TRV027在血管緊張素Ⅱ下調心肌細胞縫隙連接蛋白43表達中的作用

陳馨嶸 范鑫 司丹妮 王明明 龍章佑 孫潤民 余靜

腎素-血管緊張素系統（Renin-angiotensin system，RAS）是調節、參與心血管系統功能和結構變化的重要組成部分，對心血管功能穩態、電解質和體液平衡的維持，以及血壓的調節均有重要作用。血管緊張素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）作為RAS 的關鍵調節因子，在病理狀態下，可直接與心肌細胞膜上的Ang Ⅱ1 型受體（Angiotensin Ⅱtype 1 receptor，AT1R）結合，增加細胞內活性氧的產生，促進細胞肥大、凋亡，引起細胞內質網應激和抑制自噬等，最終影響心肌細胞的結構和功能[1～3]。

縫隙連接蛋白43（Connexin 43，Cx43）是心肌細胞間縫隙連接的主要蛋白成分，在成熟的心肌細胞中，Cx43 主要位于心肌細胞閏盤上，能在心肌細胞之間傳遞電流、允許化學信號和能量底物交換，是協調細胞功能所必需的結構[4]。AngⅡ可以通過減少心肌細胞Cx43 的表達而引起心肌結構和功能的異常改變[5～8]。

TRV027 是一種新型AT1R 偏向性配體，能夠競爭性阻斷AngⅡ與AT1R 的結合、選擇性地激活β-arrestin 通路，從而抑制AngⅡ介導的交感神經興奮、血管收縮、水鈉潴留等，并且可以增強心肌細胞的收縮能力，增加心輸出量，改善心功能[9～11]。因此本研究針對AngⅡ與Cx43 之間的關系，探索TRV027 是否通過抑制Ang Ⅱ并激活β-arrestin 通路對心肌細胞Cx43 產生影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗對象 選取大鼠心肌細胞H9C2 細胞株（和元生物技術股份有限公司）作為研究對象，細胞培養于含10%胎牛血清（美國Gibco 公司）、1%雙聯抗生素（鏈霉素、青霉素，美國Gibco 公司）的DMEM 高糖培養基，培養條件為37℃、5%CO2，選取第3～5 代細胞進行實驗。

1.1.2 主要試劑和儀器 Ang Ⅱ、TRV027（美國AbMole 公司），GAPDH、β-arrestin 抗體、熒光二抗（中國Proteintech 公司），Cx43 抗體（美國abcam 公司），TBgreen（中國TaKaRa 公司）；電泳儀、Bio-Tek 酶標儀（美國Bio-tek 公司），全自動化學發光圖像處理系統（中國天能科技公司），實時熒光定量PCR 儀（美國Bio-rad 公司），倒置熒光顯微鏡（日本OLYMPUS 公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及處理方法 將H9C2 細胞分為對照組、AngⅡ組、TRV027 組、AngⅡ+TRV027 組。AngⅡ組用1×10-5mol/L Ang Ⅱ干預48h；TRV027 組用1×10-8mol/L TRV027 干預24h；Ang Ⅱ+TRV027組用1×10-5mol/L AngⅡ干預24h 后，給予1×10-8mol/L TRV027 干預24h，對照組細胞正常培養，無藥物干預。1.2.2 蛋白質印跡（WB）法檢測Cx43 和β-arrestin在H9C2 細胞內的表達 將四組細胞培養至6 孔板中，干預48h，收集細胞，加入裂解液，冰上裂解30min，12 000r/min 4℃離心20min，收集上清，按照BCA 試劑盒說明書測定蛋白濃度、計算上樣蛋白量，進行SDS-PAGE 電泳，結束后將蛋白轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1.5h，TBST 洗膜，加入稀釋的Cx43 一抗（1:1 000）和β-arrestin 一抗（1:700），4℃孵育過夜，TBST 洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1h，TBST 洗膜，將ECL 超敏化學發光液滴加于膜上，顯影、定影、拍照。用ImageJ 計算Cx43 蛋白相對表達水平。

