OsOFP6基因過表達與RNA干擾水稻轉錄組分析

摘要：為探究卵形家族蛋白6（OFP6）基因過表達（OE）與RNA干擾（RNAi）對水稻基因轉錄表達的影響，并解析OsOFP6基因調控水稻生長發育與抗逆通路，對OsOFP6基因的OsOFP6-OE、OsOFP6-RNAi株系進行轉錄組測序技術（RNA-seq）測序。測序共獲得446 277 340份原始數據，每個樣品比對率均在90.84%以上，OsOFP6-OE與OsOFP6-RNAi共檢測到22 116個基因，以Fold Change≥2且FDRlt;0.05作為篩選標準，ZH11 vs OsOFP6-OE中獲得229個差異表達基因（DEGs），其中包含上調基因161個、下調基因68個；ZH11 vs OsOFP6-RNAi中獲得1 466個差異表達基因，其中包含上調基因464個、下調基因1 002個。OsOFP6-OE的KEGG通路富集分析結果顯示，差異基因在氨基酸糖和核苷酸糖代謝相關通路中較多。OsOFP6-RNAi的KEGG通路富集分析結果顯示，差異基因顯著富集于核糖體相關通路。過表達OsOFP6后，顯示有8個DEGs富集到核氨基酸糖和核苷酸糖代謝通路中，可能參與核苷酸與蛋白質的水解。OsOFP6-RNAi后，其中有28個DEGs被富集到核糖體中，可能參與mRNA的翻譯、翻譯共折疊、添加不依賴翻譯的氨基酸。利用RNA-Seq技術分析了OsOFP6基因過表達與RNA干擾對中花11的影響，發現其通過調控多個OsOFP6下游基因表達，來影響其代謝相關信號通路，為后續分析OsOFP6基因的功能以及解析OFP家族基因的表達調控提供了材料。

關鍵詞：水稻；OsOFP6基因；核糖體；代謝；RNA-seq；差異表達基因

中圖分類號：S511.01 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）22-0024-10

卵形家族蛋白（OFPs）作為一種新型的植物特異性轉錄調控因子，在調節植物生長發育中具有多種功能。第一個OVATE基因被鑒定為控制番茄果實性狀的主要數量性狀位點（QTL）［1］，OVATE蛋白由70個氨基酸組成。隨后，該結構被發現為植物蛋白所獨有，并被命名為OVATE結構域，含有該結構域的蛋白被命名為OVATE家族蛋白［2］。功能研究表明，擬南芥中OFPs（AtOFPs）在調節植物生長發育的多個方面起作用，如葉的發育和小花的形狀。蛋白質相互作用的系統分析結果表明，AtOFPs與植物發育的其他基本調控因子（如TALE同源主蛋白）具有密切的功能聯系［3］。例如，AtOFP1與TALE蛋白的成員BLH1相互作用，這種相互作用導致BLH1從細胞核重新定位到細胞質空間［4］。據報道，AtOFP1和AtOFP4被認為是含有BLH6與KNAT7的多蛋白轉錄調節復合物的組成部分，用于調節次級細胞壁的形成［5］。AtOFP5通過抑制BELL-KNOX TALE復合物的活性，調節擬南芥胚囊的發育。

水稻（Oryza sativa）作為全球主要作物，提供了世界人口21%以上的熱量需求和東南亞人口76%的熱量攝入。在我國約有60%的人口以稻米為主糧，水稻成為最重要的直接經濟作物之一，近年來，為了幫助應對氣候變化和人口增長所帶來的影響，人們在培育抗壓力和產量穩定的水稻品種上投入了大量精力。雖然許多基因在水稻抵御非生物脅迫方面的功能已經被研究過［6-7］，由于控制非生物應激反應的復雜網絡，所涉及的機制仍然難以捉摸。鑒于其在植物生長發育的多個方面的功能，OFPs值得研究。水稻全基因組分析結果顯示，有31個典型的OsOFPs基因［8］，亞細胞定位分析結果表明，大部分OsOFPs蛋白定位在細胞核，少數蛋白以點狀形式分布在細胞質中。時空表達分析結果表明，大多數OsOFPs基因的表達在組織中無特異性，在各個組織中均有表達［9-13］。OFPs基因在植物中分布廣泛，對不同植物OFPs的功能研究表明，OFPs參與植物生長發育的多個方面的調控，可能是通過與不同類型的轉錄因子相互作用或直接調控目的基因（如GA20ox），調節包括果實成熟、形狀與品質、胚珠發育以及非生物脅迫等在內的多種生物過程［5，14-17］，但它們在調控生長發育以及應對非生物脅迫中的具體作用通路在很大程度上仍是未知的。因此，挖掘克隆與水稻理想株型建成以及能夠抵御逆境脅迫的相關基因，并研究其功能，為水稻產業發展提供理論基礎。

