晚期食管鱗狀細胞癌患者外泌體PD-1/PD-L1 的表達與PD-1 單抗免疫治療效果的關系

沈輝，陸坤，陳茜，辛勇

食管癌為癌癥相關性死亡的第6 大主要原因，流行病學調查結果顯示，其發病率呈逐年上升的趨勢，給人類的健康帶來巨大威脅［1］。食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是一種常見的食管癌病理類型，約占食管癌的90%［2］。近年來，隨著免疫治療的快速發展，免疫檢查點抑制劑在胃癌等多種惡性腫瘤的療效已被證實，免疫檢查點抑制劑主要針對細胞毒性T 淋巴細胞相關蛋白-4（cytotoxic T lymphocyte-associated protein-4，CTLA-4）、程序性細胞死亡受體1（programmed cell death receptor 1，PD-1）、PD 配體1（PD-ligand 1，PD-L1）［3］。PD-1 主要分布于NK 細胞、B 細胞以及T細胞中，PD-L1 可與PD-1 結合來抑制抗腫瘤免疫應答，從而發揮增強局部抗腫瘤功能［4］。免疫檢查點抑制劑納武單抗為抗PD-1 IgG4 單克隆抗體，其在非小細胞癌、肝細胞癌、ESCC 等多種惡性腫瘤中取得良好療效，但部分患者5 年生存率仍不甚理想［5］。外泌體為一種細胞外囊泡（直徑為30～100 nm），腫瘤早期大量外泌體會進入循環細胞，檢測外泌體上PD-1、PD-L1 有助于疾病的精準治療與早期診斷［6］。目前，國內有關晚期ESCC 患者外泌體PD-1/PD-L1的表達與PD-1 單抗免疫治療效果的關系的研究較少，為此，本研究選取收治的95 例晚期ESCC 患者進行研究。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019 年2 月至2021 年11 月徐州醫科大學附屬宿遷醫院收治的95 例晚期ESCC 患者為研究對象。納入標準：（1）均符合《中國早期食管鱗狀細胞癌及癌前病變篩查與診治共識（2015 年，北京）》［7］中ESCC 的診斷標準，且均經術后病理學證實；（2）均行PD-1 單抗免疫治療；（3）至少有1 個可測量病灶；（4）預計生存期＞3 個月；（5）美國東部腫瘤協作組活動狀態評分0～1 分；（6）均簽署知情同意書。排除標準：（1）中樞神經系統轉移；（2）活動性感染；（3）獲得性或先天性免疫功能缺陷；（4）合并其他類型惡性腫瘤者；（5）有自身免疫疾病史；（6）肝腎等臟器功能不全者；（7）間質性肺炎；⑧伴遠處轉移者。

1.2 研究方法

1.2.1 治療方法 95 例患者均接受PD-1 單抗免疫治療。靜脈輸注卡瑞利珠單抗（批準文號：S20190027，蘇州盛迪亞生物醫藥有限公司，規格為200 mg/支）1 支/次，靜脈輸注時間大于30 min，每3 周1 次，持續用藥至患者不能耐受或疾病進展。

1.2.2 外泌體PD-1、PD-L1 的表達的檢測方法 通過乙二胺四乙酸抗凝管采集患者4 ml 靜脈血，于4 ℃下2 000 g 離心20 min，取上清液（血漿）用1.5 ml EP 管分裝，于-80 ℃冰箱中保存，通過超速離心法從血漿中分離外泌體（離心半徑為8 cm），首先300 g離心10 min，隨后2 000 g 離心10 min，然后10 000 g離心30 min，最后將上清液100 000 g 離心70 min，離心完成后將外泌體重懸于磷酸鹽緩沖液中，于-80 ℃冰箱中保存。采用FACSCanto Ⅱ流式細胞儀（美國BD 公司）測定表型，圈出CD14 單核細胞門，建立針對CD14-FITC/PD-1-PE 與CD14-FITC/PD-L1-PE 的峰圖，分析外泌體PD-1、PD-L1 表達率。

1.2.3 治療效果判定 治療3 個療程后，參照《實體瘤免疫治療療效評價標準》［8］，根據患者治療效果分為有效組（n=43）與無效組（n=52）。完全緩解：原病灶及臨床癥狀消失，且持續超過4 周，部分緩解：原病灶縮小＞50%，臨床癥狀明顯改善，且持續超過4 周，疾病穩定：原病灶增幅≤25% 或增大≤50%，臨床癥狀未見減輕，且持續超過4 周，疾病進展：原病灶增大＞25%或出現新病灶，臨床癥狀惡化。其中，部分緩解與完全緩解記為有效；疾病進展與疾病穩定記為無效。

1.2.4 收集資料 收集可能影響晚期ESCC 患者PD-1 單抗免疫治療無效的危險因素，包括年齡、性別、吸煙史、飲酒史、基礎疾病（高血壓、高脂血癥、糖尿病）、腫瘤最大直徑、腫瘤部位（頸椎、胸椎、腹部）、淋巴結是否轉移、T 分期、分化程度、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、癌胚抗原（carcino embryonic antigen，CEA）、神經元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）、細胞角蛋白19 片段抗原21-1（cytokeratin 19 fragment antigen21-1，Cyfra21-1）、外泌體PD-1、PD-L1 表達率。

1.3 觀察指標

（1）比較有效組與無效組的臨床資料；（2）分析晚期ESCC 患者PD-1 單抗免疫治療無效的危險因素；（3）分析外泌體PD-1、PD-L1 表達率對晚期ESCC 患者PD-1 單抗免疫治療無效的預測價值。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 有效組與無效組的臨床資料比較