1.2.3 RT-PCR 檢測H9C2 細胞中Cx43、β-arrestin mRNA 的表達 將四組細胞培養至6 孔板中，干預48h，按照Trizol 試劑盒說明書提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，取逆轉錄模板進行PCR 擴增。反應體系包括：模板cDNA 2μl，上下游引物各0.1μl，Taq DNA 聚合酶12.5μl，滅菌水8.5μl。擴增條件：95℃預變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共40 個循環。Cx43 上游引物：正向：5'-TGAAG TTCAGACAAGGCTCAAAGA-3'，反向：5'-AATGTTGA TAGAAGCCGTTTGGTG-3'；β-arrestin 上游引物：正向：5'-TGGGCAACTCAAGCACGAA-3'，反向：5'-AGCTT CACCTTGACCCTGTAGGA-3'。以β-actin 為內參基因，采用2-△△CT法計算Cx43、β-arrestin mRNA相對表達水平。

1.2.4 免疫熒光法觀察H9C2 細胞 將四組H9C2 細胞培養至24 孔板中，干預48h，用4%多聚甲醛固定30min，用PBS清洗5次，每孔加300μl 0.1%Triton（Cx43 檢測組不加Triton），用PBS 清洗5 次，加入10%正常山羊血清37℃溫箱封閉1.5h，滴加一抗100μl（Cx43 1:400，β-arrestin 1:200），置于4℃冰箱搖床孵育過夜，次日取出至室溫復溫1h，PBS 清洗5 次，加入熒光二抗100μl（1:400），室溫避光孵育1h，PBS 清洗5 次，用1:10 染色5min，PBS 清洗5 次，置于熒光顯微鏡下應用FITC 通道觀察H9C2細胞內Cx43、β-arrestin 的蛋白表達情況，DAPI 通道觀察細胞核染色。用ImageJ 計算細胞內Cx43、β-arrestin 的相對表達水平。

1.3 統計學方法采用統計學軟件SPSS 22.0 分析數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間兩兩比較采用LSDt檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組Cx43 和β-arrestin 的蛋白水平比較AngⅡ組H9C2 細胞Cx43（t=6.425、P=0.003）和β-arrestin（t=4.511、P=0.0004）的蛋白表達量明顯低于對照組；Ang Ⅱ+TRV027 組H9C2 細胞Cx43（t=-6.530、P=0.0001）和β-arrestin（t=-7.982、P=0.00001）的蛋白表達量明顯高于Ang Ⅱ組；TRV027 組Cx43（t=-5.524、P=0.0003）和β-arrestin（t=-6.137、P=0.0001）的蛋白表達量也高于Ang Ⅱ組。見表1、圖1。

表1 各組H9C2 細胞Cx43 和β-arrestin 的蛋白表達水平比較（±s）

表1 各組H9C2 細胞Cx43 和β-arrestin 的蛋白表達水平比較（±s）

分組Cx43β-arrestin對照組0.63±0.010.65±0.02 Ang Ⅱ組0.42±0.040.47±0.06 TRV027 組0.71±0.060.73±0.02 AngⅡ+TRV027 組0.76±0.060.79±0.01

圖1 各組H9C2 細胞Cx43 和β-arrestin 的蛋白水平比較

2.2 各組Cx43 和β-arrestin 的 mRNA 水平比較Ang Ⅱ組H9C2 細胞Cx43（t=1.682、P=0.048）和β-arrestin（t=2.869、P=0.022）的mRNA 表達量明顯低于對照組；Ang Ⅱ+TRV027 組H9C2 細胞Cx43（t=-6.052、P=0.003）和β-arrestin（t=-4.748、P=0.0002）的mRNA 表達量明顯高于Ang Ⅱ組；TRV027 組Cx43（t=-4.529、P=0.012）和β-arrestin（t=-3.148、P=0.019）的mRNA表達量也高于Ang Ⅱ組。見表2。

