七方胃痛顆粒對人胃腺癌細胞的抑制作用及可能機制▲

黃旭平 黃菊芳 黎敏航 楊 爽 羅偉生

(1 廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院消化內科,廣西南寧市 530011; 2 廣西中醫藥大學研究生院,廣西南寧市 530001)

胃癌是世界范圍內常見的惡性腫瘤之一[1],根據國際癌癥研究機構的調查,2020年全球新增癌癥病例1 930萬例,其中胃癌占5.7%,胃癌的新增病例數和死亡病例數在所有癌癥中分別位居第5、第3[2]。據GLOBOCAN 2020統計,2020年我國胃癌新增病例約478 508例(男性331 629例,女性146 879例),位居全球第一,約有373 789人死于該病[2]。多數胃癌患者確診時已錯過手術根治時機,因此新輔助化療成為中晚期胃癌的重要治療手段,盡管經新輔助化療后患者總生存期有所改善,但仍然存在較高的復發率[3]。研究顯示,人表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor,HER)家族由HER1[編碼HER1蛋白或表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)]、HER2(編碼HER2蛋白)、HER3(編碼HER3蛋白)和HER4(編碼HER4蛋白)4個密切相關的成員組成,是細胞信號轉導的必要條件,可調控細胞分化、增殖、遷移、黏附、修復和血管再生等過程,在腫瘤細胞的增殖和凋亡中起關鍵作用[4]。HER家族成員在胃癌中往往過度表達與激活,尤其是EGFR和HER2[5]。HER家族蛋白形成自二倍體或異二倍體后,主要通過激活下游磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)信號通路,來促進癌細胞增殖,抑制細胞凋亡[6-7]。因此推測HER信號通路是治療胃癌的關鍵靶點,如針對HER2的曲妥珠單抗已被證實可顯著改善HER2陽性胃癌患者的預后[8]。故本研究選取人胃腺癌細胞系AGS進行體外研究,觀察七方胃痛顆粒對AGS細胞凋亡、細胞周期的影響,以及對HER信號通路和下游PI3K/AKT信號通路的影響,為七方胃痛顆粒的基礎研究及臨床應用提供一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞系 AGS細胞購自上海生命科學院。使用含10%胎牛血清、100 kU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養基,置于37℃、5% CO2培養箱常規培養AGS細胞。

1.2 主要試劑及儀器 七方胃痛顆粒組方包括紅參10 g、白術10 g、生黃芪30 g、茯苓10 g、炙甘草9 g、白芍30 g、炒雞內金10 g、枳實12 g、木香6 g、黃連6 g、吳茱萸3 g、丹參10 g,由廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院制劑室將免煎中藥顆粒(江陰天江藥業有限公司生產)混勻后滅菌包裝,每小袋8 g。順鉑(Sigma-Aldrich Lab &Product Materials公司,批號:MKCM2345),胎牛血清(Gibco公司,批號:10099242C),RPMI-1640培養基(Gibco公司,批號:C11873600CP),青霉素和鏈霉素(北京索萊寶科技有限公司,批號:20200119、20191108)。Annexin Ⅴ-APC/7-ADD細胞凋亡檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司,批號:20201019),細胞周期檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司,批號:20191225),Hifair?Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit[翌圣生物科技(上海)股份有限公司,批號:11141ES60],Hieff ? qPCR SYBR? Green Master Mix(No Rox)[翌圣生物科技(上海)股份有限公司,批號:11184ES08],RIPA高效裂解液和蛋白酶抑制劑(北京索萊寶科技有限公司,批號:20200525、20200110),辣根過氧化物標記的二抗(北京中杉金橋生物有限公司,批號:C0919)。EGFR抗體(批號:AB52894)、HER2抗體(批號:AB134182)、HER3抗體(批號:AB32121)、HER4抗體(批號:AB32375)、AKT抗體(批號:AB179463)、PI3K抗體(批號:AB32089)、β-actin抗體(批號:AB8227)均購自Abcam公司。全自動凝膠成像分析系統(上海培清科技有限公司,型號:JS-380),K2800核酸分析儀(北京凱奧科技發展有限公司),流式細胞儀(Becton,Dickinson and Company,型號:BD Calibur),實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司,型號:ABI 7500)。

