基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討“黃連-茵陳”治療慢性萎縮性胃炎機(jī)制※

李 澤 楊 柳 高云霄 胡婧楠 張 彤 王小天 李博林△

(1.河北中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院脾胃三科,河北 石家莊 050011;2.河北省濁毒證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 石家莊 050011;3.河北省脾腎病證中醫(yī)治療技術(shù)創(chuàng)新中心,河北 石家莊 050011;4.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院呼吸內(nèi)科,河北 石家莊 050011;5.河北中醫(yī)學(xué)院2022級(jí)博士研究生,河北 石家莊 050090)

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)是指胃黏膜上皮遭受反復(fù)損害而導(dǎo)致固有腺體減少,伴或不伴腸腺化生和(或)假幽門腺化生的一種慢性胃部疾病,被公認(rèn)為屬于胃癌前病變[1]。CAG屬于中醫(yī)學(xué)“胃痛”“痞滿”范疇,中醫(yī)藥在CAG的治療中發(fā)揮了重要的作用。國(guó)醫(yī)大師李佃貴教授的濁毒理論認(rèn)為,濁毒貫穿于CAG發(fā)生發(fā)展的始終,并提出運(yùn)用化濁解毒法治療CAG,取得了很好的臨床療效[2-3],但化濁解毒法治療CAG的具體機(jī)制以及涉及的具體蛋白靶點(diǎn)與通路尚不清楚。前期通過(guò)對(duì)化濁解毒法治療CAG處方進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘表明,“黃連-茵陳”是化濁解毒法治療CAG應(yīng)用頻次最高的藥對(duì),也是處方中藥物組合關(guān)聯(lián)規(guī)則置信度最高的藥對(duì),最能代表化濁解毒法的核心治則[4]。黃連有清熱瀉火、解毒燥濕之能,茵陳能清利肝膽脾胃濕熱,除濕滯濁停,散熱結(jié)毒聚,兩者相須為伍,一偏于利濕化濁,兼能散熱結(jié),一偏于清熱解毒,兼可燥濕濁,實(shí)為化濁解毒之經(jīng)典藥對(duì)。相關(guān)研究表明,黃連中的活性成分能夠有效抑制炎性反應(yīng),抑制相關(guān)蛋白酶活性,調(diào)節(jié)自噬,以保護(hù)胃腸黏膜[5-6];茵陳中茵陳色原酮等成分則能夠抑制脂多糖誘導(dǎo)的炎癥基因活化,從而發(fā)揮抗炎作用,還可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞,抑制腫瘤細(xì)胞增殖,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7-8]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法,分析化濁解毒法代表藥對(duì)“黃連-茵陳”治療CAG的作用靶點(diǎn)及可能分子機(jī)制,以期探索化濁解毒法治療CAG的具體機(jī)制以及涉及的靶點(diǎn)與通路,并為化濁解毒法治療CAG的臨床應(yīng)用提供合理的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 “黃連-茵陳”藥對(duì)有效活性化合物收集及相應(yīng)靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)分別以“黃連”“茵陳”為關(guān)鍵詞,以口服生物利用度(OB)≥30%及類藥性(DL)≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn),對(duì)藥物有效活性化合物進(jìn)行篩選。再根據(jù)有效活性化合物,運(yùn)用DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://go.drugbank.com)獲取有效活性化合物對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)信息,通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org),將物種設(shè)置為“Homo sapiens”,搜索各個(gè)靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因簡(jiǎn)稱并進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

1.1.2 CAG疾病相應(yīng)靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org)、CTD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ctdbase.org)、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://db.idrblab.net/ttd/)及OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(https://omim.org)對(duì)CAG疾病靶點(diǎn)進(jìn)行檢索,以“chronic atrophic gastritis”為關(guān)鍵詞,檢索完畢后對(duì)檢索疾病靶點(diǎn)進(jìn)行整合。

1.2 研究方法

1.2.1 獲取“黃連-茵陳”藥對(duì)化合物與CAG疾病的交集靶點(diǎn) 通過(guò)Venn 2.1.0 網(wǎng)頁(yè)軟件對(duì)“黃連-茵陳”藥對(duì)化合物靶點(diǎn)與CAG疾病靶點(diǎn)進(jìn)行分析對(duì)比,獲取其交集靶點(diǎn)并以韋恩圖形式呈現(xiàn)。

