佟雷, 林懿

(華僑大學 醫學院, 福建 泉州 362021)

近年來,外泌體(exosome)作為腫瘤診斷的生物標志物已逐漸成為研究熱點,它源于細胞內吞系統中的多囊泡內體,通過出芽、內陷等形成球形、扁形的雙層磷脂膜結構小體,并通過胞吐的形式分泌到細胞外.作為一種細胞間通訊的載體,外泌體以結構穩定、攜帶信息量大、生物相容性好等特點在診療、預后、靶向藥物傳遞等腫瘤精準診療環節中顯示出極具潛力的臨床應用前景.本文結合外泌體的結構特點,從腫瘤診斷及靶向治療兩方面出發,對外泌體的研究進展及臨床應用前景進行綜述.

1 外泌體概述

外泌體是細胞分泌的直徑為40～100 mm級別的生物納米級球形脂質雙分子層囊泡,大小均勻.外泌體在蔗糖密度梯度溶液中以質量濃度為1.13～1.19 g·mL-1進行漂浮,大多數正常細胞和腫瘤細胞均以出芽方式進行分泌,特別是樹突狀細胞、淋巴細胞、上皮細胞等免疫相關細胞[1].外泌體的提取方法很多,除高速離心是金標準外,還包括超濾、免疫親和捕獲、基于電荷中和的聚合物沉淀、尺寸排阻色譜法和微流體技術等[2].

Johnstone[3]發現成熟紅細胞中轉鐵蛋白受體的形成與胞內轉鐵蛋白受體丟失有關,為了與其他類型的細胞外囊泡區別,將其命名為外泌體.早期研究發現外泌體廣泛存在于血液、唾液、尿液、腦脊液和母乳等多種體液中,是細胞排出代謝廢物的一種簡單方法.

隨著不同類型的外泌體中分離出不同的核酸、蛋白質和脂質,人們已經認識到外泌體在腫瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病、神經退行性疾病等人類多種疾病中發揮重要作用.根據外泌體數據庫的更新,外泌體內容物包括9 769種蛋白質、4 946種mRNA、2 838種miRNA和1 116種脂質.在表觀遺傳調控和腫瘤生物學行為中,已有大量研究發現,多種腫瘤細胞外泌體攜帶的核酸、蛋白質與腫瘤細胞信號通路的調控與腫瘤微環境的改變有著密切的關系.

外泌體內容物與不同類型腫瘤生物學功能的關系,如表1所示.

表1 外泌體內容物與不同類型腫瘤生物學功能的關系

外泌體內容物可以作為腫瘤的抑制或促進因子,調節細胞增殖和遷移,上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),以及血管生成和轉移等,在腫瘤微環境的信息傳遞過程中發揮重要作用[4].與傳統血清腫瘤抗原生物標志物相比,外泌體獨特的表達模式及其內容物的相對穩定性使其成為腫瘤液體活檢的新候選物.

外泌體還可在免疫治療中作為免疫細胞激活物刺激抗癌免疫應答,發揮免疫調節功能,其獨特結構也適用于靶向藥物傳遞系統的構建,有助于實現抗腫瘤藥物的靶向傳遞[5].綜上,將外泌體作為一種新的臨床檢驗方式及治療手段應用于腫瘤的診療具有極大潛力.

2 外泌體在不同類型腫瘤診斷中的應用

2.1 胃癌(gastric cancer,GC)

GC作為消化系統最重要腫瘤之一,患者往往由于早期癥狀不典型而延誤病情,錯過最佳治療機會.因此,GC的早期診斷對提高患者的長期生存率至關重要.研究發現,外泌體攜帶的內容物,尤其是非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA),在GC診療方面都具有巨大潛力.Guo等[24]運用RNA的分離、合成方法及RT-PCR技術,檢測循環外泌體中GC來源的外泌體lncRNA-GC1(早期、多階段),發現lncRNA-GC1與傳統臨床血清標志物CEA,CA72-4,CA19-9相比,在鑒別GC患者、GC癌前病變患者、特別是對于標準生物標志物陰性的GC患者中表現出更強的特異性和敏感性.Tang等[25]在不同腫瘤淋巴結轉移(tumor node metastasis,TNM)分期的GC患者的臨床樣本中檢測circRNA表達譜,發現circ-KIAA1244在GC患者組織細胞、血漿中的表達水平均低于對照組,且GC組織來源的circ-KIAA1244在血漿中的表達水平降低與GC患者的TNM中淋巴結轉移行為負相關,表明GC組織來源的circ-KIAA1244有望作為一種新型GC檢測生物標志物.

