有機種植與常規種植蔬菜地土壤細菌群落多樣性分析

曾廣娟, 馮 陽, 吳 舒, 彭紅麗, 耿世剛

(1.河北環境工程學院,河北秦皇島 066102; 2.企美實業集團有限公司,河北邯鄲 057150)

長期以來高強度地掠奪性種植和化肥農藥引發的耕地質量下降問題已成為制約中國農業可持續發展的瓶頸。因此,有機農業應時而生,有機農業更強調對生態環境的保護及注重土壤的健康。豐富而穩定的土壤微生物多樣性是維持土壤肥力和土壤健康的核心與關鍵,土壤細菌的豐富度和多樣性對于維持土壤生態系統健康發揮著關鍵作用[1],在綠色發展大背景下土壤微生物在未來農業生產中將扮演越來越重要的角色。因此,探索有機與常規種植土壤細菌群落多樣性對建立高效、安全、資源節約、環境友好的有機農業發展具有重要作用。國內外學者對有機種植與常規種植2種農業生產方式的農作物產量與品質[2-3]、土壤環境質量[4-6]、土壤肥力效應[7-9]、根際代謝產物[10]、不同種植方式對生態環境的影響[11-12]等角度開展了相關研究,認為與常規種植方式相比,有機種植方式在各方面顯示出顯著的優越性。隨著土壤生物技術的發展和不斷完善,土壤微生物研究迅速成為國際科學研究熱點之一。汪潤池等認為,有機種植地塊的土壤微生物群落特征的綜合評分高于常規種植地塊[13]。馮海瑋等研究證明,有機種植麥田中細菌種群更為豐富,有機種植可以增加土壤細菌多樣性,且不同土層細菌多樣性存在差異[14]。黃化剛等對喀斯特地區由常規種植轉為有機種植的煙田微生物的分析表明,土壤有益微生物類群數量增加,細菌以變形菌門、放線菌門、酸桿菌門占優勢[15]。微生物多樣性越高的土壤,表現出更復雜的生態功能、更高的抗環境脅迫和作物生產能力[16-17]。土壤微生物數量巨大、種類豐富,但能夠被鑒定的微生物種類不足5%[18],隨著高通量測序平臺的發展,更多低豐富群落物種被鑒定,提高了微生物群落研究的完整性,成為了研究微生物群落多樣性的重要手段。然而,采用高通量測序技術探究有機種植與常規種植蔬菜地土壤細菌群落結構多樣性的差異研究尚鮮見報道。采用Illumina測序技術對2種不同種植方式土壤細菌群落的組成和多樣性進行分析,以期為保護土壤微生物多樣性、保持土壤肥力、維護土壤健康、建立合理的種植方式提供理論依據。

1 研究區概況與研究方法

1.1 材料

研究區位于河北省邯鄲市永年區企美實業集團有限公司南王莊有機蔬菜種植基地和隔離帶外的常規種植基地(36°37′N,114°41′E),面積均為1.33 hm2,為鮮食大豆和西蘭花輪種,土壤為褐土。南王莊有機蔬菜種植基地2018年開始進行有機蔬菜種植,開始有機種植前2種植基地土壤的經營管理狀況一致。有機種植基地施用肥料為公司自制羊糞 30 000 kg/(hm2·年),常規種植區域施用肥料為 1 500 kg化肥/(hm2·年);有機肥在3月初施入,化肥根據蔬菜生長狀況于生長季節施入。

1.2 土壤樣品采集

鮮食大豆于2021年7月底采收,西蘭花于8月初栽植,2021年8月25日在2基地內各設置2個 10 m×10 m的樣方,每個樣方按梅花形采樣法,分別挖取0～15 cm和15～30 cm土壤樣品并相同土層多點混合而成,所有樣品分成2份,1份置于 -80 ℃ 保存用于土壤高通量測序,1份風干后用于土壤化學性質測定。有機種植樣地的土壤樣品記為YJ1(0～15 cm)、YJ2(15～30 cm);常規種植樣地的土壤樣品為CK1(0～15 cm)和CK2(15～30 cm)。

1.3 土壤細菌群落分析

采用CTAB法從樣品中提取總基因組DNA,在1%瓊脂糖凝膠上監測濃度及純度;依據16S rRNA基因的變異區域,利用保守區設計通用引物進行PCR擴增;對PCR產物進行純化;使用TruSeqDNA PCR-Free樣品制備試劑盒生成測序文庫(Illumina);對高變區進行測序分析和菌種鑒定。

