基于網絡藥理學探討桃紅大將逐瘀湯加減治療便秘的作用機制

吳碧蘭，孔秀蓮，朱云中，陳 鈺，高 鳳，潘小鳳

（廣西中醫藥大學第一附屬醫院神經外科，廣西 南寧 530023）

便秘（constipation）是由于大腸功能紊亂，結腸傳輸功能低下，內容物在腸腔傳輸緩慢導致的一種胃腸道疾病，其病因尚不明確，可能與長期起居不規律、飲食過于精細、缺少運動等相關。目前對該病尚無有效的根治方法，因此被WHO 確定成國際性難治疾病。西醫治療主要以促進胃腸動力、調節胃腸菌群為主，但遠期效果較不理想，甚至部分藥物易產生耐藥性，而繼續服用則有增加腹瀉的風險，停藥后依然會便秘[1-4]。由于西藥療效的局限性，因此探索中藥治療便秘是臨床研究的重點。中藥治療便秘歷史悠久，在緩解患者癥狀、減少復發等方面具有獨特優勢。桃紅大將逐瘀湯作為我院骨科常見組方用藥，主要用于治療急性腰痛癥疼痛，具有活血化瘀、行氣消脹、瀉熱通便的功效，對預防便秘也有一定的療效[5，6]。故而在臨床應用中對其組方適當加減（大黃、厚樸、枳實、桃仁、紅花）可取得一定的臨床療效，但關于其具體作用機制尚不明確。因此，本研究通過網絡藥理學方法，分析桃紅大將逐瘀湯加減的主要活性化合物及其治療便秘的基因和通路，以期為闡明該組方中的作用機制提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 活性化合物及其作用靶點的篩選 利用中草藥系統藥理平臺TCMSP 數據庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php）分別檢索桃紅大將逐瘀湯加減中“大黃”“厚樸”“枳實”“桃仁”“紅花”5 味中藥的活性化合物，篩選出同時滿足的口服生物利用度（OB）＞30%和類藥性DL＞0.18 化合物作為候選的活性化合物；接著，通過TCMSP 數據庫中的Related Targets 功能預測出候選的活性化合物作用靶點；并利用基因蛋白注釋信息數據庫UniProt（https://www.uniprot.org/）對篩選出的靶點注釋上基因信息。

1.2 疾病相關基因及中藥治療的靶基因篩選 使用檢索詞為“constipation”分別在GeneCards 數據庫（http://www.Gene-cards.org/）和OMIM 數據庫（https://www.omim.org/）中篩選出與便秘相關的基因。為了提高準確度，在GeneCards 數據庫中選擇滿足“Score＞1”條件的基因；然后，使用Rx64 3.6.1 軟件中“VennDiagram”包，使中藥活性化合物作用的靶點和疾病相關的基因相交集，重疊部分即為桃紅大將逐瘀湯加減的活性化合物治療便秘的直接作用靶基因；最后，再通過Cytoscape3.6.1 軟件構建中藥的活性化合物-靶基因關系網絡圖，篩選出關鍵的活性化合物。

1.3 靶基因蛋白互作網絡的構建和關鍵基因的篩選采用檢測蛋白之間相互作用的數據庫String 平臺構建靶基因的PPI 網絡，然后將網絡導入到用Cytoscape3.6.1 軟件，通過“cytoHubba”插件對PPI 網絡進行拓撲學分析，得到各個基因表達蛋白之間的關系信息，篩選出較為重要的關鍵基因。

1.4 靶基因的GO 功能注釋和KEGG 通路富集分析GO 功能注釋和KEGG 富集途徑可對相關基因數據集中的表達數據進行處理、分析以及注釋，以便理解基因作用于疾病的潛在機制。其中，GO 功能注釋主要揭示的是基因所涉及的生物過程（BP）、細胞組成（CC）和分子功能（MF），而KEGG 富集分析主要揭示的是基因所參與的信號通路。使用Rx64 3.6.1 中“Bioconductor”包對靶基因進行GO 功能注釋和KEGG 富集分析，設置P＜0.05，并利用“ggplot2”包繪制出較為顯著的GO 和KEGG 富集柱狀圖。

2 結果

2.1 桃紅大將逐瘀湯加減中5 味中藥的活性化合物及其作用靶點 通過TCMSP 數據庫對5 味中藥進行搜索和篩選，除去重復的部分共獲得獨立活性化合物82 個（3 個重復），其中大黃16 個、厚樸2個、枳實22 個、桃仁23 個、紅花22 個，這些活性化合物可作用227 個靶點。

2.2 桃紅大將逐瘀湯加減治療便秘靶基因的篩選在GeneCards 和OMIM 數據庫中篩選出了4663 個與便秘相關的基因，將這4663 個基因與227 個中藥作用的靶點交集，得到177 個重疊的基因，即為桃紅大將逐瘀湯加減治療便秘的靶基因，見圖1。

圖1 桃紅大將逐瘀湯加減與便秘相關基因交集的韋恩圖

2.3 中藥活性化合物-靶基因網絡的構建與分析 結合每一個中藥的活性化合物可作用的靶點和篩選出的靶基因，準備好由活性化合物與靶基因關系的文件，導入Cytoscape3.6.1 軟件構建活性化合物-靶基因的網絡（圖2），通過網絡拓撲學分析，根據“degree”得分，篩選出較為重要的活性化合物3 個：MOL000098（quercetin，槲皮素，分值116 分）、MOL000006（luteolin，木犀草素，分值48 分）、MOL000422（kaempferol，山奈酚，分值43 分）。