此外,一些外泌體攜帶的蛋白已被證實具有GC診斷價值.GC患者血清中GKN1濃度明顯低于健康人群和結直腸癌、肝細胞癌患者,提示其有可能成為GC特異性診斷標志物[26].外泌體在GC的進展中發揮重要作用,包括GC發生、轉移、耐藥等.紫杉醇耐藥GC細胞MGC803R通過產生含有過表達miR-155-5p的外泌體,抑制GATA結合蛋白3和p53誘導核蛋白1的表達水平,從而促進紫杉醇敏感GC細胞的EMT,降低紫杉醇化療敏感性[27].

2.2 結直腸癌(colorectal cancer,CRC)

CRC是另一種重要的消化系統惡性腫瘤,其發病率在我國逐年呈上升趨勢,但臨床診斷上缺少除腸鏡外的有效早期診斷方法,外泌體的研究可能成為新的手段.Li等[28]發現CRC患者手術治療前,腫瘤組織和血漿外泌體中GPC1+蛋白表達水平明顯高于對照組,同時,檢測到血漿中miR-96-5p和miR-149表達水平降低,手術治療2個月后,3者指標均恢復正常.過表達miR-96-5p和miR-149可以明顯降低外泌體GPC1+的表達水平,說明血漿GPC1+外泌體的增加和血漿miR-96-5p和miR-149表達水平的減少可能是CRC診斷的特異性標志物和CRC治療的靶點.

此外,患者血清外泌體的檢測還與CRC的增殖、遷移及預后有顯著相關性,既包括miRNA[29],例如,miR-25-3p,miR-130b-3p,miR-425-5p表達水平的顯著上調與CRC的進展及轉移相關,也包括長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA),例如,lncRNA GAS5與CRC細胞增殖、遷移、侵襲及預后顯著相關,CRC中lncRNA GAS5低表達導致miR-221的表達水平升高,從而抑制了RECK mRNA表達水平,最終促進CRC細胞的遠處淋巴結轉移和局部復發[30].

2.3 肺癌(lung cancer,LC)

LC是世界上最常見的癌癥,也是引起癌癥死亡的主要原因,主要包括小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)兩種類型,它們分別占LC的15%和85%.臨床上,LC患者組織活檢是常用的診斷標準,但由于組織采集的數量和時間的限制,且腫瘤具有異質性,這種方法在時間性和準確性上還有缺陷,外泌體內多種miRNA,ncRNA,蛋白質的檢測均可能成為新的診斷標志.據報道,與正常對照組相比,NSCLC患者外泌體miRNA表達譜顯著改變,其中,血清外泌體miR-146a-5p,miR-486-5p表達水平上調可能是NSCLC早期診斷較好的生物標志物,而miR-320d,miR-320c和miR-320b過表達水平被認為是預測晚期NSCLC免疫治療療效的潛在生物標志物[31].同時,NSCLC細胞來源的外泌體lncRNA UFC1的高表達水平與腫瘤浸潤有關,lncRNA UFC1通過與EZH2結合,并介導EZH2在PTEN啟動子區域的富集,使H3K27的三甲基化及PTEN的表達水平受抑制,進而促進NSCLC細胞的增殖、遷移和侵襲,為NSCLC診斷提供了一個潛在的標志物[32].此外,間變型淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)陽性NSCLC患者外泌體蛋白質組Tim-3和Galectin-9表達水平降低提示其可用于NSCLC早期檢測[33].

除了可以作為診斷標志物以外,外泌體內還包括一些與腫瘤治療相關的蛋白,包括表皮生長因子受體、生長因子受體結合蛋白等在NSCLC外泌體中高表達水平.奧西麥替尼是NSCLC的一線治療藥物,然而,大多數接受奧西麥替尼治療的患者一年內易復發,EGFR基因突變可能是誘發耐藥的重要因素.Wu等[34]通過構建小鼠模型,證實奧西麥替尼可通過上調Rab GTPase (RAB17)促進外泌體EGFR的釋放,而含突變EGFR的外泌體通過癌細胞網格蛋白依賴的內吞作用內化,激活下游的PI3K/AKT和MAPK信號通路,誘導奧西麥替尼耐藥.

