中醫(yī)藥聯(lián)合EGFR-TKIs 治療NSCLC 耐藥的分子機制及研究進展

桑舒柳 姜靖潔 龔亞斌 （上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腫瘤科 上海 200437）

據(jù)統(tǒng)計，肺癌發(fā)病率和死亡率穩(wěn)定下降［1］，但是非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）5 年生存率僅約為25%，部分符合條件的患者在接受免疫治療或靶向治療后生存時間獲得延長［2］。表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs）在敏感突變NSCLC 治療中效果顯著。然而，幾乎所有的患者在接受EGFR-TKIs 治療后12 個月內(nèi)都會產(chǎn)生不同程度的耐藥［3］。由于耐藥的普遍性，延緩EGFR-TKIs 耐藥并延長生存時間是研究的熱點之一。中醫(yī)藥能通過多靶點多通路多途徑延緩NSCLC 耐藥，對NSCLC 耐藥的研究具有極大的潛力。本文將從EGFR-TKIs 耐藥機制及近5 年中醫(yī)藥聯(lián)合EGFR-TKIs 治療NSCLC 的基礎(chǔ)和臨床研究，并以吉非替尼和奧希替尼為例進行概述，為臨床治療NSCLC 提供參考。

1 NSCLC 的EGFR-TKIs 靶向治療及耐藥機制

EGFR-TKIs 能選擇性結(jié)合EGFR 細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶域的ATP 結(jié)合位點，通過AKT﹑MAPK 的途徑，阻斷EGFR 分子內(nèi)酪氨酸自身磷化及活化，抑制RAS/RAF/MAPK﹑PI3K-Akt 等下游信號通路，從而使腫瘤細(xì)胞凋亡［4］。第一代EGFR-TKIs 以吉非替尼﹑厄洛替尼等為代表，與酪氨酸激酶功能域競爭結(jié)合以抑制其磷酸化。第二代EGFR-TKIs，如阿法替尼﹑達(dá)克替尼等，是不可逆的酪氨酸抑制劑，能更好地改善患者的生存質(zhì)量。此外，有報道發(fā)現(xiàn)，阿法替尼和達(dá)克替尼還對L861Q，G719X和S768I 等非常規(guī)突變有效［5］。前兩代藥物使用后，出現(xiàn)了以T790M 突變機制為主的耐藥現(xiàn)象，于是以奧希替尼和羅西替尼為代表的第三代EGFRTKIs 應(yīng)運而生。第三代EGFR-TKIs 可與酪氨酸激酶功能域不可逆地競爭結(jié)合，抑制其磷酸化，與二代藥物相比，三代藥物在對EGFR 突變和T790M突變敏感的同時可保留野生型EGFR 酪氨酸激酶。雖然第三代EGFR-TKIs 的中位客觀緩解率達(dá)到了71%，中位無進展生存期達(dá)到10.1 個月，但其耐藥仍無法避免［6］。如20 號外顯子上的C797S 突變，這是一種具有交叉抗性的突變，因為它消除了奧希替尼與EGFR 的共價鍵。而在羅西替尼的治療方案中，觀察到E709K﹑L692V﹑C797S 和L798I的等位基因頻率增加。其中L798I 突變，可能影響羅西替尼與EGFR 的C797 殘基共價鍵的形成，而E709K 或L692V 突變的耐藥機制尚不明確［7-8］。此外，第四代EGFR-TKIs 的研究也已經(jīng)開展［9-10］。有學(xué)者將EGFR-TKIs 的耐藥機制分為原發(fā)性耐藥和繼發(fā)性耐藥［11］。原發(fā)性耐藥的機制尚未形成統(tǒng)一認(rèn)識，包括KARS 基因突變﹑BIM 缺失多態(tài)性和EGFR 20 外顯子插入突變等［12-14］。繼發(fā)性耐藥除上文所述T790M 突變，C797S 突變和L798I 突變，小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)化等還有旁路信號通路的激活，如MET 擴增﹑HER2 基因擴增﹑PIK3CA 突變﹑KRAS 突變等［15-17］。