1.2.2 構(gòu)建“藥物-化合物-靶點(diǎn)-疾病”全局網(wǎng)絡(luò)圖 將藥物及其對(duì)應(yīng)化合物,化合物與疾病交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1,建立“藥物-化合物-靶點(diǎn)-疾病”全局網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行可視化,網(wǎng)絡(luò)中Degree值較高的為核心有效成分。

1.2.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化 將得到的交集靶點(diǎn)上傳到STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.string-db.org),得到蛋白互作信息,并將其導(dǎo)入到Cytoscape 3.6.1軟件進(jìn)行可視化分析,并根據(jù)Degree值獲取PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)。

1.2.4 基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 將得到的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入到DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov),對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,獲得“黃連-茵陳”治療CAG所涉及的分子功能(MF)、細(xì)胞組分(CC)、生物過(guò)程(BP)和信號(hào)通路,最后運(yùn)用R語(yǔ)言軟件和GraphPad軟件進(jìn)行可視化。

1.3 核心有效成分與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接 將篩選的核心有效成分與PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。從結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)研究合作組織(RSCB)PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org)中下載關(guān)鍵靶蛋白的3D結(jié)構(gòu),并通過(guò)Pymol、AutoDock Tools 1.5.6軟件進(jìn)行去水、去配體和加氫、加電荷的處理。從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中下載核心格式為Mol的化合物文件,輸出為pdbqt格式。運(yùn)用AutoDock Tools 1.5.6 軟件進(jìn)行分子對(duì)接以獲取其結(jié)合能,通過(guò)Pymol軟件對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 “黃連-茵陳”藥對(duì)活性化合物及相應(yīng)靶點(diǎn)篩選結(jié)果 通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù),以O(shè)B≥30%及DL≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn),篩選出黃連活性化合物14個(gè)、茵陳13個(gè),去除1個(gè)重復(fù)化合物后,得到“黃連-茵陳”藥對(duì)26個(gè)活性化合物。通過(guò)DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲取有效活性化合物對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)信息412個(gè),運(yùn)用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行去重并刪除其中非人類靶點(diǎn),得到86個(gè)靶點(diǎn)?！包S連-茵陳”藥對(duì)活性化合物信息。見(jiàn)表1。

表1 “黃連-茵陳” 藥對(duì)活性化合物信息

2.2 CAG疾病靶點(diǎn)及“黃連-茵陳”藥對(duì)活性化合物與CAG疾病交集靶點(diǎn)篩選 根據(jù)GeneCards、CTD、TTD、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)檢索CAG靶點(diǎn),去重后共有639個(gè)。將CAG疾病靶點(diǎn)與“黃連-茵陳”藥對(duì)活性化合物靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)比,共得到38個(gè)交集靶點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

圖1 “黃連-茵陳”藥對(duì)活性化合物靶點(diǎn)與CAG靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 “藥物-化合物-靶點(diǎn)-疾病”全局網(wǎng)絡(luò)圖 應(yīng)用Cytoscape 3.6.1軟件將“黃連-茵陳”藥對(duì)活性化合物與CAG的交集靶點(diǎn)進(jìn)行“藥物-化合物-靶點(diǎn)-疾病”全局網(wǎng)絡(luò)圖可視化,并得到Degree值排名前5的“黃連-茵陳”有效活性化合物為槲皮素、異鼠李素、β-谷甾醇、四氫小檗堿、小檗浸堿,為核心有效成分。見(jiàn)圖2。

注:綠色為茵陳所屬化合物,黃色為黃連所屬化合物,紫色為黃連-茵陳共有化合物,紅色為化合物與疾病交集靶點(diǎn),藍(lán)色為非交集靶點(diǎn)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析 將“黃連-茵陳”藥對(duì)活性化合物與CAG的38個(gè)交集靶點(diǎn)上傳到STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,選擇“Homo sapiens”,設(shè)置high confident為0.700,得到精簡(jiǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)信息共有37個(gè)節(jié)點(diǎn)(刪除1個(gè)游離靶點(diǎn)),178個(gè)邊,其中靶點(diǎn)為蛋白,邊為蛋白之間作用關(guān)系,平均Degree值為9.37,高于平均Degree值的靶點(diǎn)蛋白有16個(gè),包括白細(xì)胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF)、Ju-Nana原癌基因(JUN)、IL-1β、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)等。見(jiàn)圖3、表2。