筆者所在實驗室前期研究發現，敲除OsOFP6基因后植株半矮化，籽粒形狀發生變化，側根變短；在干旱條件下，與RNAi植株相比，過表達株系失水較慢，H2O2積累較少，在低溫處理下，過表達較RNAi株系表現出較低的相對電導率（REC），表明OsOFP6可以調節植物生長發育，其過表達株系具有抗寒性和抗旱性［17］。

本研究以筆者所在課題組前期通過過表達與RNA干擾技術構建成功的OsOFP6-OE/中花11、OsOFP6-RNAi/中花11和野生型中花11為試驗對象，在水稻灌漿期采集新鮮葉片進行RNA-Seq分析，篩選野生型中花11與OsOFP6-OE、OsOFP6-RNAi的差異表達基因，分析相關功能，為進一步解析OsOFP6基因調控植物生長發育路徑與抗逆機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗材料選自梗稻品種中花11（ZH11），課題組前期利用過表達與RNAi技術獲得的轉基因植株。植物材料于2020年3—7月種植于廣州華南植物園的試驗田中。水稻播種前經2%次氯酸鈉進行表面消毒20 min，利用蒸餾水沖洗干凈后浸種催芽，種子露白后種植于試驗田中，當水稻生長至灌漿期，采摘ZH11與轉基因植株新鮮的葉片并迅速置于液氮中冷凍，儲存在-80 ℃直到總RNA提取，每個樣本均設置3個生物學重復，共9個樣本，將其分別編號為BZH11-1、BZH11-2、BZH11-3、OE6-1、OE6-2、OE6-3、RNAi6-1、RNAi6-2、RNAi6-3。

1.2 主要試劑及儀器

RNAsimple總RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒、SYBR Green試劑盒購自諾唯贊生物科技（南京）有限公司；qTOWER3G IVD實時熒光定量儀購自耶拿儀器分析（北京）有限公司。

1.3 轉錄組測序分析

1.3.1 RNA-Seq測序 采摘9個試驗樣本送至北京百邁客生物科技股份有限公司，對其提取總RNA、構建cDNA文庫、進行高通量測序，使用Illumina測序平臺測序樣品。

1.3.2 原始數據的質控 采用FastQC對原始數據進行統計，將含有接頭的、低質量的讀數去除后，得到高質量的干凈讀數。

1.3.3 干凈讀數分析 參考基因組和注釋文件分別采用來自HISAT2 2.0.4的高效比對系統，利用StringTie進行組裝和定量。對于有生物學重復的樣本通過DESeq2 1.6.3進行樣品組間差異表達分析，獲取ZH11 vs OsOFP6-OE與ZH11 vs OsOFP6-RNAi的差異表達基因集；無生物學重復的樣本，則使用edgeR 3.8.6進行差異分析，將Fold Change≥2且FDRlt;0.05作為差異表達基因的篩選標準。

1.3.4 差異表達基因的層次聚類和KEGG通路富集分析 利用R包進行火山圖與熱圖的繪制，顯示差異表達基因的分布以及在ZH11、OsOFP6-OE與 OsOFP6-RNAi的葉片中的表達；由檢測到的FPKM值，對樣品進行主成分分析（PCA）。對其進行相關性檢測后，KEGG通路富集分析差異表達基因，根據Fold-enrichment和調整后的P值，對與OsOFP6互作的基因進行篩選。

1.4 實時熒光定量PCR驗證差異表達基因

依據轉錄組測序結果，選取7個差異表達基因，通過實時熒光定量PCR方法對RNA-Seq測序結果進行驗證。使用RNA Isolater提取水稻灌漿期的新鮮葉片總RNA，使用NanoDropTM One/OneC 微量 UV-Vis 分光光度計檢測RNA濃度，檢測RNA完整性后，使反轉錄試劑盒反轉錄獲取cDNA。選用 β-acti （LOC_Os11g06390）作為內參基因，使用SnapGene 4.3.6軟件選擇目的基因Genomic Sequence區來設計引物，引物信息見表1。反應體系20 μL，參照諾唯贊的SYBR Green試劑盒使用說明。每個試驗樣品設置3次重復，采用2-ΔΔCT方法分析基因的相對表達量。