1.4 土壤理化性質測定

土壤有機質的測定采用重鉻酸鉀氧化-容量法,全氮測定采用凱氏定氮法,全磷測定采用硫酸-高氯酸消煮法,全鉀的測定采用NaOH熔融-火焰光度法,土壤pH值測定采用電位法。

1.5 數據處理

基于Illumina NovaSeq 測序平臺,利用雙端測序的方法,進行PE250雙末端測序,測序得到的下機數據進行拼接和質控,得到Clean Tags,再進行嵌合體過濾,得到可用于后續分析的有效數據。以97%的一致性將序列聚類成為OTU(operational taxonomic units),共得到8 792個OTU,然后對OTU序列與Silva138數據庫進行物種注釋。根據物種注釋情況,進行組間細菌相對豐度比較及進一步計算α多樣性,進行組間差異的比較,揭示不同種植方式下土壤細菌群落結構的差異特征。

2 結果與分析

2.1 有機種植與常規種植土壤化學性質分析

由測定結果(表1)可知,有機種植與常規種植土壤均為弱堿性,表層土壤pH值低于深層土壤,有機種植土壤pH值低于同土層常規種植pH值。相同土層土壤有機質以有機種植方式高,表層土壤高于深層土壤,變化趨勢為YJ1>CK1>YJ2>CK2,表層與深層表現出了顯著性差別;土壤全氮、全磷、全鉀表現出了相同變化趨勢,為CK1>CK2>YJ1>YJ2;方差分析(ANOVA)和LSD多重比較顯示不同種植方式土壤化學性質存在顯著差別(P<0.05)。

2.2 有機種植與常規種植土壤細菌OTU分布

由測序結果(圖1)可知,隨著測序量的增加,4組土壤樣品的稀釋曲線逐漸趨于平緩,提示測序數據量漸進合理,更多的數據量僅會產生少量新的物種(OTU)[19]。所有樣品的測序覆蓋度均在97%以上,證明本次試驗取樣量基本合理,可開展后續的多樣性分析,能真實反映有機種植和常規種植土壤細菌的群落組成。

對Illumina NovaSeq測序所得土壤樣品數據經質檢后,所有樣品獲得的細菌有效序列總數為 206 946 條,4組12個土壤樣品的8 792個OTU分屬于88門152綱319目446科841屬371種。

由圖2、圖3可知,Venn圖中有機種植與常規種植土壤細菌共有的OTU數是1 955個,占總數的23.4%。YJ1特有的OTU數最高,為845個,占總數的10.1%;CK1特有的OTU為819個,占比9.8%;YJ2為686個,占總數的比例為8.2%;CK2特有的OTU數量最低,為672個,占總數的8.0%。表明不同種植方式不同土層細菌群落結構有一定相似性,同時表現出特異性,以YJ1土壤細菌特有的OTU最高,可能與種植方式有密切關系。

2.3 有機種植與常規種植方式土壤細菌α多樣性指數分析

由表2可知,α多樣性指數分析中,分別對4個樣品的observed_species指數、Shannon指數、Simpson指數、Chao1指數、ACE指數進行統計,使用方差分析(ANOVA)和LSD多重比較探究不同樣品的差異顯著性,YJ1的5個指數均為最大,除observed_species指數外,YJ1在上述4個指數分別與YJ2、CK1、CK2存在顯著差別(P<0.05),表明YJ1細菌群落的豐富度、物種的均勻度均為最高。

表2 有機種植與常規種植土壤細菌Alpha多樣性指數比較

2.4 有機種植與常規種植土壤細菌相對豐度分析

由圖3可知,物種注釋結果,YJ1、YJ2、CK1、CK2樣品土壤細菌在門分類水平上屬于88個門,相對豐度排名前10的細菌門依次為變形菌門(Proteobacteria)、unidentified_Bacteria、酸桿菌門(Acidobacteriota)、泉古菌門(Crenarchaeota)、放線菌門(Actinobacteriota)、綠彎菌門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidota)、甲基肌酐菌門(Methylomirabilota)、黏菌門(Myxococcota)、厚壁菌門(Firmicutes),10個菌門的相對豐度在樣本YJ1、YJ2、CK1、CK2中占所有菌門的比例分別為77.17%、78.66%、80.83%、78.67%。以變形菌門(相對豐度18.10%～27.86%)和酸桿菌門(相對豐度8.10%～14.74%)2大菌門占絕對優勢。進一步LSD多重比較顯示,放線菌門、綠彎菌門和甲基肌酐菌門3個菌門的相對豐度以有機種植的不同土層豐度高,與常規種植表現出顯著差異(P<0.05);而常規種植中變形菌門、酸桿菌門、擬桿菌門和厚壁菌門4個菌門的相對豐度顯著高于有機種植(P<0.05)。由表3可知,相同種植方式的不同土層間,YJ1和YJ2在門水平未表現出顯著性差異;而常規種植中,酸桿菌門、擬桿菌門和厚壁菌門在CK1和CK2間的相對豐度差異顯著(P<0.05)。而泉古菌門和黏菌門在有機種植與常規種植不同土層中的相對豐度接近,未表現出顯著差別。