2.4 前列腺癌(prostate cancer,PCa)

血液中的外泌體lncRNAs有望成為對PCa診斷有效且無創的腫瘤診斷新生物標志物.明確腫瘤來源的外泌體lncRNAs的功能是了解其對癌癥鑒別診斷意義的先決條件.Wang等[35]通過建立雙抗體免疫親和系統研究lncRNA SAP30L-AS1,lncRNA SChLAP1在PCa中的表達模式和臨床意義,發現SChLAP1在PCa中的表達水平顯著高于健康和良性前列腺增生個體,而SAP30L-AS1在良性前列腺增生表達水平上調,與前列腺特異性抗原(prostate-specific antigen,PSA)值呈正相關.此外,PCa患者尿液中催化糖基化的酶表達異常可產生PCa特有的糖蛋白,測定PCa患者尿液中異常表達的糖蛋白量也有望作為另一種潛在的診斷方法.Fujita等[36]發現尿液中異常糖蛋白表達水平與PSA表達有關(PSA也是一種具有n-糖基化位點的糖蛋白),采用凝集素抗體酶聯免疫吸附法測定69名男性(20名活檢陰性的男性,49名PCa患者),與活檢陰性的男性相比,PCa患者的PSA表達水平明顯降低.

骨轉移是PCa晚期常見征象,此時,患者易發生病理性骨折,且在X線片上表現為成骨細胞增多.Yu等[37]發現外泌體miR-92a-1-5p是調節骨穩態的關鍵介質,體外實驗表明,PCa細胞來源的外泌體通過直接靶向COL1A1下調I型膠原的表達水平,從而促進破骨細胞向成骨細胞分化.此外,PCa來源外泌體也顯著降低了I型膠原在體內的表達水平.主要表現為破骨細胞的骨溶解,從而促進骨腫瘤生長.外泌體miR-92a-1-5p誘導破骨細胞分化,為PCa骨轉移提供了可能潛在的治療靶點.

2.5 膀胱癌(bladder cancer,BCa)

臨床上BCa的初步診斷包括膀胱鏡檢查、上尿道造影和尿液細胞學檢查.盡管特異性高,但這些檢測易導致尿路炎癥,經常發生假陽性.另外,核基質蛋白22和膀胱腫瘤抗原作為現有診斷性生物標志物,由于缺乏診斷特異性和敏感性,不適用低級別BCa[38],因此,迫切需要尋找BCa新分子靶點.近年來,隨著表觀遺傳和遺傳標記等技術取得重大進展,外泌體的ncRNA的標記主導了這一領域的研究.據報道,BCa患者中血清外泌體lncRNA PCAT-1的AUC(藥時曲線下面積)為0.753,尿液外泌體lncRNA PCAT-1的AUC分別為0.832和0.729,表明lncRNA PCAT-1表達水平與BCa有較強相關性.聯合生物標志物組可能比單一生物標志物更準確地診斷BCa.例如,BCa患者血液外泌體lncRNA PCAT-1,UBC1和SNHG16聯合的AUC為0.826,敏感性為80%,特異性為75%.尿液外泌體miR-139-5p,miR-136-3p和miR-19b1-5p的聯合應用將AUC提高到0.903,敏感性提高到80%,特異性提高到88.2%[39-41].外泌體miR-4644是另一種促進細胞增殖的miRNA,Yan等[42]發現與非BCa患者相比,BCa患者血漿外泌體中miR-4644水平更高,其可直接靶向并下調UBIAD1的表達水平,進而刺激BCa細胞增殖.

2.6 其他系統腫瘤

卵巢癌(ovarian cancer,OC)患者的低生存率和低生活質量的部分原因是缺乏早期診斷工具,既往研究認為miR-200f可作為診斷標志物,因為上皮性OC患者血液中miR-200f水平顯著升高[43].此外,最近的一項研究報道了上皮性OC患者血漿中外泌體miR-21,miR-100和miR-320的表達水平較高,而miR-16,miR-93和miR-126的表達水平較低,并揭示上皮性OC來源的外泌體miRNAs在刺激內皮細胞血管生成的作用[44].近年來,中樞神經系統的疾病越來越受到重視,miR-1246在膠質母細胞瘤(glioblastoma,GBM)患者的腦脊液中富集,腫瘤切除后表達水平降低,表明miR-1246可能是診斷GBM的一個新的生物標志物,靶向miR-1246的治療可能有助于抗GBM免疫治療[45].乳腺癌(breast cancer,BC)現已成為全球第一大癌癥,早篩查、早診斷仍是降低BC發病率和死亡率的關鍵措施,Risha等[46]通過Western blotting和高分辨率流式細胞術對BC衍生外泌體GLUT-1,GPC-1和ADAM10三種外泌體膜/表面蛋白進行驗證,結果表明,與正常組織相比,GLUT-1,GPC-1在BC組織膜表面表達水平較強,而ADAM10則在晚期BC患者或高級別BC組織中表達水平較高,可用于評估BC診斷和預后潛在的新型生物標志物.

