依賴于NRF2 的lncRNA-mRNA 共表達網絡的全基因組識別及其在非小細胞肺癌進展中的作用

唐建軍，韓春賓，紀玉龍，張劍鋒，姜斯聰

（1.南昌大學第一附屬醫院呼吸與危重癥醫學科，江西 南昌 330052；2.江西省腫瘤醫院胸外科，江西 南昌 330029；3.江西省腫瘤醫院轉化腫瘤研究重點實驗室，江西 南昌 330029；4.江西省腫瘤醫院病理科，江西 南昌 330029）

在全球所有癌癥類型中，肺癌（lung cancer）的死亡率最高[1]。因此，了解關鍵致癌驅動因素對疾病生物學和臨床結果的影響對于設計新療法至關重要。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小細胞肺癌是肺癌的亞型[2]。NSCLC 被細分為離散的組織學和基因組亞型，每個亞型都表現出獨特的生物學和臨床特征[1]。Kelch 樣環氧氯丙烷相關蛋白-1（KEAP1）和核因子E2 相關因子2（NRF2）基因位點的突變是NSCLC 中的常見事件，并導致轉錄因子NRF2（抗氧反應的關鍵調控因子）的構成穩定[3，4]。NRF2 是堿性亮氨酸拉鏈結構域蛋白家族的成員，可調節抗氧化酶和含有抗氧化反應元件的細胞保護蛋白基因的表達[5，6]?；钚匝酰≧OS）是氧代謝的部分還原氧副產物[7，8]。ROS 的積累可導致DNA 氧化損傷并促進表觀遺傳改變，從而導致驅動基因失調和癌癥發病機制[9，10]。NRF2 在對損傷和炎癥的抗氧化反應中減輕氧化應激起關鍵作用[10]。它受負調節因子KEAP1 蛋白的嚴格調控，并可與NRF2 蛋白結合，誘導其泛素化和降解[11]。然而，關于NRF2 和KEAP1 在癌癥發病機制中的作用還缺乏共識。NRF2 被認為是肺癌的致癌基因且與NSCLC的發病機制和進展有關。并且，肺癌組織中的NRF2上調也與不良治療預后相關[11-14]。此外，肺癌的誘發機制似乎不同于在其他器官系統和肺部疾病中觀察到的機制，如肺氣腫[15]、高氧[16]和呼吸道合胞體病毒[17]，這些都是KEAP1 依賴性的。長鏈非編碼RNA（lncRNA）長度＜200 個核苷酸，調控基因表達和關鍵的生物過程[18]，包括細胞周期、細胞凋亡[19-21]以及染色質修飾和重塑。鑒于它們影響著重要的生物過程和許多疾病，增加對其遺傳學和生物學的了解已成為近期研究的新熱點。研究表明[23，24]，lncRNAs 在肺癌發病機制中調節NRF2 表達中的作用。為此，本研究主要探究NRF2 調控的lncRNA 在功能上與肺癌有關信號通路的關系，揭示在肺癌中NRF2 對lncRNA 調控的機制。

1 資料與方法

1.1 資料來源 在TCGA數據庫（https://can cergenome.nih.gov/）獲取486 個NSCLC 樣本和50個正常樣本的RNA-seq 數據。使用FastQC（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc）檢查原始數據質量，通過FASTX-Toolkit v.0.0.13（http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/）去除低質量堿基。從GEO 數據庫（GSE118844）中提取公共NRF2 依賴性轉錄組和H3K27ac 染色質免疫沉淀測序數據，H3K27ac ChIP-seq 數據包括3 組NRF2-KD 肺癌A549 細胞系和3 組用于免疫沉淀的對照細胞，以及兩組DNA 輸入（基因組DNA 作為陰性對照）。RNA-seq 數據來自KEAP1 突變條件（NRF2 激活）下的NRF2-KD 和A549 細胞。