注:節(jié)點(diǎn)顏色越黃說(shuō)明其Drgree值越大,顏色越藍(lán)其Drgree值越小;節(jié)點(diǎn)之間連線越粗聯(lián)系越緊密,越細(xì)聯(lián)系越少

表2 PPI網(wǎng)絡(luò)圖中大于平均Degree值的靶點(diǎn)蛋白信息

2.5 GO功能富集分析與KEGG通路富集分析 對(duì)“黃連-茵陳”藥對(duì)活性化合物與CAG的38個(gè)交集靶點(diǎn)分別進(jìn)行GO功能富集分析與KEGG通路富集分析。通過(guò)GO功能富集分析,得到BP 98個(gè),包括基因表達(dá)的正調(diào)控、細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)、基因表達(dá)負(fù)調(diào)控、細(xì)胞增殖的正調(diào)控、脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)通路等;CC 21個(gè),包括細(xì)胞外空間、胞外區(qū)、細(xì)胞表面、線粒體、分泌顆粒等;MF 18個(gè),包括酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細(xì)胞因子活性、過(guò)氧化物酶活性等。通過(guò)KEGG通路富集分析,得到“黃連-茵陳”治療CAG的通路54條,包括癌癥信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、EGFR通路等。并進(jìn)一步繪制了相關(guān)性較大的癌癥信號(hào)通路圖。見(jiàn)圖4、5、6。

圖4 交集靶點(diǎn)蛋白GO功能富集分析柱狀圖

圖5 交集靶點(diǎn)蛋白KEGG通路富集分析氣泡圖

注:紅色靶點(diǎn)為富集分析癌癥信號(hào)通路所涉及基因

2.6 分子對(duì)接結(jié)果 根據(jù)“藥物-化合物-靶點(diǎn)-疾病”全局網(wǎng)絡(luò)中Degree值選擇前5個(gè)“黃連-茵陳”有效活性化合物,包括槲皮素(MOL000098)、異鼠李素(MOL000354)、β-谷甾醇(MOL000358)、四氫小檗堿(MOL002903)、小檗浸堿(MOL002904);根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)中Degree值選擇前5個(gè)核心靶蛋白,包括IL-6、TNF、JUN、IL-1β、MAPK1。將化合物活性成分與核心靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分子對(duì)接以計(jì)算其結(jié)合能,化合物與靶蛋白結(jié)合能越低,其結(jié)合越穩(wěn)定,越可能相互作用,且結(jié)合能量<0代表兩者結(jié)合有活性,結(jié)合能小于-5 kJ/mol代表結(jié)合能活性較高,并對(duì)結(jié)合能活性較強(qiáng)的2組化合物和蛋白分子對(duì)接模式可視化。見(jiàn)圖7、8、9。