2 中醫(yī)藥治療靶向藥物耐藥的研究進展

研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥聯(lián)合化療在NSCLC 治療中具有減毒增效的作用［18-21］。許多研究表明中醫(yī)藥聯(lián)合EGFR-TKIs 治療晚期NSCLC 能延緩或逆轉(zhuǎn)耐藥。此外，中藥可以多途徑﹑多靶點治療疾病，這可能是其發(fā)揮作用的關(guān)鍵。本文將從臨床和實驗機制方面對延緩或逆轉(zhuǎn)NSCLC 耐藥的中藥活性單體及復(fù)方進行整理。

2.1 中醫(yī)證候辨析

肺癌屬于中醫(yī)學(xué)“息賁”“肺積”“勞咳”等范疇，其病位在肺。《醫(yī)宗必讀》言“積之成也，正氣不足，而后邪氣居之”，靶向藥物為中醫(yī)所言“藥毒”，具有溫?zé)嶂裕珊膫梭w氣陰，長期應(yīng)用可在一定程度上引起中醫(yī)證型改變。張志怡［22］發(fā)現(xiàn)接受TKI 治療后，中醫(yī)證候分布以氣虛（16.7%）﹑陰虛（16.7%）﹑痰濕（12.0%）為主要構(gòu)成。李丹博等［23］發(fā)現(xiàn)經(jīng)靶向治療后的63 例原發(fā)性肺癌患者肺氣陰兩虛證增多（39.68%）。根據(jù)EGFR-TKIs 治療后患者的證型分布情況，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)陰益氣是耐藥后患者的主要調(diào)理手段。

2.2 中醫(yī)臨床辨證論治

延緩耐藥時間是中醫(yī)藥的主要優(yōu)勢。生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫的1 項Meta 分析顯示，中醫(yī)藥聯(lián)合EGFR-TKIs 治療的總有效率﹑生活質(zhì)量改良率﹑1 年生存率等療效指標(biāo)均明顯優(yōu)于單用EGFRTKIs 治療［24］。同時，在153 例EGFR 突變的晚期NSCLC 患者的研究中，中藥聯(lián)合EGFR-TKIs 能延長無進展生存期，增強治療效果［25］。高瑞珂［26］對于中醫(yī)藥治療晚期NSCLC 的90 例患者進行回顧性研究和統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥延緩EGFR-TKIs耐藥的核心治則主要是補肺健脾﹑化痰散結(jié)，佐以清熱解毒。江冠銘等［27］將晚期 NSCLC 耐藥患者60 例分為單藥組（奧希替尼）和聯(lián)合組（人參皂苷Rg 聯(lián)合奧希替尼），發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組的PFS 為16 個月，高于單藥組。王瑩［28］發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組（益氣固表丸聯(lián)合靶向藥物）與單用靶向藥物相比，其PFS 更長。孫建立等［29］通過1 項隨機對照臨床研究發(fā)現(xiàn)養(yǎng)陰解毒顆粒聯(lián)合EGFR-TKIs 治療敏感突變的肺癌患者，其PFS 均優(yōu)于單純EGFR-TKIs 靶向治療，延長約2.2 個月。研究說明中醫(yī)藥在臨床治療上對延長靶向藥的耐藥時間具有極大的潛力。

除了延緩耐藥之外，中醫(yī)藥還能緩解EGFRTKIs 產(chǎn)生的不良反應(yīng)，并增強治療作用。EGFRTKIs 常見的不良反應(yīng)有腹瀉﹑皮疹等。1 項觀察性研究對146 例前3 個月內(nèi)接受EGFR-TKIs 治療的非小細(xì)胞肺癌患者進行研究，發(fā)現(xiàn)其中93.2%的患者出現(xiàn)皮膚毒性反應(yīng)［30］。彭姝蕾等［31］將80 例EGFR-TKIs 耐藥的晚期NSCLC 患者分為對照組（GP 化療）和聯(lián)合組（GP+扶正消瘤方），結(jié)果聯(lián)合組客觀緩解率為26%，臨床獲益率為36%，均優(yōu)于對照組，且消化道反應(yīng)﹑毒副反應(yīng)發(fā)生率均降低（P<0.05）。蘇運［32］觀察發(fā)現(xiàn)治療組（消風(fēng)散加味口服并外洗）改善EGFR-TKIs 相關(guān)性濕熱型皮疹優(yōu)于對照組（鹽酸米諾環(huán)素膠囊口服配合紅霉素軟膏外用）。石紅［33］通過前瞻性隨機對照研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)靶向治療后引起腹瀉的患者，試驗組予中藥腹瀉方治療，對照組予易蒙停治療，2 周后對照組與試驗組腹瀉緩解率分別達(dá)到76.67%和81.82%。研究表明中醫(yī)藥具有減毒增效的作用。

