黃水多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)表征及益生性研究

楊 嬌，趙興秀，何義國，胡 容，周 靜，張 靖

（四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川宜賓 644000）

黃水是在白酒釀造過程中，從窖泥底部采集的微生物代謝產(chǎn)物。據(jù)統(tǒng)計，黃水的產(chǎn)量占白酒的30%～40%，黃水含有不同比例的酸、醛、乙醇、酯類、單寧、淀粉、蛋白質(zhì)、多糖、還原糖[1]。目前，黃水的應(yīng)用主要集中在有機(jī)酸的提取[2]、醬油和酯化液的生產(chǎn)[3]、窖泥熟化[4]、功能微生物的篩選[5-6]、微生物絮凝劑的生產(chǎn)[7]、活性物質(zhì)的提取[8]、食用菌等的培養(yǎng)[9]。由于技術(shù)研究和開發(fā)的局限性，黃水的價值轉(zhuǎn)化仍存在較大困難。

多糖由兩個或多個由糖苷鍵連接的單糖組成，有許多有益的作用，如抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、美白和保濕。植物多糖被認(rèn)為是安全無害的[10]，張富勇[11]對黃水的抗氧化性進(jìn)行研究，將黃水初步分離成黃水粗多糖和黃水清液,探索黃水抗氧化活性的分布情況，研究證明黃水及黃水多糖具有一定抗氧化能力，Huo 等[12]從黃水中分離出的多糖組分具有一定的免疫調(diào)節(jié)能力。目前，國內(nèi)外關(guān)于黃水的分離純化及結(jié)構(gòu)表征的研究很少。本研究旨在為黃水多糖的產(chǎn)品開發(fā)及作為潛在益生性物質(zhì)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：黃水，四川宜賓某廠酒窖收集。

試劑及耗材：無水乙醇、三氯甲烷、正丁醇、氫氧化鈉、鹽酸，硫酸，苯酚，均為AR，成都市科隆化學(xué)品有限公司；單糖標(biāo)準(zhǔn)品甘露糖（Man）、鼠李糖（Rha）、葡萄糖醛酸（GlcA）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、木糖（Xyl）、半乳糖醛酸（GalA）、核糖（Rib）、阿拉伯糖（Ara）、巖藻糖（Fuc），色譜純，上海源葉科技有限公司。

儀器設(shè)備：SEIENTZ-Z 冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；臺式低速離心機(jī)TD-Z，四川蜀科儀器有限公司；UV-2450 分光光度計，日本Shi-madzu 公司；島津LC-20AD，日本島津Shimadzu；Nicolet 6700FTI 紅外光譜儀，Thermo Scientific公司；D8 X 射線衍射儀，Bruker 公司；紫外掃描光譜儀，Tgem Plus 全波長分光光度計，天根生化科技有限公司；VEGA 3SBU 掃描電子顯微鏡，翱藝儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 黃水粗多糖提取

黃水經(jīng)雙紗布過濾去除雜質(zhì)后備用，加入5倍體積無水乙醇，于0 ℃冰箱內(nèi)靜置沉淀24 h，5000 r/min 離心30 min 后收集沉淀，即為黃水粗多糖。

1.2.2 黃水粗多糖除蛋白

粗多糖沉淀加入原黃水體積去離子水復(fù)溶，溶解后加入1/5 體積sevage 試劑，置于分液漏斗，充分搖晃，靜置20 min 分層，旋開旋塞排出中下層白色絮狀物質(zhì)，上層黃水粗多糖清液反復(fù)脫蛋白至無白色絮狀沉淀生成時停止，收集上層清液透析48 h，凍干后備用，將除蛋白透析后的黃水粗多糖命名為HSP-A。