圖7 化合物活性成分與核心靶點(diǎn)蛋白分子對(duì)接結(jié)合能柱狀圖

圖8 小檗浸堿與TNF對(duì)接結(jié)果

圖9 β-谷甾醇與TNF對(duì)接結(jié)果

3 討論

我國(guó)是胃癌的高發(fā)國(guó)家,其發(fā)病率和死亡率均位居前列,且其癥狀和疾病進(jìn)展程度不完全相符,胃癌早期患者并無(wú)特殊癥狀,因此CAG作為胃癌前病變一直都是臨床關(guān)注的重點(diǎn)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為,幽門螺桿菌(Hp)是CAG發(fā)生的主要病因之一,Hp的致病因素包括脲酶、鞭毛、空泡毒素A(VacA)、細(xì)胞毒素相關(guān)基因抗原(CagA)等,其中VacA和CagA起著關(guān)鍵作用,感染VacA陽(yáng)性菌株可導(dǎo)致細(xì)胞空泡化和凋亡,而感染CagA陽(yáng)性菌株則可導(dǎo)致嚴(yán)重的胃炎和胃癌。CagA是一種關(guān)鍵的毒力因子,可以通過(guò)啟動(dòng)細(xì)胞核因子κB(NF-κB)、MAPK及細(xì)胞質(zhì)蛋白酪氨酸磷酸酶/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(SHP-2/ERK)途徑,以轉(zhuǎn)錄和翻譯環(huán)氧化酶2(COX-2)、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、活性氧(ROS)、IL-6、IL-8、干擾素γ(INF-γ)、TNF-α等細(xì)胞因子,從而導(dǎo)致廣泛的炎性反應(yīng),促進(jìn)胃的慢性炎癥、萎縮,乃至于發(fā)展為胃癌[9]。最新的胃癌發(fā)病機(jī)制學(xué)說(shuō)是“炎—癌轉(zhuǎn)化機(jī)制”,該理論認(rèn)為胃癌的發(fā)生發(fā)展是在胃的慢性炎癥基礎(chǔ)上伴隨化生、增生而成,同時(shí)相關(guān)隊(duì)列研究亦支持了該觀點(diǎn)[10-12]。因此,及時(shí)阻斷甚至逆轉(zhuǎn)CAG的發(fā)展對(duì)于防止胃癌的發(fā)生有著重要的意義?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)CAG治療尚無(wú)針對(duì)性的有效辦法,而中醫(yī)藥在阻斷“炎—癌轉(zhuǎn)化機(jī)制”方面頗有成效,李佃貴教授提出的化濁解毒法在CAG治療中有著深遠(yuǎn)前景[3]。本研究通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選及網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建得到“黃連-茵陳”與CAG交集靶點(diǎn)38個(gè),PPI平均Degree值較高的靶點(diǎn)有IL-6、TNF、JUN、IL-1β、MAPK1等,與之相對(duì)應(yīng)的有效活性化合物23個(gè),其中關(guān)聯(lián)頻數(shù)較高的化合物為槲皮素、異鼠李素、β-谷甾醇、四氫小檗堿、小檗浸堿等。

槲皮素是黃酮類化合物,研究表明槲皮素可以抑制Hp的生長(zhǎng),減輕Hp感染小鼠的炎癥和胃損傷,具體機(jī)制可能通過(guò)降解NF-κB因子,防止NF-κB核轉(zhuǎn)位,抑制致炎因子如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的基因表達(dá),抑制炎癥介質(zhì)前列腺素、白三烯的形成,阻止組胺的釋放,從而發(fā)揮抗炎作用[13-15]。槲皮素還具有抗氧化作用,能緩解Hp感染產(chǎn)生的自由基所引起的胃黏膜細(xì)胞DNA氧化損傷[16]。

黃連中的小檗堿類成分在體內(nèi)外試驗(yàn)中能有效消滅Hp,并能抑制Hp在生物表面上的黏附,還能抑制Hp中N-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性來(lái)控制Hp的生長(zhǎng)[17-18]。小檗堿還可抑制促炎基因IL-6、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)、IL-1β的表達(dá),上調(diào)黏膜和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中抗炎基因IL-10的表達(dá),通過(guò)減弱B淋巴細(xì)胞活化因子觸發(fā)的輔助性T淋巴細(xì)胞17(Th17)反應(yīng),減輕Hp誘導(dǎo)的慢性胃炎,從而發(fā)揮抗炎作用[19]。此外,小檗堿還能抑制上皮細(xì)胞凋亡,抑制炎性反應(yīng),同時(shí)降低TNF-α和iNOS水平,以減輕Hp誘導(dǎo)的胃黏膜炎癥[20]。除了小檗堿類成分外,黃連中的棕櫚堿可以通過(guò)靶向調(diào)控脲酶活性位點(diǎn)巰基來(lái)發(fā)揮抗Hp作用,從而抑制脲酶活性和脲酶成熟,減緩Hp對(duì)胃黏膜損傷[21]。

