KIRREL 表達對胃癌的預(yù)后作用及與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性

王 接，李啟信，楊侃侃

（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院胃腸外科，安徽 巢湖 238000）

胃癌（gastric cancer）是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計[1]，2020 年全球人口中胃癌在所有惡性腫瘤中發(fā)病率排名第5，占5.6%，新發(fā)病例致死率排名第4，占7.7%，具有較高的發(fā)病率及死亡率，且我國胃癌發(fā)病情況相對于其他國家更為嚴(yán)重，對人類的健康及生活質(zhì)量產(chǎn)生巨大影響。胃癌的發(fā)生與發(fā)展與諸多因素相關(guān)，如不良生活習(xí)慣、幽門螺桿菌感染、遺傳、基因突變等[2，3]。目前，早期胃癌的治療仍以手術(shù)為主[4]，進展期胃癌的治療主要是手術(shù)治療聯(lián)合化學(xué)治療、內(nèi)分泌治療、免疫治療等輔助治療的綜合治療手段[5-7]。KIRREL 又稱Nehp1，是由人類KIRREL 基因轉(zhuǎn)錄翻譯的一種免疫球蛋白超家族類細(xì)胞黏附分子[8]，屬于NEHP 蛋白家族。研究顯示[9-11]，KIRREL 主要表達于腎臟足細(xì)胞、神經(jīng)突觸和胎盤中，參與足細(xì)胞修復(fù)、神經(jīng)發(fā)育和炎癥反應(yīng)。隨著臨床研究的進展，發(fā)現(xiàn)KIRREL 在許多惡性腫瘤中過表達，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生影響[12，13]，并可能成為腫瘤治療的新靶點基因[14]。但KIRREL在胃癌中的表達等級和預(yù)后作用以及是否可以作為免疫治療的新靶點仍尚未可知。因此，本研究中通過使用腫瘤基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）和各種公共數(shù)據(jù)庫對KIRREL 在胃癌中的表達、預(yù)后及其與腫瘤免疫浸潤的相關(guān)性進行分析，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 KIRREL 基因表達分析 通過TIMER（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）數(shù)據(jù)庫來分析KIRREL在泛癌及其癌旁組織中的差異表達，檢索條件：①Diff Exp；②Gene symbol：KIRREL；③Submit。接著，通過UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）數(shù)據(jù)庫對TCGA 數(shù)據(jù)進行分析，進一步驗證KIRREL 在胃癌組織及其癌旁組織中的表達差異以及與臨床特征之間的關(guān)系，檢索條件：①Gene symbol：KIRREL；②Select cancer：stomach adenocarcinomana；③Gene expression；④KIRREL expression based on sample types，individual cancer stages，tumor grade，nodal metastasis status，H.pylori infection status。

1.2 預(yù)后價值分析 通過使用Kaplan-Meier（https://kmplot.com/analysis/）網(wǎng)站和GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/index.html）數(shù)據(jù)庫繪制生存曲線，評估KIRREL 基因表達水平在胃癌患者預(yù)后中的價值，檢索條件為：①Gene symbol：KIRREL；②Cancer：gastric cancer；③Survival：OS。

1.3 免疫細(xì)胞浸潤分析 采用TIMER 數(shù)據(jù)庫分析KIRREL 基因表達與免疫細(xì)胞浸潤等級的相關(guān)性，檢索條件：①Gene；②Gene symbol：KIRREL；③Cancer type：STAD；④Immune Infiltrates：Purity、B cell、CD8+T cell、CD4+T cell、macrophage、neutrophil、dendritic cell。

1.4 KIRREL 的表達與免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系分析 通過SangerBox 分析KIRREL 相關(guān)的免疫檢查點基因，通過ESTIMATE 評估其在腫瘤微環(huán)境中的腫瘤純度，其中包括基質(zhì)分?jǐn)?shù)（stromal score)，免疫分?jǐn)?shù)（immune score）和評估分?jǐn)?shù)（estimate score）。另通過SangerBox 網(wǎng)站分析二者之間的相關(guān)性，檢索條件：①泛癌分析；②免疫檢查點基因分析；③Gene symbol：KIRREL；④Cancer type：STAD。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Wilcoxon 檢驗分析KIRREL在泛癌中的表達水平差異，Kaplan-Meier 生存曲線和Log-rank 檢驗分析KIRREL 表達水平的生存差異。另采用Spearman 相關(guān)系數(shù)分析KIRREL 與胃癌腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞浸潤及免疫檢查點基因表達的相關(guān)性，采用Pearson 相關(guān)系數(shù)分析KIRREL與基質(zhì)分?jǐn)?shù)、免疫分?jǐn)?shù)和評估分?jǐn)?shù)的相關(guān)性，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01 表示統(tǒng)計學(xué)意義顯著，P＜0.001 表示統(tǒng)計學(xué)意義極顯著。