1.3 實驗方法

1.3.1 七方胃痛顆粒含藥血清的制備:取20只健康清潔級SD大鼠[湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,許可證號:SCXK(湘)2020-0002;體重(200±10)g,均為雄性],適應性飼養觀察1周。大鼠每日的七方胃痛顆粒用量按成人劑量的0.018倍計算[9]。將七方胃痛顆粒用生理鹽水稀釋,配制成濃度為2 g/mL的七方胃痛顆粒混懸溶液,然后給予大鼠灌胃處理,劑量為1 mL/100 g,2次/d,連續灌胃5 d,末次灌胃結束后禁食1 h,然后在無菌條件下從腹腔采集靜脈血5 mL,靜置3～4 h后,4 ℃下3 000 r/min離心20 min,超凈臺上分離血清,將分離得到的血清置于56 ℃水浴中30 min滅活,用0.22 μm濾器過濾,-70 ℃冷藏備用。后續實驗時將血清加入RPMI-1640培養基中,分別配制成含100 mL/L、200 mL/L、300 mL/L (即10%、20%、30%)藥物血清的培養基。

1.3.2 實驗分組及干預措施:取對數生長期的AGS細胞接種到6孔板中,2 mL/孔,每孔約含3×105個細胞。將AGS細胞隨機分為5組[空白對照組、陽性對照組(順鉑組)、10%含藥血清組、20%含藥血清組、30%含藥血清組]。將各組細胞置于37℃、5% CO2培養箱培養24 h后,棄去舊培養基,使用PBS清洗2次。空白對照組加入1 mL RPMI-1640溶液,各含藥血清組分別加入1 mL對應濃度含藥血清,陽性對照組加入1 mL濃度為4 μg/mL的順鉑[10]。將各組細胞置于37 ℃、5% CO2培養箱繼續培養48 h。

1.3.3 流式細胞儀測定細胞凋亡及細胞周期:(1)細胞凋亡檢測。取1.3.2干預后的各組細胞,加入0.5 mL 0.25%胰酶(不含乙二胺四乙酸)消化約30 s后收集至離心管中。加入適量PBS輕柔清洗2次,對細胞進行計數后,將其密度調整為約1×106個細胞/mL。取0.5 mL細胞懸液轉移到干凈的離心管內,37 ℃下1 500 r/min離心5 min后加入500 μL Binding buffer重懸,再加入5 μL Annexin Ⅴ-APC及5 μL 7-AAD,輕柔吹勻后室溫下避光反應10 min后,將樣本放置在冰上避光保存,采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況,并采用FlowJo軟件分析細胞凋亡率。其中Annexin Ⅴ-APC(-)/7-ADD(+)為壞死細胞,主要是實驗過程中發生機械損傷的細胞,不納入計算;Annexin Ⅴ-APC(+)/7-ADD(+)為中晚期凋亡細胞;Annexin Ⅴ-APC(+)/7-ADD(-)為早期凋亡細胞;Annexin Ⅴ-APC(-)/7-ADD(-)為未發生凋亡細胞。總凋亡率=早期凋亡細胞率+中晚期凋亡細胞率。實驗重復3次。(2)細胞周期檢測。取1.3.2干預后的各組細胞,加入0.5 mL 0.25%胰酶消化約30 s后收集至離心管中,加入適量PBS輕柔清洗2次,對細胞進行計數后,將其密度調整為約1×106個細胞/mL。取1 mL細胞懸液轉移到干凈的離心管內,4 ℃下1 500 r/min離心5 min后棄上清液,加入500 μL預冷的70%乙醇固定細胞,4 ℃冰箱過夜。4 ℃下1 500 r/min離心5 min后收集細胞,使用PBS洗滌細胞2次后, 再次4 ℃下1 000 r/min離心3 min。然后加入500 μL PBS(含50 μg/mL溴化丙錠,100 μg/mL RNase A,0.2% Triton X-100,預先配置),4 ℃避光孵育30 min。按照標準程序,采用流式細胞儀檢測激發波長為488 nm處的熒光反應,采用ModFit軟件分析細胞周期分布情況。實驗重復3次。

1.3.4 Western blot檢測蛋白表達情況:采用RIPA高效裂解液裂解1.3.2干預后的各組細胞,提取細胞蛋白,采用K2800核酸分析儀測定蛋白含量。取30 μg蛋白進行SDS-PAGE,將蛋白樣本轉移至PVDF膜上,5%脫脂牛奶常溫封閉1.0～1.5 h,使用PBST洗滌3次,5 min/次。然后加入β-actin(1 ∶10 000)、EGFR(1 ∶10 000)、HER2(1 ∶1 000)、HER3(1 ∶1 000)、HER4(1 ∶10 000)、AKT(1 ∶10 000)、PI3K(1 ∶1 000)抗體(均為1 μL),4 ℃過夜。使用PBST洗滌3次,5 min/次,然后加入1 μL辣根過氧化物酶標記的二抗(1 ∶5 000),常溫下脫色搖床搖1 h,PBST洗滌3次,5 min/次。采用二氨基聯苯胺顯色,凝膠成像系統成像拍照,Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。實驗重復3次。

