MAP4/Mps1 信號通路介導miR-21對心肌成纖維化細胞的影響

蔣志明

（長沙市第四醫院心血管內一科，湖南 長沙 410006）

心肌纖維化（myocardial fibrosis）是指心肌成纖維化細胞在缺血缺氧、負荷過度、代謝紊亂等不利因素影響下，出現細胞異常增殖及轉分化，引起心肌細胞外基質（extracellular matrix，ECM）過度富集，從而導致心肌纖維化、心肌僵硬度異常增加、舒縮功能減弱及順應性下降，繼而發生心律失常、心力衰竭和心源性猝死等心血管惡性事件[1-3]。已有研究表明[4-6]，凋亡、炎癥、線粒體應激可以加劇心肌纖維化。目前，心肌纖維化的具體分子機制尚不明確，臨床上迫切需要有效的治療心肌纖維化診療方法。研究證實，通過構建肝纖維化模型，miR-21 激活NF-KB/SMAD7/TGF-β1 信號通路促Ⅰ型膠原（Col Ⅰ）和Ⅲ型膠原（Col Ⅲ）的過度合成從而促進肝纖維化[7]MAP4（microtubule-associated proteins4，MAP4）/Mps1（human monopolar spindle 1，MPS1）信號通路調控ROS 參與心肌成纖維化細胞炎癥因子的活化，加劇心肌損傷，可促進心肌纖維化的病理生理進展，提示MAP4/Mps1 信號通路可能是心肌纖維化的潛在的靶標治療蛋白[8-10]。而上調miR-21 激活MAP4/Mps1 信號通路后可能會促進心肌成纖維化細胞的Col Ⅲ、Col Ⅰ和α-SMA 蛋白的表達?；诖耍狙芯繑M通過構建低表達miR-21 轉染心肌成纖維化細胞實驗模型，探討活化的MAP4/Mps1 信號通路介導miR-21 調控心肌成纖維化細胞外基質堆積及轉分化的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與藥品 DMEM 培養液（Sigma-Aldrich美國公司產品）；胎牛血清（20%FBS，Gibco 美國公司產品）；化學修飾的miR-21 蛋白提取試劑盒（美國Sigma 公司產品）；Col Ⅲ、Col Ⅰ、MAP4、p-MAP4、Mps1、p-Mps1 和α-SMA 等兔多克隆抗體（Santa Cruz，USA）；miR-21 拮抗物，由上海茁彩公司合成；SOD 和MDA 試劑盒（上海生物技術研究所）；CFs（中國典型培養物保藏中心）。

1.2 方法

1.2.1 心肌成纖維化細胞培養及實驗分組 CFs 在細胞培養箱（37 ℃，5%CO2）中培養，10%胎牛血清及雙抗添加到DMEM 培養基中，細胞的貼壁率為75%～85%時，用EDTA（0.25%）的胰酶溫柔吹打消化、傳代至培養皿中予以實驗。根據試驗要求將其分為對照組、TGF-β1組、NC-miR-21 組和TGF-β1+simiR-21 組。轉染方法詳細見試劑盒說明書操作。

1.2.2 Western blot 募集細胞后將其PBS 洗滌3 次，加入裂解液裂解懸浮細胞，然后置于冰上30 min后，將其在4 ℃下離心（10 000 r/min，10 min），提取上清液，用BCA 法測定蛋白質濃度，隨后電泳（SDS-PAGE），采用硝酸纖維素（PVDF）電轉膜；5%脫脂牛奶封閉1 h 后，加入一抗（MAP4、p-MAP4、Mps1、p-Mps1），4 ℃12 h。TBST 洗膜20 min。加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜10 min，然后用顯色（化學發光法），采集圖像（UVP 型凝膠圖像分析系統），分析條帶積分吸光度（Imag J 軟件）。以對照組為參照計算蛋白的相對表達量。

1.2.3 MDA 和SOD 水平檢測 取1.2.1 中處理的細胞，使用裂解液（100 μl RIPA）裂解細胞，并將其在4 ℃下離心（10 000 r/min，10 min）并收集上清液。應用以試劑盒檢測SOD 和MDA 含量，操作方法按試劑盒說明書進行。以上指標評估心肌成纖維化細胞氧化應激水平。

1.3 統計學方法 采用SPSS 25.0 軟件對本研究實驗數據進行分析，計量數據以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩組之間比較行LSD-t檢驗，P＜0.05 表示有統計學意義，P＜0.01 表示統計學意義顯著。

2 結果

2.1 miR-21 對CFs 氧化應激水平的影響 TGF-β1組MDA 水平高于對照組，SOD 水平低于對照組（P＜0.05）；TGF-β1+si-miR-21 組MDA 水平低于NCmiR-21 組，SOD 水平高于NC-miR-21 組（P＜0.05），見表1。

表1 miR-21 對CFs 氧化應激水平的影響（n=3，）

表1 miR-21 對CFs 氧化應激水平的影響（n=3，）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

2.2 miR-21 對CFs 的MAP4/Mps1 信號通路蛋白表達的影響 TGF-β1 組未折疊蛋白MAP4、p-MAP4、Mps1 及p-Mps1 水平高于對照組（P＜0.05）；TGF-β1+si-miR-21 組未折疊蛋白MAP4、p-MAP4、Mps1 及p-Mps1 水平低于NC-miR-21 組（P＜0.05），見表2。

