毛果楊PtIPT5基因的克隆及低溫脅迫表達分析

摘要：為探究異戊稀基轉移酶基因（IPT）的抗逆機理，通過PCR技術從毛果楊葉片中克隆了IPT基因，命名為PtIPT5，對該基因及其蛋白進行生物信息學分析，并使用實時熒光定量技術（qRT-PCR）分析其在毛果楊組培苗不同組織及不同程度低溫處理下的表達特性。結果表明，PtIPT5基因編碼區（coding sequence，CDS）長度為984 bp，可編碼327個氨基酸殘基；PtIPT5蛋白為穩定親水蛋白，且無信號肽和跨膜結構，含有GxxGxGK［S，T］保守基序；系統進化樹分析結果顯示，毛果楊PtIPT5蛋白與美洲黑楊、紅皮柳等楊柳科植物的IPT親緣關系較近；同源蛋白結構域分析結果顯示，IPT蛋白高度保守，只有Cas3_I superfamily結構域；亞細胞定位預測PtIPT5蛋白位于葉綠體中；啟動子分析結果顯示，PtIPT5基因的啟動子序列包含多種脅迫響應的順式作用元件；PtIPT5基因在毛果楊莖段、頂芽、腋芽、主根、側根、幼嫩葉、擴展葉和黃化衰老葉中均有表達，其中在頂芽、根部和幼嫩葉中相對表達量較高；低溫脅迫下，PtIPT5基因的相對表達量隨溫度降低和脅迫時間增加顯著下降，據此推測該基因響應低溫脅迫并發揮調控作用。

關鍵詞：毛果楊；PtIPT5基因；克隆；低溫脅迫；生物信息學；表達分析

中圖分類號：S792.113.01 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）22-0014-10

毛果楊（Populus trichocarpa）是一種從美洲引進的楊屬青楊派的落葉喬木，已完成基因組測序和注釋，具有抗性強、速生等特點，是研究木本植物分子機制、基因功能解析等分子生物學的模式植物［1-2］。

異戊烯基轉移酶（isopentenyl transferases，IPT）基因最早在根癌農桿菌中分離并鑒定，是細胞分裂素（cytokinin，CTK）合成過程中的一個重要限速酶基因［3-4］。多種植物的研究表明，IPT基因能提高植物CTK的含量，在植物葉片衰老、作物產量和抗逆方面發揮重要作用［5-8］。Gan等將IPT基因轉入煙草中，提高了葉片的葉綠素含量和光合速率，延緩了葉片的衰老［9］。毛自朝等的研究表明，轉IPT基因番茄植株的CTK含量明顯增加，坐果率也有所提高［10］。玉山江·麥麥提等的研究表明，在干旱脅迫下，轉IPT基因水稻植株的CTK含量、葉綠素含量、抗旱性和產量顯著高于野生型［11］。史佳俊的研究表明，過表達MdIPT8的轉基因蘋果抗炭疽病能力顯著提高［12］。IPT基因除了可以提高植物的抗旱抗病能力，對植物的抗寒方面也具有影響。張曉等利用基因槍法將IPT基因轉入高羊茅，發現轉基因的植株抗寒能力得到提高并延緩衰老［13］。陳能剛等發現，IPT基因在水稻中表達，可以使低溫脅迫下的水稻維持正常的生理活動，保持較高的根系活力，減輕低溫對植株的傷害［14］。李雙等在低溫脅迫轉IPT基因煙草的試驗中發現，該基因的表達使煙草外植體正常分化，獲得較高的抗性愈傷誘導率，并且經過處理的轉基因煙草IPT基因表達量明顯上調［15］。Xiao等發現，轉IPT基因茄子的葉綠素含量、CTK含量和活性氧清除酶的活性均比野生型茄子高，同時對冷脅迫的耐受性也顯著增強［16］。以上研究表明，IPT基因可以通過調控CTK的水平調節植物的抗性。目前，IPT基因的研究主要集中在草本植物中，在木本植物楊樹中相關研究鮮有報道，尤其在抗寒方面有待進一步深入研究。本研究克隆了毛果楊異戊稀基轉移酶基因PtIPT5，采用生物信息學方法對該基因及其編碼的蛋白進行了序列分析、亞細胞定位預測、組織特異性表達分析及低溫脅迫應答分析，為進一步了解IPT基因在楊樹生長發育和脅迫應答中的生物學功能研究奠定基礎，以期為楊樹育種研究提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本研究于2022年在內蒙古農業大學林木遺傳育種實驗室進行。供試植物材料為毛果楊組培苗，由該實驗室提供，使用MS+0.1 mg/L IBA培養基進行繼代培養。

1.2 毛果楊PtIPT5基因的克隆

采用TIANGEN的RNAprep Pure Plant Plus Kit試劑盒提取毛果楊組培苗葉片總RNA，采用TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent Kit試劑盒將所提取的總RNA反轉錄為cDNA。以毛果楊cDNA為模板，通過PCR擴增其編碼序列，反應體系為：Easy Taq Mix 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各 1 μL，模板2 μL，去離子水6 μL。PCR反應程序為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。引物序列見表1。將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

