基于NUF2mRNA、HAMP mRNA、分期、病理分級及年齡的預后評估模型在腎透明細胞癌預后判斷中的運用

單 麗，朱曉力，向程程，張 媛，顧國建，程 旭

（蘇州大學附屬太倉醫院/太倉市第一人民醫院血液腫瘤科1，病理科2，江蘇 蘇州 215400）

腎細胞癌（renal cell carcinoma）的發病率約占全身惡性腫瘤的3%，占成人腎臟原發性惡性腫瘤的85%～90%，為泌尿系統第2 大惡性腫瘤，其中腎透明細胞癌（kidney renal clear cell carcinoma，KIRC）占腎細胞癌的85%[1]。對KIRC 預后的判斷目前尚缺乏有效的生物學標記以及模型。細胞分裂相關基因NUF2（Ndc80 kinetochore complex component）在細胞有絲分裂過程中起到穩定著絲粒和使染色體正確分離的作用[2]。據報道[3]，NUF2 在多種惡性腫瘤中均有較高表達，并且對腫瘤的形成和發展起著重要作用。鐵調素基因（HAMP）作為系統鐵穩態的主要調節因子，也已經被報道和很多的惡性腫瘤發生及發展有關。既往研究證實NUF2 及HAMP基因與KIRC 的發生發展有關[4]。因此本研究結合TCGA（The Cancer Genome Atlas）數據庫構建了基于NUF2 mRNA、HAMP mRNA、分期、病理分級及年齡的預后評估模型，以對KIRC 患者的預后做出精準的判斷。

1 資料與方法

1.1 數據來源 從TCGA 數據庫（https://portal.gdc.cancer.gov）獲取了537 例腎透明細胞（KIRC）癌患者及72 例正常對照患者的mRNA 數據及對應的臨床資料。

1.2 方法 按照表達是否大于平均值分為高表達及低表達組。分析NUF2 及HAMP mRNA 在KIRC 中的表達情況與總生存期（OS）及的關系。根據多因素COX 分析中的獨立預后危險因素構建患者OS的預后評估模型,具體計算公式如下：風險因子=Coefi：風險系數，xi: NUF2 及HAMP（低表達0 分，高表達1 分），分期（1～4 分），病理分級（1～3 分），年齡（≤60 歲0 分，＞60 歲1 分）。根據風險因子構建OS 的預后評估模型。

1.3 統計學處理 由R 軟件（版本號3.6.2）完成分析。NUF2 及HAMP mRNA 與對照組區別采用t檢驗、生存分析采用Kaplan-Meier 法，以P＜0.05 為差異有統計學意義。NUF2 及HAMP mRNA 及其他臨床病理參數與OS 的關系采用多因素COX 回歸分析法；R 插件RMS 用來構建預后預測模型。風險因子的ROC 分析采用R 插件survivalROC，熱圖分析采用插件pheatmap，數據可視化由R 插件Ggplot2繪制。

2 結果

2.1 KIRC 患者特征 共521 例有完整的基因表達數據及臨床病理特征數據；其中＞60 歲者260 例，≤60 歲者261 例；男339 例，女182 例；Ⅰ+Ⅱ期315 例，Ⅲ+Ⅳ期206 例；G1+G2級240 例，G3+G4級281 例。

2.2 KIRC 患者NUF2 mRNA 表達情況及與OS 的關系 KIRC 患者的NUF2 mRNA 及HAMP mRNA 的表達在患者分別為（0.747±1.771）FPKM 及（0.566±1.071）FPKM，高于對照組的（0.191±0.360）FPKM 及（0.042±0.071）FPKM，見圖1。KIRC 患者的NUF2 及HAMP mRNA 與生存明顯相關，高表達NUF2 及HAMP mRNA 的5 年生存率分別為54.7%及52.9%，低于低表達NUF2 及HAMP mRNA 的3 年生存率，分別為72.8%及74.9%，見圖2。

圖1 TCGA 數據庫中KIRC 患者與對照組NUF2 及HAMPmRNA 表達

圖2 高表達與低表達NUF2 及HAMP mRNA 患者的OS 差異

2.3 COX 回歸分析結果 多因素COX 分析表明，NUF2 mRNA、HAMP mRNA、年齡、AJCC 分期及病理分級時患者OS 的獨立預后因素，見表1 及圖3。

圖3 多因素COX 回歸分析森林圖

表1 COX 回歸分析結果

2.4 預后評估模型的構建 根據風險評分構建了預后評估模型來預測患者1、3、5 年的生存概率。根據NUF2mRNA、HAMP mRNA、分期、病理分級及年齡構建了患者的OS 預后評估模型，見圖4。