2 結(jié)果

2.1 KIRREL 在泛癌中的表達 KIRREL 在膽管癌、食管癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌、胃癌中的表達水平高于相對應(yīng)的癌旁組織（P＜0.05），且在膀胱尿路上皮癌、乳腺浸潤癌、腎嫌色細(xì)胞癌、腎乳頭狀細(xì)胞癌、肺腺癌、肺鱗癌、前列腺癌、甲狀腺癌、子宮內(nèi)膜癌中表達下調(diào)（P＜0.05），見圖1。通過UALCAN 數(shù)據(jù)庫分析TCGA 數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)KIRREL 在胃癌組織中表達具有顯著差異（P=1.18E-06），見圖2。

圖1 KIRREL 在泛癌中的表達

圖2 KIRREL 在胃癌組織及癌旁組織中的表達差異

2.2 KIRREL 表達與臨床特征的關(guān)系 UALCAN 數(shù)據(jù)庫分析顯示，腫瘤分期為2～4 期的患者中KIRREL 表達高于癌旁組織及腫瘤分期為1 期的患者，見圖3A；腫瘤分級為3 級的患者中KIRREL 表達高于癌旁組織和腫瘤分級為1、2 級的患者，且腫瘤分級為2 級的患者中KIRREL 表達高于癌旁組織，見圖3B；隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期的增加，KIRREL 表達也呈上升趨勢，見圖3C。

圖3 KIRREL 表達與臨床特征的關(guān)系

2.3 KIRREL 表達對胃癌患者預(yù)后的價值 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析顯示，高表達的KIRREL 對胃癌患者OS有顯著影響（HR=1.5，P=0.02；n=383），見圖4A。Kaplan-Meier 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，更高表達的KIRREL 預(yù)示著胃癌患者具有較差的OS（HR=1.5，P=2.7E-06；n=875），見圖4B。

圖4 KIRREL 表達對胃癌患者預(yù)后的價值

2.4 KIRREL 表達與免疫檢查點基因和ESTIMATE分?jǐn)?shù)的關(guān)系 通過Sangerbox 數(shù)據(jù)庫分析與KIRREL密切相關(guān)的免疫檢查點，發(fā)現(xiàn)在胃癌患者中有60 個免疫檢查點途徑基因（Inhibitory=24，Stimulatory=36）與KIRREL 的表達有顯著相關(guān)性（圖5A）。然后，根據(jù)KIRREL 表達再次計算了胃癌中每例患者的基質(zhì)分?jǐn)?shù)、免疫分?jǐn)?shù)和評估分?jǐn)?shù)，結(jié)果顯示KIRREL的表達與基質(zhì)分?jǐn)?shù)、免疫分?jǐn)?shù)和評估分?jǐn)?shù)均呈正相關(guān)（基質(zhì)分?jǐn)?shù)：r=0.70，P=3.5E-59；免疫分?jǐn)?shù)：r=0.25，P=4.4E-7；評估分?jǐn)?shù)：r=0.52，P=3.8E-28），見圖5B～5D。

圖5 KIRREL 表達與免疫檢查點基因和ESTIMATE 分?jǐn)?shù)的關(guān)系

2.5 KIRREL 表達與免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系 TIMER數(shù)據(jù)庫分析顯示，KIRREL 表達與CD8+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞的浸潤等級呈正相關(guān)（P＜0.05)，與腫瘤純度、B 細(xì)胞無相關(guān)性（P＞0.05），見表1。