3 中醫(yī)藥聯(lián)合吉非替尼逆轉(zhuǎn)NSCLC 耐藥的機制研究

中醫(yī)藥聯(lián)合吉非替尼能延緩或逆轉(zhuǎn)靶向耐藥，主要是通過干預(yù)使耐藥細(xì)胞變敏感，抑制腫瘤生長，促凋亡，阻止腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的機制，對EGFR-TKIs 具有協(xié)同作用。

3.1 抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡

腫瘤是以細(xì)胞增殖異常為特點的疾病，細(xì)胞凋亡是指在生理或病理條件下由基因控制的細(xì)胞自主有序死亡，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖﹑促進腫瘤細(xì)胞凋亡是治療NSCLC 耐藥的關(guān)鍵。

3.1.1 中藥單體 丘韶校等［34］發(fā)現(xiàn)葫蘆素B 明顯抑制PC-9/GR 細(xì)胞的增殖能力，并呈劑量依賴性，且降低 p-Jak2﹑p-STAT3 的表達(dá)，因此，推斷葫蘆素B 通過抑制STAT3 信號通路來誘導(dǎo)吉非替尼耐藥NSCLC 的凋亡。Tang 等［35］發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷-d（SSD）聯(lián)合吉非替尼降低NSCLC 細(xì)胞增殖活力，誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡。此外，SSD 分別降低和提高了P-STAT3 和Bcl-2 的表達(dá)。下調(diào)STAT3后可促進肺癌細(xì)胞對吉非替尼的敏感性。表明SSD 的抗腫瘤機制與抑制STAT3/Bcl-2 信號通路有關(guān)。Ming 等［36］發(fā)現(xiàn)海帶主要活性成分巖藻黃質(zhì)（FX）對吉非替尼耐藥表型的肺癌細(xì)胞有明顯的抑制作用，體內(nèi)移植實驗證實FX 可抑制腫瘤生長，增強肺癌細(xì)胞對吉非替尼的敏感性，其作用機制可能與抑制腫瘤細(xì)胞增殖和激活細(xì)胞凋亡有關(guān)。此外，有研究表明miR345 和miR498 在吉非替尼耐藥的NSCLC 細(xì)胞中表達(dá)顯著降低，白藜蘆醇衍生物反式-3,5,4-三甲氧基二苯乙烯（TMS）聯(lián)合吉非替尼能通過上調(diào)miR-345/498 提高NSCLC 細(xì)胞對吉非替尼的敏感性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，miR345和miR498 通過細(xì)胞周期阻滯抑制增殖，并通過直接靶向調(diào)控MAPK/c-Fos 和AKT/Bcl-2 信號通路，提示TMS 可能通過上調(diào)miR-345/498 而抑制MAPK/Akt/Bcl-2 通路，從而降低非小細(xì)胞肺癌對吉非替尼的耐藥性［37］。