無效組年齡、低分化例數占比、CEA、外泌體PD-1 表達率和PD-L1 表達率高于有效組（P＜0.05）。見表1。

表1 有效組與無效組晚期食管鱗狀細胞癌患者的臨床資料比較

2.2 晚期ESCC 患者PD-1 單抗免疫治療無效的危險因素

以年齡、分化程度、CEA、外泌體PD-1 表達率、PD-L1 表達率為自變量（賦值情況：年齡、CEA、外泌體PD-1 表達率、PD-L1 表達率為連續變量；分化程度：低分化=1，中高分化=0），以晚期ESCC 患者PD-1 單抗免疫治療效果為因變量進行Logistic 多因素回歸分析（賦值情況：無效=1，有效=0），結果顯示，年齡、低分化、外泌體PD-1 表達率、PD-L1 表達率為晚期ESCC 患者PD-1 單抗免疫治療無效的危險因素（P＜0.05）。見表2。

2.3 外泌體PD-1、PD-L1 表達率對晚期ESCC 患者PD-1 單抗免疫治療無效的預測價值

ROC 曲線結果顯示，外泌體PD-1、PD-L1 表達率預測晚期ESCC 患者PD-1 單抗免疫治療無效的AUC 值（95%CI）分 別 為0.785（0.689～0.863）、0.706（0.604～0.795），差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 外泌體PD-1、PD-L1 表達率對晚期食管鱗狀細胞癌患者PD-1 單抗免疫治療無效的預測價值

3 討論

晚期ESCC 已錯過最佳手術時間，臨床上常采用化療來提高患者的生存率。PD-1 單抗免疫治療為一種新型的惡性腫瘤治療模式，其在ESCC、非小細胞肺癌等多種惡性腫瘤中取得良好效果［9］。但部分患者的腫瘤細胞能夠通過多種機制來逃避免疫殺傷，嚴重影響PD-1 單抗免疫治療效果［10］。PD-1能夠調節相關細胞凋亡與活化；PD-L1 通常表達于腫瘤中活躍的T 細胞炎癥區域中，其在免疫細胞與腫瘤細胞上表達能夠抑制T 細胞抗腫瘤反應，進而抑制腫瘤生長［11］。臨床研究表明，外泌體PD-1/PDL1 表達與多種惡性腫瘤的預后密切相關，然而二者可用于評估接受PD-1 單抗免疫治療的ESCC 患者的效果目前尚不清楚，鑒于此，本研究特采用前瞻性研究進行分析，期望為指導臨床治療提供一定的參考價值［12］。

本研究結果顯示，無效組年齡、低分化例數占比、CEA、外泌體PD-1、PD-L1 表達率高于有效組，Logistic 多因素回歸分析結果顯示，年齡、低分化、外泌體PD-1、PD-L1 表達率為晚期ESCC 患者PD-1單抗免疫治療無效的危險因素。隨著年齡的增長，人體的免疫功能逐漸下降，年齡較高的晚期ESCC患者免疫功能較低，即使采用PD-1 單抗免疫治療，其預后不良的風險仍然較高。低分化的晚期ESCC患者腫瘤惡性程度高，臨床治療難度較高，多數患者治療效果不佳。外泌體PD-L1 為PD-1 單抗免疫治療的重要靶點，其可與PD-1 結合，發揮負性調節作用，使T 細胞無法正常活化，抑制CD4+T 細胞功能，從而影響患者抗腫瘤作用［14］。相關研究表明，外泌體PD-L1 能夠調節腫瘤細胞自身的生物學行為，參與腫瘤的發生、發展及預后其在多種惡性腫瘤中異常表達［15-16］。相關研究表明，在抗PD-1 治療前檢測黑色瘤患者外泌體PD-L1 蛋白，結果顯示，低水平外泌體PD-L1 蛋白的患者通常表現為部分應答或完全應答，而對治療無響應的患者外泌體PD-L1 蛋白水平一般很高［17］。另有研究表明，外泌體外泌體PD-L1mRNA 表達水平與非小細胞肺癌、黑色素瘤患者抗PD-1 治療響應密切相關，經PD-1單抗治療后，病情穩定組外泌體PD-L1mRNA 表達水平降低不明顯，而響應組外泌體PD-L1mRNA 表達水平明顯下降，而病情惡化組PD-L1mRNA 表達水平異常升高［18］。既往研究證實，Cyfra21-1、CEA等腫瘤標志物可用于評估和診斷ESCC 進展，然而生物標志物靈敏度較低［19-20］，本研究結果未證實Cyfra21-1、CEA 與PD-1 單抗免疫治療效果密切相關，可能與樣本量、病情嚴重程度等因素有關。此外，本研究結果顯示，外泌體PD-1、PD-L1 表達率預測晚期ESCC 患者PD-1 單抗免疫治療無效的AUC 值（95%CI）分 別 為 0.785（0.689～0.863）、0.706（0.604～0.795），提示晚期ESCC 患者外泌體PD-1、PD-L1 表達可用于評估PD-1 單抗免疫治療效果，值得推廣使用。

綜上所述，晚期ESCC 患者外泌體PD-1、PD-L1表達在預測PD-1 單抗免疫治療效果中具有重要價值。然而，本研究納入病例較少，仍需擴大樣本，進一步證實研究結果。