圖4 OS 預后評估模型Nomogram

2.5 預后評估模型對患者OS 的評估 高風險組患者的OS 明顯低于低風險組患者（P=1.1E-11），1、2、3年OS 分別為81.4、70.7%及60.5%，見圖5。1、2、3年的ROC 曲線下面積分別為0.816、0.800 及0.793，見圖6。Heatmap、Risk score 和survstat 圖均表明采用預后評估模型能將高風險及低風險組患者的OS狀態明顯的區分開，見圖7。

圖5 高風險與低風險組患者的OS 差異

圖6 風險評估模型1、2、3 年的ROC 曲線

圖7 高風險組和低風險組患者OS 預后評估模型評價

3 討論

腎細胞癌是泌尿系統的常見腫瘤。2015 年，我國腎細胞癌新發病例數為66 800 例（男性43 200例，女性23 600 例），占全部惡性腫瘤新發病例的1.56%，在所有惡性腫瘤發病中排第14 位。腎細胞癌患者死亡例數為23 400 例（男性15 200 例，女性8200 例），占全部惡性腫瘤死亡例數的0.83%，在所有惡性腫瘤死亡率中排名第17 位[5]。外科手術切除是腎細胞癌最好的治療方法，但是約有高達40%的患者發生局部復發和遠處轉移[6]。因此，能早期診斷并判斷患者預后的生物指標對提高患者生存有重要的意義。目前由于KIRC 是最常見腎細胞癌組織學類型，本研究的重點分析KIRC。

基因組的不穩定狀態是大多數腫瘤細胞的特征之一[7]，而NUF2 的異常表達能導致細胞有絲分裂失調，從而導致腫瘤的發生發展[8]。孫景波等[9]的研究發現，與正常乳腺組織相比，NUF2 在乳腺癌中高表達，且高表達組比低表達組具有較短的總生存期和無復發生存期，可作為不良預后的生物標志物。國外的研究也發現通過抑制NUF2 的表達，能夠減緩胰腺癌、神經膠質瘤、肝癌腫瘤細胞及肺癌的生長[10-13]。Shi L 等[14]發現NUF2 基因與肝細胞性肝癌的發病機制及預后有關。Zhang H 等[15]對GEO 數據庫的研究發現，NUF2 基因可能與腎透明細胞癌的發生，侵襲及復發有關。本研究通過對TCGA 數據的分析發現，NUF2 mRNA 在KIRC 患者中明顯高于對照組，而且高表達NUF2 mRNA 患者的預后明顯差于低表達患者。這些都提示NUF2 在KIRC 患者的發生、發展中可能起到重要的作用。

腫瘤細胞需要豐富的細胞內鐵來供應細胞的增殖、代謝和轉移。鐵水平的升高與腫瘤的生長和進展呈正相關[16]。越來越多的研究也表明腎細胞癌發生中存在鐵積累[17]。HAMP 基因作為調控細胞內鐵的主要基因的過表達與各種癌癥類型有關，包括前列腺癌、結腸癌等[18，19]。本研究中通過分析TCGA 數據發現，HAMP mRNA 在健康對照組中幾乎檢測不到，但在ccRCC 腫瘤中顯著增加，同樣這也提示HAMP 是KIRC 患者的預后指標之一。

由于目前尚無公認的有效的判斷KIRC 患者預后的指標，因此對KIRC 預后判斷的模型構建研究較多。Zhang D 等[20]利用DNA 甲基化有關的4 個基因構建了預后判斷模型，1、3 年的ROC 曲線下面積分別為0.856 及0.800。Wan B 等[21]用7 個免疫相關的基因構建的預后判斷模型，3 年的ROC 曲線下面積為0.760。Wu Y 等[22]利用代謝相關的11 個基因構建了預后判斷模型，1、3 年的ROC 曲線下面積分別為0.737 及0.687。Guo L 等[23]發現在肝癌中NUF2與其他4 個基因一起構成的預后預測模型可以準確的預測肝癌患者的預后。但是目前尚未檢索到以NUF2 及HAMP 基因為基礎構建KIRC 預后判斷模型的研究。多因素COX 分析表明NUF2 mRNA、HAMP mRNA 年齡、AJCC 分期及病理分級是KIRC患者OS 的獨立預后因素，據此本研究構建了預后評估模型并制作了列線圖。結果表明高風險組患者的OS 明顯低于低風險組患者，1、2、3 年OS 分別為81.4、70.7%及60.5%。1、2、3 年的ROC 曲線下面積分別為0.816、0.800 及0.793，明顯優于前述的各項研究。從Heatmap、Risk score 和survstat 圖上也能看出該模型能很好的將低危及高危組的患者的生存狀態明顯的區分開。而且由于該模型是由NUF2 及HAMP 基因與臨床常見年齡、AJCC 分期及病理分級等指標一起構建的，因此相對其他模型來說具有經濟及便利的特點。

總之，NUF2 及HAMP 基因的表達與KIRC 患者的預后有關，可作為KIRC 的獨立預后的生物標記，基于NUF2 mRNA、分期、病理分級及年齡構建的預后評估模型能更準確的判斷KIRC 患者的預后。