3 外泌體在腫瘤治療中的應用

3.1 腫瘤免疫治療

外泌體可能成為最有效的腫瘤疫苗、靶向抗原/藥物載體,在免疫治療方面具有很大的潛力.例如,CD8+T細胞來源的外泌體被發現能夠靶向和誘導腫瘤間質細胞凋亡,促進自然殺傷(natural killer,NK)細胞的激活和增殖,從而誘導腫瘤退化[47].NK細胞來源的外泌體(NKEVs)在體內外均發揮抗腫瘤活性.一方面,NKEVs可以通過與腫瘤或免疫細胞的相互作用促進癌癥治療,另一方面,NKEVs中的內容物可反映癌癥患者NK細胞實際狀態.Federici等[48]開發了一種基于NKEVs的免疫酶檢測方法(NKExoELISA)檢測血漿NKEVs,發現參與細胞毒性、淋巴細胞歸巢、細胞粘附和免疫激活的NKEVs高表達腫瘤抑制因子101(tsg101),CD81,CD63和CD9,提示這些標記物有望成為檢測NK細胞免疫功能的指標.另外,免疫調節研究發現,NKEVs可刺激外周血單核細胞增殖,誘導單核細胞上人類白細胞抗原DR亞型和共刺激分子的表達,同時,NKEVs還增加了CD56+NK細胞的表達比例,促進免疫應答.因此,NKEVs可能對癌癥治療發揮重要作用.

細胞毒性T細胞(cytotoxic T cell,CTL)與MHC I的親和力對控制細胞內病原體和腫瘤發生發展具有重要意義.Wu等[49]發現高親和力CTL分泌的外泌體IL-12可以在不需要抗原的刺激下促進低親和力CTL的快速激活,從而提高機體的免疫防御功能.同時,IL-12外泌體也激活CD8+T細胞產生IFN-γ和顆粒酶B,并最終誘導宿主細胞凋亡.這些結果揭示了CTLs完全激活低親和力CTL的潛在機制,可能對提高低親和力CTL在癌癥和慢性病毒感染免疫治療中的功能具有重要意義.

CD4+輔助T細胞(CD4+Th)表面標志物主要為CD4,CD4與抗原提呈細胞表面的MHC Ⅱ結合時,可激活免疫應答.從CD4+Th分離的外泌體包含外泌體相關蛋白(LAMP-1,TCR和LFA-1)和CD4+T細胞標記物(CD4,TCR,LFA-1,CD25和FasL),在外泌體中過表達這些蛋白及標記物可能促進細胞毒反應和抗腫瘤免疫的發生[50].

有研究表明,外泌體DNA(ExoDNA)可能來源于在細胞質中積累的細胞核和線粒體受損DNA,ExoDNA可通過旁分泌作用激活胞質STING/cGAS通路并激活免疫細胞.既可以調節腫瘤免疫,又可以作為檢查點免疫治療的關鍵調節因子[51].NK細胞對轉移性惡性腫瘤或血液系統惡性腫瘤可表現出快速的免疫反應.Zhu等[52]證實了NK細胞來源的外泌體(exosomes derived from NK cells,NK-exo)膜上FasL的表達,其對黑色素瘤細胞具有良好的殺傷作用.同時,通過BLI和CCK-8試驗證實NK- Exo對小鼠黑色素瘤細胞具有良好的體外抗腫瘤作用,且對正常細胞無明顯影響.

3.2 腫瘤靶向治療

外泌體作為一種具有獨特靶向功能的“納米顆粒”生物囊泡,本身具有裝載多種生物小分子和大分子的能力,并且可以在體內進行運輸,可以成為良好的天然藥物傳遞載體,已有研究將其進行多種修飾,用于腫瘤的靶向治療中.有研究表明,可溶性FMS樣酪氨酸激酶-1(soluble FMS-like tyrosine kinase-1,sFlt-1)在許多癌癥中通過抑制血管生成發揮抗腫瘤活性.基于此,Hao等[53]設計了一種用于裝載sFlt-1外泌體,為探索潛在的NSCLC治療方法進行體內外測試,sFlt-1通過抑制NCI-H69腫瘤異種移植體的生長增加腫瘤凋亡,發揮顯著抗腫瘤活性,并抑制腫瘤細胞增殖.此外,在胰腺導管腺癌免疫治療的研究中,Zhou等[54]構建了一種基于外泌體的雙傳遞生物系統,該系統由骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)來源的外泌體、電穿孔加載的半乳糖凝聚素-9 siRNA(Galectin-9 siRNA)組成,表面由奧沙利鉑(OXA)前體藥包裹,作為免疫原性細胞死亡(ICD)的觸發因子.