1.5 統計分析

組間采用t檢驗分析差異性，數據以平均值±標準誤表示，以α=0.01與α=0.05為差異顯著性判斷標準，利用Excel進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 轉錄組測序數據質控與比對

轉錄組測序技術分析ZH11、OsOFP6-OE、OsOFP6-RNAi的總RNA，結果見表2。9個樣品測序共獲得446 277 340份原始數據，測序數據質量優，可進行生物信息學分析。

2.2 差異表達基因分析

利用RNA-Seq測序共鑒定到22 116個基因，ZH11與OsOFP6-OE相比較，篩選到229個差異表達基因（DEGs），其中161個基因上調表達，68個基因下調表達；而 ZH11與OsOFP6-RNAi比較，篩選到1 466個差異表達基因，其中464個基因上調表達，1 002個基因下調表達（圖1-a、圖1-b、圖1-f），表明OsOFP6-OE對許多基因有負調控作用，而OsOFP6-RNAi對不少基因有正調控作用。圖1-c、圖1-d的熱圖表示了差異表達基因的表達量分布情況。圖1-e的韋恩圖展示了ZH11 vs OsOFP6-OE和ZH11 vs OsOFP6-RNAi中所有的DEGs關系，ZH11 vs OsOFP6-OE與ZH11 vs OsOFP6-RNAi存在100個相同的差異表達基因。3組樣品組內均一性較好，但OsOFP6-OE、OsOFP6-RNAi的基因表達量均與ZH11相比較差異顯著，表明OsOFP6基因可顯著誘導或抑制水稻生長過程中大量基因的表達。

2.3 差異表達基因的GO和KEGG富集分析

2.3.1 差異表達基因的GO富集分析 測序獲得的1 466個DEGs的GO集分析結果表明，共有 1 422 個DEGs被注釋到GO數據庫中，可將其分為生物過程、細胞成分和分子功能3個GO一級功能類別。在ZH11 vs OsOFP6-OE中，203個DEGs注釋為生物過程、細胞成分和分子功能對應的GO二級功能組的數量分別為19、13、10個（圖2-a），在ZH11 vs OsOFP6-RNAi中，1 292個DEGs注釋為生物過程、細胞成分和分子功能對應的GO二級功能組的數量分別為20、13、12個（圖2-b）。表明OsOFP6-OE與OsOFP6-RNAi中大多數DEGs在生物過程中富集，且主要集中在細胞過程、代謝過程、單一生物體過程中；OsOFP6-OE與OsOFP6-RNAi參與細胞成分的差異基因均主要富集于細胞、細胞部分；在分子功能中，OsOFP6-OE與OsOFP6-RNAi的DEGs主要涉及催化活性和結合2個方面。GO[CM（20*2]功能聚類結果表明，水稻在OsOFP6-OE和OsOFP6-RNAi中經歷了非常復雜的生長發育過程。涉及細胞過程、代謝過程、單一生物體過程等生物學功能的基因相對活躍。進一步表明，這些功能途徑可能通過一些細胞調節途徑，如加工和代謝途徑，對刺激和生物調節作出反應，從而使水稻響應外界環境的變化與葉夾角的調節過程。

2.3.2 差異表達基因的KEGG富集分析 對獲得的差異表達基因進行KEGG通路富集分析，結果顯示，共有424個DEGs被注釋為KEGG一級分支（14個DEGs同時富集于OsOFP6-OE和OsOFP6-RNAi）（圖3）。在OsOFP6-OE中，52個DEGs主要注釋在30個KEGG二級分支，在氨基酸糖和核苷酸糖的代謝、二萜類化合物的生物合成中較多（圖 3-a），而在OsOFP6-RNAi中，有386個DEGs主要注釋到KEGG的49個二級分支，在核糖體、氨基酸糖和核苷酸糖的代謝中分布較多（圖3-b）。