TNF-α是一種促炎細(xì)胞因子,能促進(jìn)IL-1、IL-6的產(chǎn)生,加強(qiáng)炎性反應(yīng),還有促進(jìn)細(xì)胞分化和增殖的作用。TNF-α可以通過(guò)抑制糖原合酶激酶3β(GSK3b)來(lái)促進(jìn)胃上皮細(xì)胞中的神經(jīng)緊張蛋白信號(hào)傳導(dǎo)[22]。此外,在腫瘤微環(huán)境中TNF-α/1型腫瘤壞死因子受體(TNF-α/TNFR1)信號(hào)的激活,可通過(guò)誘導(dǎo)還原型輔酶Ⅱ氧化酶組織者1(Noxo1)和鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白α14(Gna14)促進(jìn)胃腫瘤的發(fā)展,這有助于維持腫瘤細(xì)胞處于未分化狀態(tài)[23]。

IL-6最初作為B淋巴細(xì)胞刺激因子,既能誘導(dǎo)單純CD4+T淋巴細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞,又可抑制調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)發(fā)育,從而促進(jìn)胃黏膜炎癥的發(fā)展。Hp感染的早期胃癌,IL-6水平也高于無(wú)Hp感染,根除Hp后IL-6水平顯著下降[24]。此外,Hp可誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生,并通過(guò)刺激IL-6上調(diào)來(lái)調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)激活,從而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng),并刺激生長(zhǎng)因子產(chǎn)生,促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和致癌轉(zhuǎn)化[25]。

IL-1β基因的多態(tài)性和IL-1β產(chǎn)生的增加與Hp感染相關(guān)胃癌的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān),Hp感染與IL-1β基因多態(tài)性協(xié)同作用,不僅參與胃癌前病變,還可以通過(guò)下調(diào)氫-鉀-ATP酶(H+-K+-ATP)和抑制胃泌素的表達(dá),抑制胃酸分泌來(lái)促進(jìn)胃癌的發(fā)生[26]。同時(shí),IL-1β還通過(guò)激活NF-κB增加癌細(xì)胞的侵襲,從而增強(qiáng)基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達(dá)[27]。有研究發(fā)現(xiàn),IL-1β通過(guò)MAPK和ROS刺激IL-8的表達(dá),參與胃癌的血管重建[28]。

MAPK1又稱細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶,是MAPK家族的一個(gè)成員,主要負(fù)責(zé)生長(zhǎng)因子受體的信號(hào)傳導(dǎo)。MAPK通路參與了胃癌和正常上皮細(xì)胞的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié),調(diào)節(jié)胃癌中MMP的活性,從而影響細(xì)胞遷移和侵襲[29]。此外,磷酸化的MAPK1可激活NF-κB從胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核,進(jìn)一步激活I(lǐng)L-8基因表達(dá),IL-8常被認(rèn)為是CAG的診斷標(biāo)記物[30]。MAPK1還可以調(diào)節(jié)胃上皮細(xì)胞的周期進(jìn)展、增殖,MAPK1活性的抑制則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期G0/G1階段阻滯[31]。

MAPK14又稱p38,參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、細(xì)胞周期進(jìn)展和細(xì)胞凋亡,以及炎癥過(guò)程。研究表明,MAPK14信號(hào)參與調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和EMT觸發(fā)的ROS的產(chǎn)生[32]。MAPK14還可誘導(dǎo)p60和p55亞基的表達(dá),形成NF-κB二聚體,激活NF-κB通路[33]。

EGFR屬于受體酪氨酸激酶群,EGFR信號(hào)通路通常在細(xì)胞增殖、分化和生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用。Hp感染與表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)激活和EGFR表達(dá)上調(diào)有關(guān),可增強(qiáng)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性,導(dǎo)致癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[34],EGFR激活后還可通過(guò)其下游靶點(diǎn)Akt和B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)家族成員,發(fā)揮抗胃上皮細(xì)胞凋亡作用[35]。Hp可激活胃上皮細(xì)胞肝素結(jié)合性表皮生長(zhǎng)因子(HB-EGF)基因表達(dá)和EGFR酪氨酸磷酸化,觸發(fā)EGFR信號(hào)激活,從而促進(jìn)IL-8的產(chǎn)生,并啟動(dòng)胃上皮細(xì)胞的腫瘤轉(zhuǎn)化[36]。Hp菌株還可通過(guò)HB-EGF、EGF受體誘導(dǎo)激活胃泌素啟動(dòng)子[37],Hp刺激后的HB-EGF、MMP-7及胃泌素協(xié)同介導(dǎo)胃癌患者EMT激活并導(dǎo)致基質(zhì)浸潤(rùn)[38]。