1.3.5 實時熒光定量PCR檢測mRNA相對表達水平:使用TRIzol法提取1.3.2干預后的各組細胞總RNA,測定其純度后,按照試劑盒說明書進行反轉錄。PCR反應體系包括Hieff?qPCR SYBR?Green Master Mix(No Rox) 10 μL、上游引物 (10 μmol/L)0.4 μL、下游引物(10 μmol/L) 0.4 μL、cDNA 2 μL、無酶水7.2 μL,總共20 μL。反應條件為95 ℃預變性5 min,95 ℃變性10 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s(共40個循環)。以β-actin為內參,采用2-△△CT法計算各基因mRNA表達水平。引物序列見表1。實驗重復3次。

表1 PCR引物序列

1.4 統計學分析 采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,進一步組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 七方胃痛顆粒對AGS細胞凋亡的影響 與空白對照組相比,順鉑組AGS細胞的早期凋亡率、中晚期凋亡率及總凋亡率均升高,20%含藥血清組AGS細胞的中晚期凋亡率升高,30%含藥血清組AGS細胞的中晚期凋亡率及總凋亡率升高(均P<0.05)。見圖1和表2。

圖1 5組AGS細胞凋亡情況

表2 5組AGS細胞凋亡率的比較(x±s,%)

2.2 七方胃痛顆粒對AGS細胞周期的影響 與空白對照組相比,其他各組細胞的G0/G1期比例升高、S期比例降低,且順鉑組細胞的G2/M期比例降低(均P<0.05),而10%含藥血清組、20%含藥血清組、30%含藥血清組的G2/M期比例與空白對照組相比,差異無統計學意義(均P>0.05)。見圖2和表3。

圖2 5組AGS細胞周期變化情況

表3 5組AGS細胞周期的比較(x±s,%)

2.3 七方胃痛顆粒對HER信號通路及下游PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達的影響 與空白對照組比較,順鉑組AGS細胞的EGFR、HER2、HER3、HER4、AKT、PI3K蛋白表達水平均下降,10%含藥血清組AGS細胞的HER4蛋白表達水平下降,20%含藥血清組AGS細胞的EGFR、HER4蛋白表達水平均下降,30%含藥血清組AGS細胞的EGFR、HER2、HER3、HER4、AKT、PI3K蛋白表達水平均下降(均P<0.05)。見圖3和表4。

圖3 5組AGS細胞中HER信號通路及PI3K/AKT信號通路相關蛋白的表達情況

表4 5組AGS細胞HER信號通路及PI3K/AKT信號通路相關蛋白相對表達水平的比較(x±s)

2.4 七方胃痛顆粒對HER信號通路、PI3K/AKT信號通路相關基因表達的影響 與空白對照組相比,順鉑組、10%含藥血清組、20%含藥血清組、30%含藥血清組AGS中的EGFR、HER2、HER3、HER4、PI3K、AKT的mRNA表達水平均下降(均P<0.05)。見表5。

表5 5組AGS細胞HER信號通路、PI3K/AKT信號通路相關基因mRNA相對表達水平的比較(x±s)

3 討 論

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤,絕大多數胃癌屬于腺癌,早期可出現上腹脹滿不適、噯氣反酸、燒心感等非特異性消化道癥狀,因與胃炎、胃潰瘍等疾病的臨床癥狀相似,易被忽略。中醫將胃癌納入“胃脘痛”“痞滿”“噎膈”“反胃”等范疇。《金匱要略》記載“朝食暮吐,暮食朝吐,宿谷不化,名曰胃反”,這與胃癌晚期幽門梗阻的癥狀較為相似。《濟生方》描述“伏梁之狀,起于臍下,其大如臂,上至心下,猶梁之橫架于胸膈者,是為心積……其病腹熱而赤,甚則吐血,令人食少饑瘦”,這與胃癌中期出現的胃痛、食少、嘔血、消瘦及癌腫的癥狀相似。西醫認為胃癌與飲食、幽門螺桿菌感染、遺傳等因素有關[11]。中醫認為胃癌與外因、內因均相關,常因寒溫不適、飲食失調、脾胃損傷、憂思郁結、肝失疏泄、脾失健運、胃失和降、日久交阻、濕熱互結、氣滯血瘀而致癌。由于病期早晚不同,所表現癥狀不同,在治療上應重視辨證與辨病、扶正與驅邪、局部與整體相結合的原則[12]。

