)。

表3 PKS 基因島耐藥情況表

3 討 論

PKS基因島為 54 kb 基因組成,主要編碼合成PKS和非核糖體肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase, NRPS)。該基因島是腸桿菌目的重要基因,與多種細菌毒力因子相關[6]。含有PKS基因島的菌株可以合成一種基因毒素——Colibactin。Colibactin 通過誘導真核細胞 DNA 雙鏈斷裂,染色體畸變,并使細胞周期停滯在 G2/M 期,以此發揮其毒性作用,并在細菌感染中具有重要價值[13-14]。攜帶有PKS基因島菌株更易在新生兒尚未完全成熟的腸道中定植,隨后通過血流轉移至其他部位[15]。此外,PKS+肺炎克雷伯菌株感染小鼠后,對其大腦具有趨向性,在小鼠腦膜炎進展過程中發揮毒性作用[10]。目前關于PKS基因島的研究主要在血流感染方面,對于肺炎克雷伯菌中對于PKS基因島的研究還尚有不足。

在既往研究[11,13,16-17]中,肺炎克雷伯菌的PKS基因島攜帶率為 3.5%～26.8%。本研究發現,PKS+菌株占臨床分離株的 37.6%(88/234)。本研究結果較文獻報道[11,13,16-17]的PKS+肺炎克雷伯菌的流行率更高,提示近年來的PKS基因島在肺炎克雷伯菌表達具有流行趨勢?？紤]到PKS基因島的細胞毒性作用,這種變化趨勢應當引起高度重視,預防高毒力菌株在臨床流行。

本研究發現,感染PKS+肺炎克雷伯菌的患者更易發生肝膿腫(P<0.001),而患者肝臟感染 hvKP 后更易形成膿腫并引起各種并發癥[18-19],這意味著PKS基因島在 hvKP 感染者肝膿腫形成中發揮重要作用。統計分析抗菌藥物的敏感性發現,PKS+肺炎克雷伯菌的耐藥性低。結合 hvKP 的相關研究[20]可知,肺炎克雷伯菌高毒力的存在通常伴隨著藥物敏感性的降低,因此,上述結果可能是由于PKS+肺炎克雷伯菌存在高毒力情況,但需要后續實驗證實。同時筆者發現,高毒力菌株對于藥物也出現耐藥性,這提示菌株可能也存在耐藥基因。肺炎克雷伯菌中毒力和耐藥性的結合將是臨床抗感染治療的一個更大挑戰。此外,對 MALDI-TOF MS 鑒定結果分析發現,不存在特殊的質譜標志峰快速鑒定PKS+肺炎克雷伯菌,這說明現有的微生物鑒定方式尚無法對PKS+肺炎克雷伯菌進行精準鑒定。因此,亟需探討PKS基因島的快速鑒定,進而針對肺炎克雷伯菌患者進行精準有效的治療。

綜上所述,PKS基因島在肺炎克雷伯菌菌株的檢出率具有日益增長的趨勢,且更易導致肝膿腫的發生。PKS+肺炎克雷伯菌攜帶更多的毒力基因,并表現出相對較低的抗菌藥物敏感性。應對PKS基因島在肺炎克雷伯菌的流行情況引起高度重視,建議開展更廣泛的監測,為臨床治療和預防其傳播提供實驗室依據。