表1 KIRREL 表達與免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系

3 討論

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移受到多種因素影響，目前仍以手術(shù)為主要治療手段。但由于其進展較快，很多患者失去手術(shù)機會，嚴(yán)重威脅患者生命健康。近年來隨著分子生物學(xué)和腫瘤免疫學(xué)的快速發(fā)展，出現(xiàn)了一系列新的腫瘤治療方法，包括放射治療、化學(xué)治療、免疫治療等，逐漸成為治療惡性腫瘤的新選擇。其中，免疫治療在臨床上得到了廣泛應(yīng)用，并取得了顯著的療效，以PD-1/PD-L1 抑制劑、HER2 具有代表性[15，16]。既往研究表明[17]，KIRREL 在腫瘤發(fā)生、炎癥反應(yīng)、足細(xì)胞細(xì)胞修復(fù)和神經(jīng)元發(fā)育等過程中起到重要作用。但KIRREL 在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中是否發(fā)揮重要作用，并能夠作為免疫治療的潛在靶點尚未可知。因此，本研究通過數(shù)據(jù)挖掘?qū)CGA、GEO 等常見的生物醫(yī)學(xué)信息數(shù)據(jù)庫進行分析，以期為胃癌的免疫治療提供新的選擇。

本研究首先通過TIMER 和UALCAN 數(shù)據(jù)庫分析了KIRREL 在惡性腫瘤組織和癌旁組織中的差異表達，發(fā)現(xiàn)KIRREL 在膽管癌、食管癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌、胃癌的腫瘤組織中的表達水平高于相對應(yīng)的癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05)；而KIRREL在膀胱尿路上皮癌、乳腺浸潤癌、腎嫌色細(xì)胞癌、腎乳頭狀細(xì)胞癌、肺腺癌、肺鱗癌、前列腺癌、甲狀腺癌、子宮內(nèi)膜癌中表達下調(diào)（P＜0.05）；通過UALCAN數(shù)據(jù)庫分析TCGA 數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)KIRREL 在胃癌組織中表達具有顯著差異（P=1.18E-06），提示KIRREL在胃癌的發(fā)生過程中起到重要作用。然后，經(jīng)UALCAN 數(shù)據(jù)庫進一步分析KIRREL 在胃癌患者不同臨床特征中的表達，發(fā)現(xiàn)KIRREL 的表達與胃癌患者腫瘤分期、分級、淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，表明KIRREL 表達對胃癌的發(fā)展和侵襲起到促進作用。接著，通過GEPIA 和Kaplan-Meier 數(shù)據(jù)庫分析KIRREL 與胃癌患者預(yù)后關(guān)系得出，高表達的KIRREL 患者具有更低的生存率。上述分析結(jié)果提示，KIRREL 的高表達在胃癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、不良預(yù)后中起重要作用，是潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物。此外，通過TIMER 數(shù)據(jù)庫探究發(fā)現(xiàn)，KIRREL 表達與CD8+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞的浸潤等級有顯著相關(guān)性，與B 細(xì)胞無相關(guān)性。另一方面，通過Sangerbox 數(shù)據(jù)庫分析與KIRREL 密切相關(guān)的免疫檢查點，發(fā)現(xiàn)在胃癌患者中有60 個免疫檢查點途徑基因（Inhibitory=24，Stimulatory=36）與KIRREL 的表達有顯著相關(guān)性。然后，根據(jù)KIRREL 表達再次計算了胃癌中每例患者的基質(zhì)分?jǐn)?shù)、免疫分?jǐn)?shù)和評估分?jǐn)?shù)，結(jié)果顯示KIRREL 的表達與基質(zhì)分?jǐn)?shù)、免疫分?jǐn)?shù)和評估分?jǐn)?shù)均呈正相關(guān)。上述結(jié)果表明，KIRREL 調(diào)控了胃癌腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞浸潤及免疫檢查點基因，參與腫瘤的免疫逃避和抑制，為胃癌的免疫治療提供了理論基礎(chǔ)[18-20]，提示KIRREL 可能成為腫瘤免疫治療的潛在靶點。

但本研究仍有很多局限性：首先，所有數(shù)據(jù)的來源是各個數(shù)據(jù)庫對TCGA 數(shù)據(jù)的加工、處理，各數(shù)據(jù)庫之間的統(tǒng)計方法可能存在誤差，缺乏特異性；其次，缺乏更多的實驗數(shù)據(jù)來進一步證明KIRREL 的高表達在胃癌腫瘤生成、發(fā)展和侵襲以及調(diào)控免疫細(xì)胞浸潤等級和免疫檢查點基因中的具體機制，需要更多的體內(nèi)和體外實驗設(shè)計來驗證研究結(jié)果。

綜上所述，KIRREL 在胃癌的發(fā)生、發(fā)展及免疫浸潤中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，可以作為評估患者臨床預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)記物和指導(dǎo)免疫治療的潛在靶點。