1.2 染色質免疫沉淀測序（ChIP-seq）使用Bowtie 2軟件分析公開可用的ChIP-seq 數據，將全基因組ChIP-seq 讀數與人類GRCh38 參考基因組對齊。錯誤發現率設置為q值＜0.05（Benjamini-Hochberg 調整的P值）。ChIP-seq 算法（MACS v.14 軟件）的模型分析被用于識別NRF2 依賴的富含H3K27ac 的ChIP-seq 峰；控制樣本被設置為輸入。接下來，使用“bedtools cluster”對每個樣本中的ChIP-seq 峰進行聚類。在TSS 上游10 kb 和下游3 kb 的區域中發現了ChIP-seq 啟動子相關的峰相關基因。

1.3 轉錄組測序 使用TopHat2[25]將高質量數據與GRCH38 參考基因組進行對比，并最多允許4 個錯配（Ensembl 釋放61 預測基因模型）。使用外顯子級估量來改進差異基因表達，通過計算映射到基因外顯子的讀數量來獲得每個基因的計數。通過edgeR 軟件[26]使用以下標準來識別DE lncRNA：倍數變化（FC）≥1.5 或FC≤0.67；和錯誤發現率（FDR，P值≤0.05）。

1.4 LncRNA 預測和方向識別 為了系統地分析lncRNA 表達模式，采用管道法鑒定lncRNA[27]。該程序是根據Cufflinks 軟件設計的[28]。

1.5 功能富集分析 使用KOBAS2.0 服務器識別GO項、KEGG 和Reactome 路徑[29]。采用超幾何檢驗和Benjamini-Hochberg FDR 調整的P值來定義各術語的富集度。

1.6 LncRNA-mRNA 共表達網絡分析 使用CNC 網絡來計算TCGA NSCLC 樣本（n=550）中共有lncRNAmRNA 對的PCC（臨界值≥0.4）。使用Cytoscape3.7.2版軟件（The CytoscapeConsortium，SanDiego，CA，USA）對lncRNA-mRNA 網絡進行可視化。

1.7 Kaplan-Meier 生存分析 對不同的上調和下調組進行Kaplan-Meier 生存分析并通過R 包（survival and survminer）（https://cran.r-project.org/web/packages/survival/index.html）生存分析代碼進行可視化，組間比較采用數秩檢驗（Log-rank），TCGA NSCLC 數據集中的中位基因表達設置為上調和下調組的截止值。

1.8 統計學方法 在使用每百萬份轉錄本標準化方法后，將樣本中每個基因的讀?。▋炔磕_本）用于下一代測序數據的可視化和基因組注釋。使用R 3.6.1（https://www.r-project.org/）進行統計學分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。

2 結果

2.1 肺癌中NRF2 的過度表達和 KEAP1 突變體A549 細胞中NRF2 結合靶點的鑒定 從486 例癌癥和50 例正常樣本的TCGA 數據集中發現NRF2 在肺癌患者中高表達（圖1A）。NCBI/GEO/H3K27ac/ChIP-seq（GSE118840）數據集包含3 個含有NRF2 siRNA（NRF2-KD）的NRF2 敲低A549 樣本，3 個用于免疫沉淀的含有對照siRNA 的對照樣本和兩個以對照siRNA 作為輸入的樣本（基因組DNA）。與NRF2-KD 樣品相比，從3 個對照樣品中特異性鑒定出8277、3808 和6858 個富集峰；而與對照樣品相比，在3 個NRF2-KD 樣品中共發現2645、5396和4020 個峰（圖1B）。H3K27ac 中超過80%的結合峰的寬度小于2151 bp（圖1C）。對NRF2NRF2 依賴的H3K27ac 峰進行文氏圖分析，并從3 個ChIP-seq重復中至少2 個中確定了3006 個候選NRF2 依賴的H3K27ac 峰（圖1D）。KEGG 富集顯示，NRF2 具有發揮多方面的潛在作用（圖1E）。依賴于NRF2 的H3K27ac 沉積峰在轉錄起始位點（TSS）附近的10 kb 區域顯示出較高的比例（15%）（圖1F）。峰的全基因組分布顯示114 個lncRNA、10 個sense_intronic、124 個假基因、3 個sense_overlapping、102 個反義、34 個microRNA（miRNA）、28 個misc_RNA、452 個編碼蛋白，以及71 種其他基因類型（圖1G）。對NRF2 依賴的H3K27ac 峰的基因本體論（GO）分析表明，該峰富集了各種代謝過程（圖1H）。對照樣本和NRF2-KD 樣本中有代表性的lncRNAs 基因組快照（RP11-445P17.8）顯示，與NRF2-KD 樣本相比，對照樣本具有強的H3K27ac 結合峰（圖1I），表明肺癌中上調的NRF2 可以在lncRNA 位點形成H3K27ac 標記的增強子。