3.1.2 中藥復(fù)方 高欣［38］通過體外實驗發(fā)現(xiàn)康萊特注射液聯(lián)合吉非替尼可明顯抑制人肺腺癌H1299細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，Western Blot 結(jié)果顯示聯(lián)合組Bcl-2 蛋白降低，Bax 蛋白上升，提示其作用機制可能與上調(diào)Bax 的蛋白表達(dá)水平，下調(diào)Bcl-2的蛋白水平有關(guān)。Pan 等［39］通過體外實驗發(fā)現(xiàn)參芪扶正注射液（SFI）通過下調(diào)MAPK/SREBP1 通路對吉非替尼耐藥細(xì)胞具有協(xié)同的抗增殖和促凋亡作用。Chen 等［40］發(fā)現(xiàn)養(yǎng)陰解毒湯聯(lián)合吉非替尼組細(xì)胞凋亡率增加，且PI3K/Akt 下調(diào)。體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組抑制了腫瘤生長，TUNEL 染色陽性率高于吉非替尼單藥組，同時PI3K/Akt 下調(diào)，表明養(yǎng)陰解毒湯可能通過下調(diào)PI3K/Akt 信號通路逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥。

3.2 降低侵襲轉(zhuǎn)移能力

侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要因素，降低腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力是治療NSCLC耐藥的重要部分。

3.2.1 中藥單體 陳琦等［41］通過體外實驗發(fā)現(xiàn)欖香烯及肝細(xì)胞生長因子（HGF）聯(lián)合吉非替尼顯著抑制PC9 細(xì)胞的侵襲能力，Western Blot 結(jié)果顯示聯(lián)合組顯著抑制p-Met 和p-AKT 的蛋白表達(dá)，表明欖香烯逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥可能是通過抑制HGF 活化和影響c-MET 下游信號通路來實現(xiàn)的。詹建偉等［42］通過體外實驗發(fā)現(xiàn)姜黃素聯(lián)合吉非替尼可抑制HGF 誘導(dǎo)c-Met/AKT/mTOR 通路活化并逆轉(zhuǎn)PC9 細(xì)胞的遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。黃芪多糖可促進吉非替尼耐藥細(xì)胞的凋亡，降低其增殖和遷移能力。此外，黃芪多糖可增加E-cadherin的表達(dá)，降低N-cadherin 和vientin 的表達(dá)，提示其逆轉(zhuǎn)耐藥機制可能與抑制PD-L1/SREBP-1/EMT信號通路有關(guān)［43］。

3.2.2 中藥復(fù)方 蔣立峰等［44］研究發(fā)現(xiàn)清肺化瘀解毒方聯(lián)合吉非替尼降低耐藥細(xì)胞株A549/GR 的增殖能力，Western Blot 結(jié)果發(fā)現(xiàn)PI3K﹑AKT 蛋白表達(dá)量降低，qRT PCR 顯示PI3K﹑AKT 的mRNA 相對表達(dá)量顯著下降。表明清肺化瘀解毒方可能通過調(diào)控PI3K/AKT 信號通路逆轉(zhuǎn)吉非替尼獲得性耐藥。研究結(jié)果表明許多中藥單體能抑制癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡，證明了單藥作為抗癌藥物的潛力。相比之下，中藥復(fù)方的研究較少，而且存在一些局限性，如大多機制研究僅體現(xiàn)了蛋白表達(dá)的水平，動物實驗研究比較少，有待進一步研究。