表2 miR-21 對MAP4/Mps1 信號通路蛋白相對量的表達（n=3，）

表2 miR-21 對MAP4/Mps1 信號通路蛋白相對量的表達（n=3，）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

2.3 miR-21 對CFs 的TNF-α、IL-6 及TGF-β1 水平的影響 TGF-β1 組TNF-α、IL-6 及TGF-β1 水平高于對照組（P＜0.05）；TGF-β1+si-miR-21 組TNF-α、IL-6 及TGF-β1 水平低于NC-miR-21 組（P＜0.05），見表3。

表3 miR-21 對CFs 的TNF-α、IL-6 及TGF-β1 水平的影響（，pg/ml）

表3 miR-21 對CFs 的TNF-α、IL-6 及TGF-β1 水平的影響（，pg/ml）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

2.4 miR-21 對CFs 的Col Ⅲ、ColⅠ及α-SMA 蛋白表達的影響 TGF-β1 組ColⅢ、ColⅠ及α-SMA 膠原蛋白水平高于對照組（P＜0.05）；TGF-β1+si-miR-21 組ColⅢ、ColⅠ及α-SMA 膠原蛋白水平低于NC-miR-21 組（P＜0.05），見表4。

表4 miR-21 對CFs 的ColⅢ、ColⅠ及α-SMA 蛋白相對量的表達（n=3，）

表4 miR-21 對CFs 的ColⅢ、ColⅠ及α-SMA 蛋白相對量的表達（n=3，）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

3 討論

心肌成纖維化細胞膠原蛋白合成分解代謝持續的穩態可保證正常的心肌組織結構及舒縮功能。一旦受到不良致纖因素的強烈刺激，將導致心肌成纖維細胞過度增殖、細胞外基質相關蛋白過度富集及細胞轉分化加強，特別是ColⅢ、ColⅠ及α-SMA，使膠原合成與分解代謝之間的穩態遭到嚴重破壞，最后導致心肌纖維化的病理改變[11，12]。MAP4 是調節骨架動力學的重要分子之一，具有與微管結合和聚合的特征[13]。研究顯示[14]，心肌缺血再灌注損傷時p-MAP4 蛋白表達上調，大大減弱其活性，促其微管解聚，導致病理性心肌重塑。Das NA 等[15]研究顯示，MPS1 通過miR-21 調控在TGF-β1/SMAD 信號通路促進腫瘤細胞的增殖和轉分化。本研究結果顯示，TGF-β1 可促進α-SMA、Col Ⅲ、Col Ⅰ、p-MAP4、MAP4、Mps1 及p-Mps1 蛋白表達，而下調miR-21的作用與之相反；同時si-miR-21 顯著抑制磷酸化MAP4 和Mps1 的表達水平，提示低表達miR-21 通過調控MAP4/Mps1 信號通路抑制心肌成纖維化細胞轉分化，以及構建膠原蛋白合成與分解代謝之間的穩態，從而防止心肌纖維化，提示miR-21 可能是一個新的心肌肺纖維化分子機制。

miR-21 是一類壓力應激性的成纖維細胞富集的miRNA，其在纖維化相關的心臟疾病中表達顯著升高，可做為心肌纖維化的生物標記物，TGF-β1 信號通路也是miR-21 的主要靶點[16]。Smad7 是miR-21 的另一靶點，Smad7 抑制Smad2 和Smad3 的激活，起到抗心肌纖維化的作用[17]。研究證實[18]，miR-21 在AngⅡ誘導的心肌纖維化模型中表達升高，且分別通過靶向程序性細胞死亡因子4（PDCD4）和軟脂?；椎鞍譙prouty1（Spry1）對AngⅡ正反饋調節，激活轉錄激活蛋白1（AP-1）/TGF-β1 和細胞外信號調節激酶（ERK）/TGF-β1/Smad 通路促進心肌纖維化。此外，另有研究顯示[19]，熊果酸抑制miR21/ERK 通路抗心肌纖維化，miR-21 還通過靶向Jagged1,發揮促進大鼠心肌成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化和心肌纖維化，導致心臟功能障礙。miR-21 可介導氧化應激和炎癥反應等分子機制促成纖維化細胞的膠原蛋白合成代謝紊亂[20]。本研究結果顯示，與對照組比較，TGF-β1 組TGF-β1、IL-6、TNF-α 水平及MDA 的含量升高，且SOD 的含量降低，而下調miR-21 作用則與之相反，表明低表達miR-21 可抑制氧化應激及炎癥反應信號通路構建膠原蛋白合成和代謝的穩態，從而抑制心肌成纖維化細胞分化，防止心肌纖維化。

綜上所述，激活的MAP4/MPS1 信號通路啟動氧化應激和炎癥反應介導miR-21 促心肌成纖維化ColⅢ、ColⅠ、TGF-β1、α-SMA 表達，這從細胞外基質合成代謝及轉分化角度闡述了新的促心肌纖維化機制，也為心肌纖維化防治的新策略提供一個新視角。