表2 各組H9C2細胞Cx43和β-arrestin mRNA水平比較（±s）

表2 各組H9C2細胞Cx43和β-arrestin mRNA水平比較（±s）

分組Cx43β-arrestin對照組0.012±0.0050.0006±0.0001 Ang Ⅱ組0.005±0.0030.0002±0.0001 TRV027 組0.015±0.0010.0006±0.0001 AngⅡ+TRV027 組0.018±0.0010.0009±0.0002

2.3 各組免疫熒光相對表達量比較根據熒光效果圖及半定量分析可見，與對照組相比，Ang Ⅱ組Cx43、β-arrestin 的綠色熒光強度降低；與Ang Ⅱ組相比，Ang Ⅱ+TRV027 組Cx43、β-arrestin 的綠色熒光強度升高。熒光半定量分析結果顯示，Ang Ⅱ組H9C2 細胞Cx43（t=7.038、P=0.00002）和β-arrestin（t=11.926、P=0.000001）的熒光相對表達量明顯低于對照組；Ang Ⅱ+TRV027 組H9C2細胞Cx43（t=-14.049、P=0.00001）和β-arrestin（t=-6.517、P=0.00003）的熒光相對表達量明顯高于Ang Ⅱ組；TRV027 組Cx43（t=-4.856、P=0.001）和β-arrestin（t=-11.426、P=0.00001）的熒光相對表達量也高于Ang Ⅱ組。見圖2、表3。

表3 各組H9C2 細胞Cx43 和β-arrestin 的螢光相對表達量比較（±s）

表3 各組H9C2 細胞Cx43 和β-arrestin 的螢光相對表達量比較（±s）

分組Cx43β-arrestin對照組48.49±3.3065.19±1.71 Ang Ⅱ組28.35±3.7032.75±4.39 TRV027 組40.73±2.4264.26±1.88 AngⅡ+TRV027 組59.70±1.1351.61±2.42

圖2 各組H9C2 細胞Cx43 和β-arrestin 熒光效果圖

3 討論

心血管疾?。–ardiovascular disease，CVD）的發病率在全球范圍內仍然呈上升趨勢，是全球死亡和導致殘疾的主要原因[12]。而RAS 的過度激活可以通過誘發炎癥、細胞及組織結構重構，造成心臟和血管損傷，是CVD 發病及病情惡化的重要因素之一[13，14]。Ang Ⅱ作為RAS 的重要活性成分發揮了核心作用，例如Ang Ⅱ可引起動脈血管收縮以及鈉水潴留，促進高血壓、心律失常、心肌梗死、心力衰竭等CVD 的發生發展。而Ang Ⅱ主要依賴于和細胞膜表面高度特異受體的結合而發揮作用，目前已知的Ang Ⅱ受體亞型主要有兩種，AT1R 和AT2R，二者都屬于G 蛋白偶聯受體，其中AT1R 是Ang Ⅱ發揮作用的主要受體[15]。當Ang Ⅱ和AT1R 結合后，通過激活下游的G 蛋白偶聯受體介導的信號通路，在循環系統內發揮著收縮血管、調節血壓和水鈉平衡等作用。在高血壓、充血性心力衰竭等CVD 的治療中廣泛使用的Ang Ⅱ轉換酶抑制劑和AT1R 阻斷劑就是通過限制Ang Ⅱ的產生或者阻斷Ang Ⅱ與AT1R 受體的結合來發揮療效。因此，阻斷Ang Ⅱ的作用進而抑制RAS 的過度激活，對CVD 的防治具有重要意義。