圖1 KEAP1 敲低A549 細胞中NRF2 結合靶點的識別

2.2 NRF2-KD 與具有KEAP1 突變的對照A549 細胞之間的DE lncRNA 分析 結果表明，對照組在TSS 附近有很強的結合模式，而NRF2-KD 組在TSS上的結合微乎其微（圖2A、2B，圖3A、3B）?；鹕綀D和熱圖顯示，NRF2-KD 與對照樣品中有368 個lncRNA 基因表達下調，404 個表達上調（圖3C、3D）。使用550 個LUSC 樣本的TCGA 數據集通過共表達研究lncRNA 和mRNA 表達之間的關系，DE lncRNA 和共表達mRNA 的GO 和KEGG 功能富集分析見圖3E、3F，表明DE lncRNA 和mRNA 在肺癌進展中發揮作用。

圖2 NRF2-KD 與具有KEAP1 突變的對照A549 細胞之間的DE lncRNA 分析

圖3 結合DE mRNA 功能途徑的分析

2.3 NRF2 介導的lncRNA 在肺癌中的調控作用 為了建立NRF2 調控的lncRNA 與肺癌之間的臨床關系，從數據庫中篩選已知的lncRNA，并預測罕見的新lncRNA。GO 和KEGG 分析確定依賴于NRF2 的DE mRNA 和H3K27ac 結合的mRNA 的重疊基因富集途徑，共發現一組由NRF2 依賴性增強子調節的18 個lncRNA（圖4A、4B）。這18 個lncRNA 表達譜的熱圖顯示了兩個不同的簇，一個對應于對照組，另一個對應于NRF2-KD 組。然后，對TCGA LUS 數據集中的18 個lncRNA 進行共表達分析，識別它們相關的mRNA。共表達mRNA 分析見圖4C、4D，DE lncRNA-mRNA 通路圖見圖4E。

圖4 NRF2 介導的LncRNA 在肺癌中的調控作用

2.4 lncRNA LINC00488 對肺癌患者預后的影響 對18 個NRF2 依賴性H3K27ac 結合的lncRNA 進行Kaplan-Meier 生存分析，結果顯示18 個lncRNA 中LINC00488 上調與預后不良相關。ChIP-seq 結果和RNA-seq 結果中LINC00488 的讀取分布見圖5A、5B、5C；ChIP -seq 分析識別出lncRNA RP11.227H15.4（Chr10:69231262 -69233332）的NRF2 依賴性增強子區域（圖6A）。此外，Kaplan-Meier 生存曲線顯示，RP11.227H15.4 基因表達上調的LUSC 患者預后不良（圖6B）。

圖5 lncRNA LINC00488 對肺癌患者預后的影響

圖6 調節lncRNA（RP11.227H15.4）對肺癌患者預后的影響

3 討論

肺癌是一種異質性疾病，了解關鍵致癌驅動因素對其生物學和患者臨床結局的影響對于設計新療法至關重要。NSCLC 是最普遍的肺癌類型[30]，lncRNA 參與腫瘤發生是一個新興的主題[31，32]。LncRNA 可能通過改變基因表達發揮與經典癌基因或腫瘤抑制基因相似的作用[33]。NRF2 在調節細胞內氧化微環境、炎癥反應和細胞穩態中起關鍵作用[34]。此外，它還可以在癌癥中發揮致癌或保護作用[35-37]。