Hp誘導(dǎo)MAPK的激活和原癌基因c-Fos、c-Jun活化,參與了胃上皮細(xì)胞的癌轉(zhuǎn)化,促進(jìn)腺癌的發(fā)生[39]。腫瘤抑制因子p53控制著細(xì)胞對(duì)DNA損傷和致癌應(yīng)激的反應(yīng),Hp誘導(dǎo)的p53失調(diào)是增加感染個(gè)體胃癌風(fēng)險(xiǎn)的潛在機(jī)制[40]。VEGFA是炎癥和腫瘤相關(guān)血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,Hp可以激活VEGFA基因表達(dá),其主要是通過(guò)MAPK、c-Jun氨基末端激酶(JNK)及NF-κB等多種信號(hào)途徑調(diào)控[41]。

通過(guò)分析“黃連-茵陳”藥對(duì)治療CAG的KEGG通路富集分析得到相關(guān)通路54條,涉及癌癥信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路EGFR信號(hào)通路等。MAPK通路主要介導(dǎo)宿主細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄、有絲分裂、運(yùn)動(dòng)、黏附、代謝及細(xì)胞凋亡。Hp感染和MAPK激活的聯(lián)合作用很可能會(huì)導(dǎo)致胃上皮細(xì)胞細(xì)胞周期進(jìn)展、增殖及凋亡的改變[29]。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子,通過(guò)調(diào)節(jié)致炎細(xì)胞因子和趨化因子基因的表達(dá),參與多種免疫或炎性反應(yīng)的激活,Hp已被證明可以激活胃癌細(xì)胞中NF-κB,并使炎細(xì)胞因子的表達(dá)增加[9]。TNF家族是一類多功能促炎細(xì)胞因子,可激活與細(xì)胞存活、凋亡、分化炎性反應(yīng)相關(guān)的信號(hào)通路。EGFR信號(hào)通路通常在細(xì)胞增殖、分化和生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用[34]。Hp感染與EGF的激活和EGFR表達(dá)的上調(diào)有關(guān),增強(qiáng)了細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性以及導(dǎo)致了癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移[34]。

化濁解毒法是國(guó)醫(yī)大師李佃貴教授依據(jù)客觀的理論基礎(chǔ)和長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐,提出治療CAG的辨治觀點(diǎn),其認(rèn)為因徒清熱解毒則濕濁不去,徒化濁利濕則熱毒不除,而化濁解毒法的運(yùn)用可使毒除濁化,可達(dá)氣行血暢,積除郁解,痰消火散,恢復(fù)脾升胃降之生理功能,脾氣上升,胃之津液得下,胃氣和降,胃得陰血濡養(yǎng),萎縮的腺體可緩慢恢復(fù)正常[42-43]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)對(duì)“黃連-茵陳”藥對(duì)抗CAG的活性成分、潛在靶點(diǎn)和作用機(jī)制進(jìn)行了初步預(yù)測(cè)。從26種化合物中篩選得與CAG的交集靶點(diǎn)38個(gè),這些靶點(diǎn)可能通過(guò)抗炎、抗氧化、正向調(diào)控細(xì)胞凋亡、負(fù)向調(diào)控血管內(nèi)皮增生、保護(hù)細(xì)胞外基質(zhì)等方面實(shí)現(xiàn)治療作用。本研究還挖掘了54條“黃連-茵陳”藥對(duì)防治CAG的潛在信號(hào)通路,涉及炎癥/感染、表觀遺傳、細(xì)胞分化和生長(zhǎng)周期等。本研究證明了 “黃連-茵陳”藥對(duì)治療CAG的機(jī)制涉及多靶點(diǎn)、多通路和多途徑,而且靶點(diǎn)和信號(hào)通路之間互有調(diào)控、交叉、協(xié)同,形成一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng),也對(duì)“黃連-茵陳”藥對(duì)治療CAG的具體分子信號(hào)通路進(jìn)行了初步揭示,為下一步的實(shí)驗(yàn)研究、藥物研發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。鑒于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)還沒(méi)有完善,后期仍需具備相應(yīng)科研能力的團(tuán)隊(duì)開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證所得的結(jié)果。