1.2.3 黃水粗多糖分離純化

按照楊艷敏等人的方法對DEAE 填料及Sephadex G-200 填料進(jìn)行預(yù)處理及回收，選用DEAE-52 層析柱（2.5 cm×40 cm）進(jìn)行濕法裝柱，蒸餾水平衡12 h 后上樣。將HSP-A 配制成10 mg/mL 溶液10 mL，0.45 μm濾膜過濾，一次性注射器吸取10 mL樣品，向柱中緩慢添加。用100 mL 蒸餾水和濃度分別為0.2 mol/L、0.4 mol/L、0.6 mol/L、0.8 mol/L、1.0 mol/L 的NaCl 洗脫，洗脫液流速為1 mL/min，5 min 接1 管多糖洗脫液，每管10 mL，共收集60管，每管取0.2 mL，加0.8 mL 蒸餾水，用苯酚硫酸法檢測多糖含量。以管數(shù)作為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線。根據(jù)峰值曲線，反復(fù)洗脫多次，收集多糖主要峰組分，透析、凍干得到黃水純多糖組分，稱量計算得率。收集主要多糖組分配置成10 mg/mL 黃水粗多糖溶液，0.45 μm 濾膜過濾后，用注射器緩慢繞圈加樣，進(jìn)行Sephadex G-200 柱層析純化（2.5 cm×80 cm），用去離子水洗脫，洗脫液流速為2 mL/min，收集洗脫液，每管10 mL，收集10管，純化后HSP-A組分凍干備用。

1.2.4 HSP-3 紫外吸收光譜和傅里葉紅外光譜分析[13]

精密稱取HSP-3 樣品，用去離子水配制成1 mg/mL 溶液，吸取2 mL 置于分光光度計中在200～400 nm 進(jìn)行全波長掃描，觀察在260 nm 及280 nm處是否有吸收峰。

取純化組分HSP-1（2 mg）與Kbr 粉末研磨均勻，直接涂抹在傅里葉紅外測定儀的透光鏡上測量，掃描范圍4000～400 cm-1。

1.2.5 單糖組成分析[15]

采用HPLC 對HSP-3 進(jìn)行單糖組成鑒定，精密稱取樣品至10 mL 安培瓶中，加入3.0 mL 2 mol/L TFA 于10 mL 安瓿中，充氮，封管，120 ℃酸解4 h，取出加入甲醇氮吹揮干TFA，加3.0 mL 水復(fù)溶。3000 r/min 離心10 min，小心取上清液，萃取3 次。取上清液進(jìn)行液相分析。

1.2.6 HSP-3 X射線衍射分析[16]

采用X 衍射儀對多糖的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,測定范圍為5°～50°(2θ)步長0.02°,計數(shù)時間1 s/步。

1.2.7 HSP-3 掃描電鏡分析

分別稱取0.1 g 各多糖組分，置于電碳膜雙面膠上，利用離子濺射儀噴金30 s 使樣品導(dǎo)電，于掃描電鏡下觀察并收集圖像。

1.2.8 HSP-3 益生性研究

據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，益生菌活性大小與分子量大小具有一定構(gòu)效關(guān)系，即分子量越小的多糖對益生菌增值作用越好。

甘油管菌種活化-MRS 培養(yǎng)基接種菌液，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h 后即為種子液；以無菌生理鹽水梯度稀釋至種子液濃度為10-6CFU/mL。多糖溶液配制按照10 mg/mL 濃度配制多糖溶液，過濾除菌添加到無C 源的MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)，并于0、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h 時測量發(fā)酵液pH 值及600 nm處的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 DEAE-52 陰離子交換柱分離純化黃水多糖結(jié)果

采用DEAE-52 纖維素柱對黃水粗多糖HSPA 進(jìn)行多糖組分洗脫。由圖1 可知，黃水粗多糖在水、0.1 M NaCl、0.3 M NaCl、0.4 M NaCl 洗脫得到的組分在490 nm 處有峰值變化，命名為HSP-1，HSP-2，HSP-3，HSP-4，各組分占比分別為29.71 %、6.03 %、43.45 %、20.82 %。因此收集HSP-3進(jìn)行透析、冷凍干燥再開展后續(xù)實(shí)驗研究。

2.2 SephadexG-200葡聚糖凝膠柱層析結(jié)果

經(jīng)離子柱層析純化后得到的HSP-3 經(jīng)Sephadex G-200 凝膠柱層析柱，得到單一對稱的洗脫峰，證明純化效果較好。收集10 管經(jīng)冷凍干燥后得到黃水多糖組分HSP-3。