羅偉生教授結合胃癌的病因、病機及個人長期臨床實踐,創制七方胃痛顆粒,該方結合了7個經典方劑的特點,取四君子湯之健脾益氣、丹參飲之活血化瘀、左金丸之清肝瀉火、逍遙散之疏肝解郁、枳實芍藥散之行氣活血、枳術丸之健脾消痞、木香檳榔丸之行氣導滯,縱觀全方,肝脾胃同治,同時活血化瘀、行氣導滯、清蘊結濁毒,降胃腑之濁氣,利脾胃之氣[13]。既往研究顯示,該方不僅能夠抑制AGS細胞發生上皮-間質轉化[14],通過影響SGC-7901細胞的Fas/FasL通路促進其凋亡[15],還可以顯著降低胃癌Wistar大鼠的病死率[16]。但其抗癌作用的分子生物學機制尚無詳細研究。本研究結果顯示,七方胃痛顆粒20%含藥血清、30%含藥血清能提高AGS細胞的中晚期凋亡率(P<0.05),說明七方胃痛顆粒對AGS細胞具有一定的促凋亡作用。

研究表明,EGFR在多種惡性腫瘤細胞的表面過表達,能通過多種途徑促進癌細胞的侵襲,是治療胃癌的重要靶點,同時也是療效分析及預后評估的重要標志物[17]。腫瘤組織中的一些蛋白因子(如表皮生長因子等)可激活EGFR,活化的EGFR可激活其下游信號通路(如PI3K/AKT信號通路)[18],促進癌細胞的增殖和分化,最終導致腫瘤的發生和腫瘤血管形成[19]。從本研究結果可以看出,一定濃度的七方胃痛顆粒含藥血清能直接減少AGS細胞中EGFR基因的轉錄,降低其蛋白的表達,從源頭上抑制該信號通路的激活。HER2是重要的原癌基因,在胃的癌前病變中其表達水平明顯升高[20],其編碼產物在與自身或其他HER家族蛋白(如HER3等)結合形成同源或異源二倍體后,可進一步激活下游信號通路(如PI3K/AKT信號通路)[21],抑制細胞凋亡及加速細胞周期,從而促進癌細胞的增殖。本研究結果顯示,給予七方胃痛顆粒含藥血清干預后,AGS細胞周期被阻滯在G0/G1期,而HER2、PI3K、AKT的蛋白表達水平及基因轉錄水平均降低,說明七方胃痛顆粒具有抑制AGS細胞增殖的作用,作用機制可能是七方胃痛顆粒通過抑制HER2的同源或異源二倍體的形成,從而無法激活下游PI3K/AKT信號通路。HER3在胃癌組織中常過度表達,已被證實對胃癌的進程起到重要作用[22]。本研究結果顯示,七方胃痛顆粒30%含藥血清可下調AGS細胞的HER3蛋白表達水平(P<0.05),且各濃度的七方胃痛顆粒含藥血清均使得AGS細胞的HER3基因轉錄水平降低(P<0.05),提示七方胃痛顆粒可能通過下調相關基因的轉錄,進而減少AGS細胞內HER通路相關蛋白的表達,從而起到調控HER信號通路的作用。HER4由HER4基因編碼,其通過自體磷酸化參與細胞信號的傳遞,進而調節細胞的生長與分裂。HER4在多種惡性腫瘤中表達上調,在腫瘤的增殖、轉移和耐藥等中發揮重要作用,促進胃癌的發生和發展,與胃癌預后密切相關[23]。在本研究中,七方胃痛顆粒含藥血清干預后,AGS細胞的HER4蛋白和mRNA 的表達水平均降低,說明調控HER4的表達可能也是七方胃痛顆粒治療胃癌的機制之一。

綜上所述,七方胃痛顆粒能促使AGS細胞發生中晚期凋亡,使細胞周期阻滯在G0/G1期,其可能通過抑制HER信號通路及下游PI3K/AKT信號通路的激活,抑制AGS的增殖。