差異表達基因KEGG富集分析散點圖的結果表明，ZH11與 OsOFP6-OE相比較（圖4-a），植株中的DEGs主要參與氨基酸糖和核苷酸糖的代謝、二萜類化合物的生物合成以及丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸的代謝、MAPK信號傳導途徑-植物、精氨酸[CM（21]和脯氨酸的代謝途徑與水稻生命活動和信號轉導途徑有一定的相關性，其中氨基酸糖和核苷酸糖代謝、MAPK信號傳導途徑-植物、精氨酸和脯氨酸的代謝途徑中，基因均上調表達。二萜類化合物的生物合成以及丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝途徑中基因包含上調基因和下調基因。這些結果表明，OsOFP6-OE可能通過調節氨基酸糖和核苷酸糖的代謝參與植物激素信號通路以增強水稻抗逆性，而KEGG途徑中的其他基因大多下調表達，這可能與遺傳信息處理和代謝信號轉導途徑的整體變化有關，從而調節蛋白激酶的合成和活性等，來增強水稻的抗逆性。ZH11與OsOFP6-RNAi相比較，DEGs主要富集在α-亞麻酸代謝、核糖體以及角質素、軟木脂和蠟質的生物合成、亞油酸代謝、氨基酸糖和核苷酸糖代謝途徑中，這些途徑可能主要參與植株形態建成，其中角質素、軟木脂和蠟質的生物合成中， 基因均下調表達， 其他4條通路中的DEGs中包含上調基因和下調基因。OsOFP6-RNAi中部分基因的表達量見表3。這可能表明，OsOFP6-RNAi中的這些基因主要參與水稻生長調節網絡中的細胞調節和酶活性，調控植株細胞的生長與增殖，從而調節水稻葉夾角。進一步分析表明，OsOFP6-OE和OsOFP6-RNAi的KEGG途徑中均存在氨基酸糖與核苷酸糖代謝途徑，表明氨基酸[CM（21]糖與核苷酸糖代謝途徑與水稻抗逆性、葉夾角的影響因素密切相關。

2.4 差異表達基因實時熒光定量PCR驗證

從OsOFP6-OE中隨機選擇3個差異表達基因LOC_Os05g33130、LOC_Os08g40680、LOC_Os10g39680，從OsOFP6-RNAi中隨機選擇4個差異表達基因T62、UbL401、UbL404、UbL402，用RT-PCR驗證測序數據。由圖5可知，OsOFP6-OE與中花11相比，葉片中LOC_Os05g33130、LOC_Os08g40680、LOC_Os10g39680基因表達量極顯著下調（Plt;0.01），OsOFP6-RNAi與中花11相比，葉片中T62、UbL401、UbL404、UbL402基因表達量極顯著上調（Plt;0.01），這與RNA-Seq測序結果一致，表明RNA-Seq測序結果可靠。

3 討論與結論

OVATE家族蛋白是植物特異性調控蛋白［4］。OsOFPs的功能研究表明，它們通過植物激素信號通路調節顆粒形狀、植物結構和葉片角度。OsOFP6已被證明可以調節水稻株高、籽粒形狀以及非生物脅迫反應。

為了更好地了解OsOFP6基因對水稻抗逆性以及葉夾角的潛在分子機制，對ZH11與OFP6過表達、OFP6干擾進行比較轉錄組分析，建立了9個測序文庫，確定了22 116個潛在基因。此外，OFP6過表達的229個差異基因與OFP6干擾的1 466個差異基因顯著富集在幾個GO和KEGG通路中，這些通路涉及抗逆與葉夾角調節機制，包括氨基酸糖和核苷酸糖的代謝、二萜類化合物的生物合成、植物激素信號轉導。這些途徑進一步證實OsOFP6基因可調控下游基因的表達，并提高水稻的抗逆性與調節葉夾角。

3.1 OsOFP6基因負向調控水稻葉角大小

研究表明，水稻葉夾角受多種因素調控，一般分為激素途徑和非激素途徑兩大類。油菜素內脂（BR）等激素以及與之相關的各種響應因子共同調控水稻葉夾角的大??；非激素途徑，如ILA1突變體中厚壁細胞數量減少、細胞壁中木聚糖、纖維素含量降低，均減弱了葉枕的機械支撐作用，導致葉夾角增大［18-19］。本研究發現，ZH11 vs OsOFP6-RNAi編碼木聚糖酶抑制劑基因OsHI-XIP（LOC_Os06g51050）發生上調表達。

筆者所在實驗室前期研究發現，OsOFP6-RNAi植株相較于野生型ZH11葉角增大，但對BR 的響應與ZH11一致，表明OsOFP6通過非BR途徑調控水稻葉夾角大小［13，20］。已有研究表明，OsOFP1、OsOFP8、OsOFP19均通過BR途徑調節水稻葉夾角，這表明OsOFPs可以通過激素或非激素途徑調控水稻株型［9，21-22］。

3.2 OsOFP6基因通過生長素途徑影響水稻側根發育

生長素調控植物根系發育［23-25］。AUX/LAX是主要的生長素轉運載體，例如AUX1與LAX3在水稻側根的發育中扮演著重要角色［26-27］。而生長素極性運輸抑制劑結合蛋白可與生長素極性運輸抑制劑N-1-氨甲酰苯甲酸萘酯（NPA）結合，阻礙生長素的運輸，外源施用NPA，會抑制生長素的極性運輸與根系發育、延遲不定根原基出現［27］。