表3 有機種植與常規種植不同深度土壤細菌在門水平的相對豐度差異分析

高通量測序顯示,4個樣品共分屬于841屬,其中優勢菌屬(相對豐度>1%)為MND1、Sphingomonas、Haliangium、Dongia。由圖4可知,屬水平聚類豐度熱圖,YJ1樣品細菌豐度較大的屬包括MND1、Haliangium和Dongia,Dongia在YJ2樣品中豐度也較高,但Haliangium和Dongia在CK1和CK2中豐度明顯降低甚至消失;在YJ2樣品中豐度較高而在CK1和CK2中豐度較低或幾乎接近零的屬包括oc32、MIZ17、Pelagibius、Castellaniella、Gaiella、Candidatus_Nitrososphaera、Lysobacter。在CK1豐度較大但在其他樣品豐度極低的屬是Faecalibacterium和Ellin6055,CK1和CK2豐度同時較高的屬是Massilia、Flavisolibacter、Steroidobacter、Pontibacter、Sphingomonas、YC-ZSS-LKJ147、SWB02、Bacillus、Bryobacter、RB41和Pseudoxanthomonas;CK1和YJ1豐度均較高的屬有Lactobacillus、Candidatus_Entotheonella和Skermanella。CK2和YJ2豐度都較高的屬是Ralstonia和Pseudomonas。

2.4 有機種植與常規種植土壤細菌群落組成分析

為探究有機種植與常規種植土壤細菌群落結構差異,基于weighted Unifrac距離進行主坐標分析(PCoA)。由圖5可知,pcoa1軸和pcoa2軸分別表示2種不同種植方式不同土層間差異貢獻率分別是50.7%和15.66%,累計貢獻率為66.36%。其中,YJ1和YJ2位于第Ⅱ和第Ⅲ象限,CK1和CK2位于第Ⅰ象限,土壤細菌群落按照不同樣品聚集成簇;另發現,CK1和CK2這2個圈的距離大于YJ1和YJ2這2個圈的距離,說明YJ1和YJ2細菌群落結構差異不明顯,CK1和CK2間差異較明顯,有機種植的細菌群落和常規種植的細菌群落可很好地區分。PCoA分析表明,2種不同模式的土壤細菌群落有明顯差別。

由圖6可知,LDA score>4的土壤樣品豐度差異的顯著物種。本次共檢測到23個有顯著差異的細菌群落。對于YJ1組,對其有顯著影響效應的菌群是羅庫菌目(Rokubacteriales);對于YJ2土壤細菌群落,對其有顯著影響的菌群為11個,其中,影響較大的3個菌群分別為芽單胞菌目(Gemmatimonadales)、芽單胞菌科(Gemmatimonadaceae)、放線菌門;對于CK1組,對其有顯著影響的菌群為9個,其中影響較大的3大菌群依次為變形菌門、鞘脂單胞菌科(Sphingomonadaceae)、鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales);對CK2組影響較大的菌群是酸桿菌門和γ變形菌綱(Gammaproteobacteria)。因此,不同種植方式、不同土層細菌群落均有差別。

2.5 土壤細菌群落與環境因子的冗余分析

為進一步揭示影響不同種植方式土壤微生物群落的環境因子,以土壤細菌屬水平群落豐度為響應變量,土壤環境因子為解釋變量進行基于距離的冗余分析(dbRDA),由圖7可知,細菌的第一軸和第二軸累計解釋變異量為81.51%。有機種植中 0～15 cm土層的采樣點YJ1(Y.J.1、Y.J.2和Y.J.3)與15～30 cm土層的采樣點YJ2(Y.J.4、Y.J.5和Y.J.6)距離更近,而常規種植中0～15 cm采樣點CK1(C.G.1、C.G.2和C.G.3)與15～30 cm采樣點的CK2(C.G.4、C.G.5和C.G.6)距離更近,表明相同種植方式不同土層微生物群落的組成類似,不同種植方式土壤微生物群落差異明顯。細菌群落中,Haliangium與SOM呈正相關,而與pH值呈負相關;MND1、unidentified_Bacteria和Candidatus_Nitrosotenuis與pH值呈正相關,而與SOM呈負相關;Sphingomonas、RB41與Pontibacter與TN、TP、TK呈正相關,且對Sphingomonas影響最大;Dongia和Candidatus_Nitrososphaera與TN、TP、TK呈正相關。環境因子對土壤細菌群落的影響大小依次為TN>SOM>TP>pH>TK,Mantel test檢驗表明,TN(R2=0.853 5,P=0.001)、SOM(R2=0.757 2,P=0.002)、TP(R2=0.701 1,P=0.005)、pH值(R2=0.520 6,P=0.04)是影響不同種植方式土壤細菌群落的主要環境因子,而TK(R2=0.285 4,P=0.217)對土壤細菌群落的影響不顯著。