OXA可逆轉M2樣腫瘤相關巨噬細胞的腫瘤免疫抑制作用,而BM-MSC外泌體通過靶向Galectin-9/dectin 1軸可增加藥物在腫瘤部位的積累,發揮腫瘤殺傷作用.這種外泌體修飾的抗腫瘤藥物通過抑制腫瘤周圍巨噬細胞極化、細胞毒性T淋巴細胞募集、下調調節性T細胞表達水平等途徑誘導抗腫瘤免疫的療法被稱為iEXO-OXA聯合療法,其在腫瘤治療中已取得顯著療效.miR-21在多種腫瘤細胞中表達水平均出現顯著異常,其在多種腫瘤的發生和發展中起著重要的作用.Wang等[55]將外泌體靶向治療與化療、基因、光熱療法結合起來,設計了一種裝載有模型抗癌藥物內化阿霉素(doxorubicin,DOX)和磁性納米顆粒的外泌體,且外泌體內含有能夠靶向腫瘤周圍miR-21的分子信標,這些磁性納米顆粒通過外部磁場引導至腫瘤富集miR-21的部位.當外泌體聚集在腫瘤部位后,應用近紅外輻射誘導局部熱療,并誘導外泌體包裹的DOX的釋放.釋放的分子信標可以靶向miR-21進行成像和基因沉默,同時,釋放的DOX可以殺死約91.04%癌細胞.誘導腫瘤細胞的鐵死亡有助于增強抗腫瘤免疫效果,而黑素細胞瘤分泌的外泌體PD-L1具有免疫抑制作用.在這種情況下,Zhao等[5]設計了由外泌體抑制劑(GW4869)和鐵死亡誘導劑(Fe3+)組裝成的納米單元,通過靶向下調外泌體PD-L1表達水平,誘導黑色素瘤細胞的鐵死亡,解除黑素瘤細胞對機體的免疫抑制,從而提高全身抗腫瘤免疫應答.上述研究表明,以外泌體為載體構建的靶向藥物模型,以及配合多模式治療有望成為精準腫瘤納米藥物開發的新方向.

4 結論

外泌體與多種腫瘤的生物學行為有密切聯系,核酸、蛋白質和脂質等可通過外泌體內容物形式傳遞至受體細胞并激活相應信號通路調控腫瘤細胞生物應答,這種外泌體介導的反應可以促進或抑制腫瘤的發生、發展,在各類型腫瘤的診斷和預后等方面都具有良好應用前景.因外泌體膜結構穩定性及體液中分布廣泛性,以其為基礎的液體活檢有望成為未來腫瘤診斷的重要手段.在治療方面,與外泌體內容物相關的信號通路可能作為一種更安全、更有效的腫瘤免疫治療的手段.同時,外泌體可被設計成用于遞送不同藥物的載體,包括siRNA、反義寡核苷酸、化療藥物等,這種設計可以比其他合成載體更有效、更有針對性地作為抗腫瘤藥物的靶向載體.

雖然外泌體具有很多特異性的優勢,但仍需克服諸多難題.一方面,由于外泌體的分離提純仍存在一些困難,故外泌體的診斷在腫瘤患者中的臨床應用證據不足.首先,目前大多數外泌體是從血漿等體液或細胞培養的上清液中分離出來,外泌體的產量和純度受到限制;其次,目前外泌體診斷研究的標本量較少,但外泌體應用于腫瘤早期診斷和治療的研究需要大樣本量的實驗數據支持,而且如何大量生產具有治療目的外泌體也是制約其臨床應用的問題之一[56].此外,對外泌體分離提純始終未建立一套統一的標準,超速離心法、免疫親和捕獲法、聚合物沉淀法等都有所涉及,但無論何種方法都存在蛋白質污染,使得研究人員數據互通和繼續研究存在障礙[57].另一方面,基于外泌體的免疫治療和靶向治療目前仍處于早期臨床試驗階段,對于這種新型藥物載體的生產和應用,國際上尚無具體的管理指南[58].因此,在外泌體正式應用于臨床之前,應解決基于外泌體的生物制藥的質量分類和標準問題,并盡快制定具體臨床應用指南,以確保外泌體治療的安全性.總之,外泌體在腫瘤診療中的應用具有巨大的潛力和廣闊的前景,但在基于外泌體的治療被臨床廣泛應用之前,還需要大量的基礎和應用研究.