4 中醫(yī)藥聯(lián)合奧希替尼治療NSCLC 耐藥的機制研究

中醫(yī)藥聯(lián)合奧希替尼延緩或逆轉(zhuǎn)靶向耐藥的研究較少，主要機制是抑制腫瘤生長﹑促凋亡﹑抑制癌細(xì)胞的干性。

Hu 等［45］發(fā)現(xiàn)紫草素聯(lián)合AZD9291 可以增強wtEGFR NSCLC 細(xì)胞凋亡，而紫草素作為ROS誘導(dǎo)劑，ROS 抑制劑NAC 或GSH 可逆轉(zhuǎn)紫草素聯(lián)合AZD9291 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，說明紫草素聯(lián)合AZD9291 的抗腫瘤活性與ROS 有關(guān)。Western-Blot發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組上調(diào)了ATF-4 和p-eif2α（ER -51）的表達(dá)，提示紫草素可能通過ROS 介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激提高奧希替尼對wtEGFR NSCLC 細(xì)胞的敏感性。Zang 等［46］發(fā)現(xiàn)厚樸酚（HNK）聯(lián)合奧希替尼使奧希替尼耐藥細(xì)胞系增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率明顯升高，將Mcl-1 過表達(dá)后奧希替尼耐藥細(xì)胞免受HNK 和奧西替尼聯(lián)合治療誘導(dǎo)的凋亡，而且聯(lián)合用藥對奧希替尼耐藥異種移植瘤（包括具有19del，T790M 和C797S 三重突變的裸鼠）生長抑制更明顯。說明厚樸酚能通過促進其降解而增強的Mcl-1 還原而增強耐藥細(xì)胞系對奧希替尼的敏感性。Tang 等［47］發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg3 降低H1975/OR 細(xì)胞的干度，明顯表現(xiàn)為降低了球形形成能力﹑干度標(biāo)記物的表達(dá)和ALDH1 活性。RNA測序數(shù)據(jù)顯示，Hippo 通路位于激活通路的頂部，人參皂苷Rg3 處理Hippo 通路激活成分MST1/2 和LATS1/2 的表達(dá)增加，由此可見人參皂苷Rg3 可能通過Hippo 通路抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的干性而逆轉(zhuǎn)對奧希替尼的耐藥。Hu 等［48］發(fā)現(xiàn)金絲桃苷抑制了T790M 陽性NSCLC 細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，上調(diào)了FoxO1 的表達(dá)，下調(diào)lncRNA 結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（CCAT1）的水平。同時金絲桃苷抑制了T790M 陽性NSCLC 移植瘤的生長。提示金絲桃苷可能是通過CCAT1 上調(diào)FoxO1 后在T790M 突變的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中顯示出抗癌活性。Cao 等［49］發(fā)現(xiàn)蟾蜍靈聯(lián)合奧希替尼有效地恢復(fù)了奧希替尼耐藥肺腺癌細(xì)胞株P(guān)C9/OR 和HCC827/OR 的藥物敏感性，將PC9/OR 細(xì)胞過表達(dá)MCL-1 后消除了蟾毒靈誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，Ku70 過表達(dá)后顯著抑制蟾毒靈誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和MCL-1 表達(dá)，表明奧希替尼和蟾蜍靈聯(lián)合可能是通過抑制Ku70 介導(dǎo)的MCL-1 過表達(dá)消除對奧希替尼的耐藥性。

近年來，中醫(yī)藥復(fù)方聯(lián)合奧希替尼治療NSCLC獲得性耐藥的研究較為少見，但是中藥復(fù)方多靶點﹑多層次的藥效特點仍具有極大的治療潛力，值得進一步研究。

5 小結(jié)

肺癌仍是全球癌癥死亡的主要原因，EGFRTKIs 的引入顯著改善了EGFR 突變的晚期NSCLC患者的預(yù)后。EGFR-TKIs 獲得性耐藥難以避免且其機制復(fù)雜，目前治療EGFR-TKIs 獲得性耐藥的方法不多。中藥具有多途徑﹑多層次﹑多靶點﹑不易耐藥等特點，能調(diào)控多個下游通路達(dá)到抗腫瘤的目的。此外，中藥在改善EGFR-TKIs 的不良反應(yīng)，延緩甚至逆轉(zhuǎn)EGFR-TKIs 耐藥方面具有獨特作用。雖然目前較多臨床研究證實中藥協(xié)同EGFRTKIs 抗NSCLC 耐藥有顯著作用，但仍缺乏臨床前瞻性﹑多中心﹑大樣本的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，說服力尚不充足。中藥抗NSCLC 的耐藥機制主要集中在臨床驗證及藥效學(xué)研究階段，不少研究探索了其作用機制及通路，但逆轉(zhuǎn)和延緩耐藥機制大多為下游靶點的激活，機制比較單一化，缺乏權(quán)威性的論證。筆者認(rèn)為中醫(yī)藥在抗腫瘤耐藥領(lǐng)域具有巨大潛力，深入探索中醫(yī)藥治療NSCLC 耐藥的辨證論治體系和機制，以及臨床的安全和有效性非常重要。