2.3 HSP-3 的紫外吸收光譜和傅里葉紅外光譜結(jié)果

如圖3 所示，205 nm 處為多糖的吸收峰，HSP-3 在260 nm 及280 nm 處無最大吸收峰，表明黃水多糖HSP-3純化效果良好，無核酸和蛋白質(zhì)。傅里葉紅外光譜掃描可以分析多糖官能團(tuán)，經(jīng)過FTIR掃描分析可知，HSP-3 在3469 cm-1及2906 cm-1附近均有強(qiáng)吸收峰，歸因于O-H 的伸縮振動，是多糖的特征吸收峰[17]；1146 cm-1及1639 cm-1處的吸收峰是糖醛酸的特殊吸收峰[18]，與單糖組成結(jié)果相符；1389 cm-1、1854 cm-1處的吸收振動是羧酸基團(tuán)的C-O 對稱伸縮振動[19]；641 cm-1的吸收峰是α-吡喃糖苷的環(huán)振動形成[20]；1643 cm-1的較弱吸收峰可能與束縛水的存在有關(guān)。

圖3 HSP-3紫外吸收光譜和傅里葉吸收光譜結(jié)果

2.4 HSP-3單糖組成分析

通過高效色譜儀對HSP-3進(jìn)行單糖組成分析，以12 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品為參照，確定HSP-3 是由甘露糖（6.855 %）、核糖（8.438 %）、半乳糖醛酸（40.575%）、葡萄糖（30.351%）、半乳糖（13.782%）組成，半乳糖醛酸和葡萄糖占比最高，為黃水多糖HSP-3的主要組分。

圖4 HSP-3單糖組成分析

2.5 HSP-3 XRD結(jié)果

HSP-3 在28°、34°、45°、58°、64°、75°、83°有極高尖銳吸收峰，此部分為晶體且晶相含量高、晶粒較大，在52°處有較弱吸收峰，證明此處也有晶體[21]。

2.6 HSP-3 掃描電鏡結(jié)果

圖6 為HSP-3 凍干粉末及掃描電鏡（1000×）圖片，黃水多糖經(jīng)除蛋白、透析、凍干后為白色粉末狀，在掃描電鏡下為網(wǎng)狀溝壑相互纏繞且光滑平整的碎片。多糖由于分子間相互作用呈現(xiàn)網(wǎng)狀、片狀、桿狀的微觀結(jié)構(gòu)[22]，經(jīng)冷凍干燥后呈現(xiàn)海綿狀和纖維狀粉末[23]。

圖5 HSP-3 XRD圖像

圖6 HSP-3 SEM圖像

2.7 多糖益生性研究

如圖7 所示，以葡萄糖為唯一碳源，乳酸菌BH-6 在葡萄糖唯一碳源，HSP-3 為唯一碳源的培養(yǎng)基中呈現(xiàn)相似生長狀態(tài)，即在培養(yǎng)12 h 時出現(xiàn)對數(shù)生長期，在32 h 后菌體開始衰亡。pH 值變化與菌體生長密度狀態(tài)一致，在0～18 h 內(nèi)菌體生長旺盛，pH 值迅速下降，培養(yǎng)18～36 h 之后逐漸緩慢下降。其中，在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中，乳酸菌衰亡速率大于以HSP-3為碳源的培養(yǎng)基，結(jié)論與余茂元等[23]以葡萄糖為碳源培養(yǎng)出現(xiàn)衰亡的結(jié)果一致。

圖7 HSP-3 益生性研究結(jié)果

3 結(jié)論

本研究采用醇沉法從黃水中分離出多糖主要組分HSP，再經(jīng)DEAE-52 纖維素層析法和Sephadex G-100 凝膠色譜法對HSP 純化得到主要組分HSP-3（含量為43.5%），并對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征及益生性研究。HSP-3 為有α-吡喃糖苷骨架的酸性多糖，單糖組成表明HSP-3中含有甘露糖、核糖、半乳糖醛酸、核糖、半乳糖、葡萄糖，晶體狀態(tài)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；益生性實(shí)驗研究表明，HSP-3 與葡萄糖對乳酸菌BH-6的生長促進(jìn)作用具有一致性。鑒于HSP-3的益生性功能，可為進(jìn)一步開發(fā)功能性黃水多糖食品提供理論參考。