3 討論

本研究是基于16S rRNA高通量測序技術分析對比了有機種植與常規種植蔬菜地2種不同模式、不同深度土層的細菌群落結構特征,發現不同種植方式、不同土層的OTU數目、細菌群落組成和多樣性存在差異。

3.1 不同種植方式不同土層土壤化學性質比較

分析結果發現, 有機種植降低了土壤pH值,有機種植蔬菜地有機質含量分別比常規種植相同土層提高了18.29%和20.53%, 這與王宏燕、姜瑢等對華北和華中典型農場有機種植土壤的研究結果[6,20]一致。但TN、TP、TK均低于常規種植相同土層,這可能是由于:第一,有機肥的氮素礦化率顯著低于無機肥,土壤氮素有效性下降[21]。第二,有機種植時間短,有機種植體系實施前期養分釋放緩慢從而導致土壤養分的供應不足[22]。第三,常規種植過量施用化肥。第四,2種種植方式地上部產量基本接近。

3.2 有機種植與常規種植不同種植方式不同土層細菌多樣性

α-多樣性指數是有效評價土壤微生物群落多樣性和物種豐富度的指標[23]。本研究發現,YJ1的Shannon指數、Simpson指數、Chao1指數、ACE指數在4個樣品中均為最大,表明有機種植方式下0～15 cm土壤細菌群落的多樣性、豐富度與物種的均勻度均為最高,說明有機種植增加了表層土壤細菌的多樣性和豐富度,研究結果與前人研究結果[14]一致,這可能與有機種植過程中僅施用園區內閉合循環過程中自制的有機肥料有關。陳芝蘭等研究證明,有機肥可為土壤微生物提供所需的氮源、碳源與能量,有利于微生物的生長與繁殖,增加微生物的數量和活性[24]。但本研究中,有機種植15～30 cm 深的土層α多樣性指數最低,這可能與細菌在土壤中的分布特性有關,也可能是由于有機種植時間較短所致。

3.3 不同種植方式不同土層細菌群落特征分析

有機種植與常規種植土壤細菌群落空間分布顯示,不同種植方式不同土層差異對土壤細菌群落組成有一定的影響,2種種植方式下既有共同的優勢細菌群落,同時也存在差異。門水平上,不同種植方式不同土層中,土壤細菌以變形菌門、酸桿菌門、泉古菌門、放線菌門等占絕對優勢,這與已有的研究結果[15]一致。本研究中,放線菌門、綠彎菌門為有機種植方式的優勢菌群,放線菌門屬于土壤中的有益菌群,有助于土壤的生物緩沖作用并在作物生產的有機物分解中扮演著一定作用,放線菌門細菌還具有共生固氮和解磷作用[6,25];綠彎菌門參與包括CO2固定、CH4氧化及纖維素等大分子降解的碳循環過程,同時也是氮硫元素循環的重要參與者[5],還能促進土壤有毒物質的降解[26]。常規種植方式中變形菌門、酸桿菌門表現出更高的豐度,變形菌門在土壤的碳氮及硫循環中起著關鍵作用,但同時也含有一些致病菌[27]。常規種植土壤中變形菌門相對豐度顯著上升,可能會增加一些不利于植物生長發育的致病菌;酸桿菌門是寡營養細菌[28],一般被認為是較貧瘠土壤環境的指示細菌[29];還可以作為土壤質量健康的一個指標[30],土壤質量越好酸桿菌門相對豐度越低,表明常規種植土壤的營養狀況和環境狀況出現惡化現象。由此可知,有機種植更有利于增加土壤中的有益菌群,有利于保持土壤質量,維護土壤生態系統的健康,上述研究結果與前人研究結果[14,31]一致。然而,也有學者指出變形菌門的豐度與有機質的含量呈正相關[32],本研究中雖未能證明這一點,但研究結果顯示變形菌門是所有土壤樣品中的最優勢菌群,在有機質分解轉化中起著重要作用,且研究區域土壤為弱堿性土壤,因此推測變形菌門可能是堿性土壤中的優勢細菌群落,這與王鵬、趙祥等的研究結果[33-34]一致。