小的非編碼RNA 在增殖、干細胞自我更新、細胞凋亡和化學/放射抗性等生理過程中發揮重要作用[38，39]。這些非編碼RNA 也被證明可以在mRNA 和蛋白質水平上調節癌基因和腫瘤抑制基因。類似地，NRF2 可以通過miRNA 和lncRNA 在遺傳和表觀遺傳水平上對癌基因和腫瘤抑制基因進行調節[40，41]。許多研究報道了NRF2 和lncRNAs 在腫瘤進展中的關系。如前列腺癌進展中的NRF2 表達受lncRNA TUG1 調節[42]。此外，吸煙和癌癥相關的lncRNA-1/肺癌相關轉錄物1（SCAL1/LUCAT1）的表達受NRF2 在煙草煙霧誘導的肺癌中的調節[43]。此外，敲低NRF2 可以降低lncRNA 核缺氧調節的NLUCAT1 的表達；而NRF2 的過表達可以提高NLUCAT1 的表達并促進肺腺癌中的順鉑耐藥[44]。因此，探究NRF2-lncRNA 的相互作用至關重要。盡管lncRNA 與調節NRF2 基因表達有關，但目前仍缺乏關于其在肺癌中作用的詳細全基因組視圖[45]。

本研究確定了一個依賴DE NRF2 的lncRNA網絡，并通過全基因組RNA-seq 分析以及GO 和KEGG 通路富集分析探索它們在NSCLC 中可能的臨床意義，結果顯示其主要涉及的通路有：細胞色素P450 介導的異生物代謝，硫酸角質素糖胺聚糖生物合成和細胞色素P450 介導的藥物代謝、代謝途徑，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，淀粉和蔗糖代謝，類固醇激素生物合成，化學致癌，卟啉和葉綠素代謝。值得注意的是，對A549 細胞（GSE118844）中NRF2 依賴性H3K27ac ChIP-seq 數據和NRF2-KD RNA-seq 數據的系統分析發現了368 個lncRNA 基因表達下調，404 個表達上調，并且共表達的mRNA具有自身免疫性疾病介導的細胞毒性、自噬調節、IgA 產生的腸道免疫網絡、RIG-Ⅰ樣受體信號通路和細胞粘附分子的富集。至少2 個DNA 樣本和3006 個候選NRF2 依賴的H3K27ac 峰。該峰富集了各種代謝過程，如小分子代謝、受體介導的內吞作用、硫酸角質素生物合成、有絲分裂的G1/S 轉換、水溶性維生素代謝和小GTPase 介導的信號轉導的調節。本研究表明，NRF2 上調可以誘導細胞周期從G0/G1期向S 期轉變，促進人支氣管上皮細胞的腫瘤發生[46]，以及NRF2 在抗氧化防御、NADPH 的再生和其他代謝途徑中的作用[13，23]。本研究發現了18 個lncRNA 共表達mRNA，表明這些基因可能與RNA剪接、DNA 依賴性DNA 修復、mRNA 加工、轉錄調控、有絲分裂、DNA 復制和轉錄激活可能關聯。對共表達mRNAs 的KEGG 分析預測了與剪接體、谷胱甘肽代謝、賴氨酸降解、細胞色素P450 介導的異生物質代謝、同源重組、細胞周期、RNA 轉運、泛素介導的蛋白水解和胞質鐵硫簇組裝途徑的關聯。最后發現lncRNA LINC00488 的高表達與肺癌患者預后不良有關。而lncRNA LINC00488 與許多癌癥有關，如通過miR-376a-3p/PON2 的甲狀腺癌[47]和通過miRNA-485-5p 的食道癌[48]。未來的研究將探索利用功能性敲入和敲除實驗闡明NRF2-lncRNA LINC00488 在肺癌中的調控機制。

綜上所述，本研究發現lncRNA LINC00488 可能在肺癌中受到NRF2 的潛在調節，其可能作為新的預后生物標志物和肺癌治療靶點的潛在作用。但需要進一步的實驗來闡明lncRNA 對NRF2 表達及其下游靶點在癌癥進展中的互補作用。