圖2 中藥活性化合物-靶基因網絡

2.4 靶基因PPI 網絡的構建及關鍵基因的篩選將交集得到的177 個靶基因輸入在線數據庫String，通過分析得到網絡有177 個節點和3553條關系邊（圖3）。將PPI 網絡用軟件中的插件“cytoHubba”進行拓撲學分析，根據“degree”得分，篩選出10 個較為重要的關鍵基因（圖4），分別為ALB、AKT1、IL6、JUN、CASP3、VEGFA、IL1B、EGFR、PTGS2、MYC。

圖3 桃紅大將逐瘀湯加減作用的177 個靶基因的PPI 互作網絡圖

圖4 靶基因的PPI 網絡中的關鍵基因

2.5 GO 和KEGG 富集分析 利用Rx64 3.6.1 中“Bioconductor”包對177 個靶基因進行GO 和KEGG富集分析，結果顯示GO 共有169 個富集條目，KEGG 共有158 個富集條目，分別繪制出前20 個較為顯著的富集條目的柱狀圖（圖5、圖6）。GO 富集分析顯示，177 個靶基因在nuclear receptor activity、transcription factor activity、direct ligand regulated sequence-specific DNA binding、steroid hormone receptor activity（核受體活性、轉錄因子活性、直接配體調節的序列特異性DNA 結合、類固醇激素受體活性）中顯著富集；KEGG 富集分析顯示，177 個靶基因顯著富含在AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、IL-17 signaling pathway、TNF signaling pathway（AGE-RAGE 信號通路、IL-17 信號通路、TNF 信號通路）等。

圖5 177 個靶基因的GO 富集柱狀圖

圖6 177 個靶基因的KEGG 富集柱狀圖

3 討論

便秘屬于中醫“大便難”“脾約”等范疇。血瘀是便秘關鍵病因，血瘀與糟粕內停與腸道日久，蘊結成毒，損傷氣血，毒害腸絡，形成“久病血瘀，瘀毒損絡”的病機[7-9]。有研究表明[5，6]，桃紅大將逐瘀湯切中其病機，運用其預防便秘有一定的療效。本研究在桃紅大將逐瘀湯基礎上化裁，去除檳榔、生姜，加入厚樸、枳實，取小承氣湯去痞、滿之功，達到活血化瘀、行氣消脹、瀉熱通便的目的。

本研究初步篩選出桃紅大將逐瘀湯加減中有82 個活性化合物，有55 個活性化合物可直接作用于與便秘相關的基因，其中槲皮素、木犀草素和山奈酚等有效成分發揮著重要作用，它們均屬于具有抗炎、抗癌和抗氧化等作用的黃酮類化合物。槲皮素可通過抑制炎性因子及細胞因子的反應起到預防腸道黏膜損傷的作用，從而改善便秘癥狀[10]；同樣，山奈酚也具有控制腸道細胞過量表達炎性因子及相關蛋白的作用[11]。木犀草素可通過降低NO 的含量而發揮抗炎作用[12]。由于NO 進入胃腸道平滑肌細胞，可使其收縮被抑制，導致胃腸蠕動變慢引起便秘的發生[13]，因此木犀草素通過抑制細胞因子的表達改善腸道蠕動，進而功能起到治療便秘的作用。

本研究進一步分析桃紅大將逐瘀湯加減直接作用的177 個便秘相關基因，得到ALB、AKT1、IL6、JUN、CASP3、VEGFA、IL1B、EGFR、PTGS2、MYC 等10 個較為重要的基因。ALB 是編輯表達成白蛋白的基因，其主要在肝臟中合成，在體內發揮結合和運輸生物活性分子的作用[14]，而腸道蠕動功能與ALB 的含量呈正比，當ALB 較少時腸蠕動明顯較弱[15]，提高ALB 水平可有效改善便秘[16]。AKT 是一種人類絲氨酸-蘇氨酸激酶，是AGC 蛋白激酶家族的成員[17，18]，而AKT1 是多種人類惡性腫瘤通路的關鍵因子，腫瘤通路可通過抑制Cajal 間質細胞的表達，進而使胃腸動力減弱[19-21]。IL6 是由多種細胞產生具有多效性作用的炎性因子，通過轉錄激活子-3 引起腸道炎性反應，而抑制腸道中的炎性反應可改善腸蠕動功能[22]。

另外，本研究對靶基因進行富集分析可知，桃紅大將逐瘀湯加減治療便秘主要通過核受體活性、轉錄因子活性、直接配體調節的序列特異性DNA 結合、類固醇激素受體活性等發揮作用，并參與AGERAGE 信號通路、IL-17 信號通路、TNF 信號通路等起到調節作用。其中，IL-17 信號通路是一條重要的炎性反應通路，而TNF 信號通路為關鍵的腫瘤通路，它們均可引起腸道黏膜損傷，從而導致腸蠕動減弱，通過藥物控制該通路可有效緩解便秘。

綜上所述，本研究運用網絡藥理學的方法，檢索篩選桃紅大將逐瘀湯加減的活性化合物及其治療便秘的靶基因，再進行GO 和KEGG 富集分析，預測出桃紅大將逐瘀湯加減中的主要有效成分槲皮素、木犀草素和山奈酚，通過影響ALB、AKT1、IL6 等靶基因，調節IL-17 信號通路、TNF 信號通路來抑制炎癥反應，調控腸道蠕動功能，從而達到治療便秘的目的。