屬水平上,有機種植土壤中Haliangium、Dongia、Pelagibius和Castellaniella為優勢屬,其中Haliangium被證實能分離出抗植物病原真菌物質,從而證明了Haliangium具有潛在的生防作用[35],屬于有益生防細菌。Pelagibius屬于嗜鹽細菌,在鹽堿土壤有機質循環及其土壤修復中發揮著重要作用,Castellaniella具有降解石油烴的功能,說明有機種植更能為微生物生長提供良好的環境條件。常規種植土壤中顯著增加的菌屬為Candidatus_Entotheonella、Terrimonas、Adhaeribacter、鞘氨醇單胞菌屬、Pseudoxanthomonas、Candidatus_Nitrosotenuis、芽孢桿菌屬、Flavisolibacter、Ralstonia,可能與大量施用化肥從而使氮磷在土壤中累積導致促進硝化過程與磷素循環的細菌增多;以及由于使用化學農藥進行病蟲害防治促使降解有機污染物的微生物增多;Ralstonia是一類重要的土傳病害細菌,可導致青枯病的發生,常規種植土壤中有害細菌的增加可能是由于化肥、化學農藥的過度使用,造成了土壤理化性質惡化,微生物區系結構失衡,或者是由于輪作時間短所致。

不同土層之間,YJ1土壤Stenotrophobacter的相對豐度極顯著高于YJ2樣品,有學者研究表明,Stenotrophobacter具有結瘤效果[36],可能是花椰菜上茬種植的鮮食大豆在有機種植方式下土壤表層根部更有利于根瘤的形成。常規種植CK1樣品中Candidatus_Entotheonella相對豐度極顯著高于CK2樣品,說明化肥施入后,氮肥在表層積累更多。研究還發現,YJ1樣品中具有解磷作用的Inquilinus相對豐度極顯著高于CK1和CK2樣品,表明有機種植土壤表層細菌可能更有利于難溶性磷轉化為可溶性磷,從而保證土壤中磷的有效供應。Opitutus在YJ2樣品與CK1樣品間表現出極顯著差異,Opitutus為厭氧發酵細菌,能培肥土壤和促進土壤生態良性循環,表明有機種植深層土壤也能為微生物創造良好的生態環境,有利于土壤的健康。Solimonas能降解黃曲霉毒素B1,在CK1樣品中相對豐度極顯著高于YJ2樣品,可能是常規種植的管理措施導致了土壤生態系統的惡化。李思萌等研究認為,有機種植總體上能明顯降低土壤中的重金屬含量[26],本研究發現耐鉻菌屬Terribacillus在CK1樣品中相對豐度明顯高于YJ2樣品,表明有機種植對土壤中重金屬的富集能起到抑制作用。

3.4 微生物群落結構與土壤環境因子的dbRDA分析

有機種植與常規種植由于農業生產標準的差別,在施肥種類與方式、種植強度、農藥選擇等方面存在較大差異,因而導致土壤理化性質和土壤微生物群落結構等發生顯著變化,Dean等的研究表明,土壤微生物多樣性和群落結構變化與土壤特性相關[37-38]。本研究有機種植中施用的有機肥為園區內閉環循環生產的羊糞,肥料方面不存在外來引入的干擾因素,研究發現有機種植土壤的pH值低于常規種植相同土層的pH值,與王玲等的研究結果[10]一致。從不同種植方式土壤微生物(屬水平)與環境因子的dbRDA分析可以看出,總氮、有機質、pH值和總磷是影響微生物群落結構的關鍵土壤環境因子。Sphingomonas與全氮、全磷、全鉀和有機質同時正相關,Sphingomonas能降解土壤中的有毒物質[39],對植物生長起到保護作用。增施有機肥能夠提升有益菌群Haliangium和Sphingomonas的生長,從而創造有利于植物生長的細菌群落結構。

4 結論

不同種植方式不同土層中,細菌多樣性和群落結構不同,有機種植0～15 cm土壤具有更豐富的細菌多樣性和穩定性,確認放線菌門(Actinobacteriota)、綠彎菌門(Chloroflexi)為有機種植方式的特征優勢菌群,變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteriota)為常規種植方式的特征優勢菌群。α-多樣性指數分析表明,有機種植0～15 cm土層細菌群落多樣性、豐富度和物種的均勻度均為最高。dbRDA分析結果顯示,土壤細菌群落主要受總氮、土壤有機質、總磷、pH值等環境因子的顯著影響,而總鉀對微生物群落的影響不顯著。