已有研究表明，OsOFP6 基因在幼根、側根中的表達量較高，OsOFP6-RNAi 植株相較于野生型ZH11側根變短。利用10 μmol/L 吲哚-3-乙酸IAA處理后，OsOFP6-RNAi 植株側根長度輕微變短變稀疏；而ZH11 與OsOFP6-OE 的側根顯著變短，密度嚴重降低［13，17］。本研究中，ZH11 vs OsOFP6-RNAi 的DEGs的植物激素信號轉導途徑中存在4個與生長素調節相關的基因的表達量均下調，其中OsARF9（LOC_Os04g36054）是生長素應答因子、OsGH3.6（LOC_Os05g05180）是IAA失活相關基因、LOC_Os05g09480是OsIAA16-生長素反應型AUX/IAA基因家族成員、OsAUX3（LOC_Os05g37470）生長素內向轉運載體，從生長素應答、轉錄活性以及內向轉運載體3個方面，來控制生長素的濃度，影響植株側根的生長發育。因此，我們推測OsOFP6基因通過生長素應答、轉錄活性以及內向轉運載體3個方面調節生長素濃度進而調控水稻側根發育。

3.3 OsOFP6基因通過赤霉素途徑影響水稻植株高度

赤霉素（GA）與水稻株高密切相關，能夠增加細胞分裂數量、促使細胞伸長。目前，發現了許多與赤霉素相關的基因，如OsGA20ox3基因突變體株高增加，GA1和GA4積累增加［28-31］。研究發現OsOFP6-RNAi 植株明顯矮于野生型ZH11，但可以通過外源施加 GA3使OsOFP6-RNAi 植株完全恢復［13，20］，結合轉錄組數據結果，OsOFP6-RNAi可能通過下調編碼赤霉素相關基因OsGA2ox3（LOC_Os01g55240）、OsGA2ox10（LOC_Os05g11810）的表達水平從而使植株矮化。

3.4 OsOFP6基因正調控水稻抗旱和抗冷

OFPs作為植物特異性轉錄因子，調控植物的生長發育。前人研究表明，OFPs基因主要影響生長發育，而在抵御逆境脅迫方面鮮有報道。而我們前期的研究表明，OsOFP6對水稻在抵御干旱脅迫以及冷害方面具有正調控作用。

本研究通過對ZH11和OsOFP6-OE株系、OsOFP6-RNAi株系的差異表達基因的GO富集分析發現，差異基因主要在細胞、催化活性和結合3個過程中富集。從KEGG代謝通路來看過OFP6表達株系的差異表達基因主要與氨基酸糖和核苷酸糖代謝緊密相關，RNAi株系與核糖體關系密切。結合OsOFP6不響應ABA，但過表達株系耐旱，而干擾株系的側根變短，IAA處理后側根密度增加，OsOFP6-OE株系與OsOFP6-RNAi株系對NPA有不同的反應［17］，而水稻在受到干旱脅迫時，體內會產生H2O2等活性氧，活性氧的大量積累，會危害植物的各種生理功能［32］。我們推測，OsOFP6-OE株系可能感知外界環境變化后，促使IAA的產生與轉運，但由于一些氨基酸等代謝途徑的影響，導致信號無法傳遞至ABA途徑，而將信號轉至另一條非激素途徑，提高了過氧化氫酶的活性，從而增強了水稻的抗逆性。根據OsOFP6-RNAi株系較野生型ZH11的次生細胞壁變薄，纖維素和木質素含量減少，使水稻葉夾角增大［20］，可以推測，OsOFP6-RNAi會介導葉枕中的多個調節細胞內物質含量的基因差異表達，進一步影響下游相關基因表達，從而增加水稻的葉夾角。

綜上，本研究利用RNA-Seq技術分析了OsOFP6基因過表達、RNA干擾對中花11的影響，通過分析OsOFP6基因的代謝通路與差異基因表達，推測了OsOFP6基因的作用通路，這將對解析OsOFP6及OFP家族的分子機制研究具有重要意義，可為后續水稻株型建成以及抗逆方面的遺傳改良提供更多資源及新思路。

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收稿日期：2022-12-20

基金項目：國家自然科學基金（編號：31970523）。

作者簡介：黃梅艷（1998—），女，湖北恩施人，碩士，主要從事植物分子生物學研究。E-mail：2017301016@st.gxu.edu.cn。

通信作者：李建雄，博士，教授，主要從事植物分子生物學研究。E-mail：jxli920@gxu.edu.cn。