Cx43 作為縫隙連接的主要蛋白，其數量減少和分布異常與心律失常、心力衰竭、高血壓等疾病相關[16～18]。研究發現，Ang Ⅱ可以通過減少心肌細胞Cx43 的表達，增加Ⅰ型膠原蛋白的含量，從而導致心臟間質纖維化[5～7]。Ang Ⅱ還可以通過下調大鼠心房組織中Cx43 的表達，加重心房纖維化程度[19]。有學者在大鼠心肌梗死模型中發現，梗死區Cx43的表達降低，而給予VX765（一種caspase-1 抑制劑）上調了Cx43 的表達后，心肌梗死后大鼠心臟細胞間的信息傳遞得到了改善[20]。另有研究顯示，在大鼠心肌梗死后給予Ang Ⅱ受體拮抗劑（氯沙坦），梗死區的Ang Ⅱ水平明顯降低，而Cx43 在心肌組織不同區域表達增高，說明Ang Ⅱ的激活導致了Cx43 的表達降低[8]。在人體實驗中也發現，給予晚期心衰患者心內膜注射過表達Cx43 可以提高注射段心肌運動能力和生存能力[21]。以上研究說明Ang Ⅱ可以下調心臟組織中Cx43 的表達，而通過阻斷Ang Ⅱ可以改善Cx43 的異常表達，進而對心臟產生保護作用。而本研究結果顯示Ang Ⅱ可以降低大鼠心肌細胞Cx43 的表達，這與以上研究結論相似，表明Ang Ⅱ可能通過下調心肌細胞Cx43的表達來影響心肌細胞功能。

TRV027 作為新型的AT1R 偏向性配體，一方面，TRV027 能夠競爭性阻斷Ang Ⅱ與AT1R 的結合，抑制Ang Ⅱ通過AT1R 介導的下游G 蛋白偶聯信號通路對心血管系統的作用；另一方面，TRV027可以選擇性的激活β-arrestin 介導的非G 蛋白偶聯信號通路，發揮正性肌力作用，改善心臟功能[9～11]。TRV027 選擇性激活β-arrestin 蛋白在病理環境中比普通AT1R 阻斷劑有更好地保護心臟和脈管系統的作用[22，23]。既往研究發現，給自發性高血壓大鼠中樞輸注TRV027 可降低基線平均動脈壓，降低血管對Ang Ⅱ的反應性[11]。體內實驗研究顯示，TRV027 通過與AT1R 結合、激活β-arrestin 在新生小鼠心臟中以劑量依賴性方式起到了長效正性肌力作用[24]。有學者證明了TRV027 在人體中的安全性和可耐受性，同時還發現TRV027 可以降低穩定性心力衰竭患者的平均動脈壓[25，26]。這說明TRV027 能夠通過阻斷Ang Ⅱ與AT1R 的結合抑制Ang Ⅱ發揮作用，同時激活β-arrestin 信號通路對心臟和脈管系統起到保護作用。本研究結果顯示TRV027 提高了Ang Ⅱ下調的心肌細胞Cx43 的表達，也提高了β-arrestin 蛋白的表達，機制可能是TRV027 在抑制Ang Ⅱ作用的同時激活了β-arrestin信號通路，從而改善了Cx43 的異常表達。

本研究結果表明，Ang Ⅱ可以降低大鼠心肌細胞中Cx43、β-arrestin 的表達，而TRV027 可以改善這一作用，增加大鼠心肌細胞中Cx43 和β-arrestin 的表達。因此，TRV027 可能通過阻斷Ang Ⅱ與AT1R 結合、激活β-arrestin 通路，上調心肌細胞中Cx43 的表達，改善心肌細胞功能。

本研究僅限于在心肌細胞當中進行干預，沒有對Ang Ⅱ介導的下游信號通路及β-arrestin 相關通路進行驗證，缺少對心肌細胞功能和損傷相關檢測，而且未從動物層面來探討TRV027 的作用，后續實驗將對上述問題重點研究，進一步驗證TRV027對心肌細胞及心血管系統的作用機制。