電泳檢測后使用Omega的DNA凝膠回收試劑盒回收產物，連接到pMD19-T載體并轉化大腸桿菌感受態DH5α，在含有氨芐霉素的LB固體培養基上做抗性篩選，挑取陽性單克隆菌落搖菌，進行菌液PCR驗證后送測序。

1.3 PtIPT5基因生物信息學分析

利用多種在線軟件對PtIPT5基因和蛋白進行生物信息學分析（表2）；使用Clustal X軟件對PtIPT5的同源蛋白進行多序列比對；運用MEGA軟件構建系統進化樹，bootstrap值設置為1 000；利用TBtools軟件對基因的保守基序以及基因結構進行可視化分析［17-19］。

1.4 PtIPT5基因表達分析

取長勢相似且生長期一致的毛果楊組培苗，利用試劑盒（見“1.2”節）提取其RNA并反轉錄為cDNA作為qRT-PCR的模板。使用Light Cycler 480熒光定量PCR系統進行qRT-PCR擴增反應，其反應體系為：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL（TaKaRa公司），上下游引物（10 μmol/L）各加 0.8 μL，模板 1 μL，ddH2O 7.4 μL。反應程序為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，56 ℃ 20 s；72 ℃ 10 s，45個循環。內參基因Actin作為對照，每個樣品重復3次。將得到的數據用2-ΔΔCT法計算該基因的相對表達量，并采用SPSS 25.0單因素方差分析法做差異顯著性分析［20］。

1.4.1 組織特異性表達分析 以毛果楊形態學頂端1～3個節間取樣為幼嫩葉，4～6個節間取樣為擴展葉，余下至根部取樣為泛黃衰老葉，同時取頂芽、腋芽、莖段、主根、側根、幼嫩葉、擴展葉和泛黃衰老葉8個組織，用液氮速凍并放于-80 ℃保存，提取的RNA反轉錄后進行qRT-PCR擴增反應。

1.4.2 低溫脅迫下PtIPT5基因表達分析 將毛果楊組培苗分別置于10、5、0 ℃培養箱處理，25 ℃處理為對照組，除溫度外其他條件均保持一致，每個溫度分別處理0、3、6、12、24 h。取每組毛果楊幼嫩葉，用液氮速凍并放于-80 ℃保存，提取的RNA反轉錄后進行qRT-PCR擴增。所有溫度梯度及處理時間節點均含有3個生物學重復。

2 結果與分析

2.1 PtIPT5基因克隆與生物信息學分析

克隆毛果楊PtIPT5基因，運用生物信息學分析方法，分別對該基因進行編碼氨基酸理化性質分析、同源氨基酸序列比對分析、蛋白系統進化樹分析、同源基因及蛋白結構域比對分析、亞細胞定位預測和順式作用元件分析。

2.1.1 PtIPT5基因的克隆 以毛果楊葉片cDNA為模板進行PCR擴增，克隆得到PtIPT5基因編碼區（CDS），序列長984 bp，編碼327個氨基酸殘基（圖1）。

2.1.2 PtIPT5基因編碼蛋白理化性質分析 通過Prot Param軟件分析PtIPT5氨基酸序列，結果顯示其等電點為6.72，分子量為36 977.54 u，攜帶負電荷的天冬氨酸和谷氨酸（Asp+Glu）的殘基總數為43，攜帶正電荷的精氨酸和賴氨酸（Arg+Lys）殘基總數為42，該蛋白中含量最多的為纈氨酸（Val），占8.9%，其次為亮氨酸（Leu），占8.6%，含量最少的為色氨酸（Trp），占1.2%（圖2）。分子式為 C1 646H2 613N459O479S15，總原子數5 212，脂肪系數為92.08，不穩定指數為34.12，說明該蛋白較為穩定，無信號肽區域，無跨膜結構（圖3）。

Prot Scale在線分析結果表明，PtIPT5蛋白屬于親水性蛋白，在整個肽鏈中的得分最大值為1.956，在115個氨基酸處；最小值為-2.244，在30個氨基酸處。該蛋白存在10個高分值（gt;1.0），分別分布在37～40、53、92、114～117、154～160、162～164、267、287～288、293～294、319～322處；11個低分值（lt;-1.5），分別分布在14～16、18、28～30、82、105～108、144～146、191～194、197、225、247、278處，親水性（GRAVY）的平均水平為-0.212，屬于親水蛋白（圖4）。

2.1.3 PtIPT5同源氨基酸序列比對分析 利用DNAMAN和GENEDOC軟件分析毛果楊PtIPT5、PtIPT3和擬南芥IPT基因家族的9個氨基酸序列。結果顯示，毛果楊和擬南芥氨基酸序列的相似度不高，但均具有GxxGxGK［S，T］基序，是IPT氨基酸序列特有的保守結構域。AtIPT2序列中含有1個（C-X2-C-X12，18-H-X5-H）鋅指基序（圖5）。

2.1.4 IPT蛋白系統進化樹構建 將毛果楊PtIPT5氨基酸序列提交到在線數據庫Phytozome 11.0中，獲得與其同源性較高的氨基酸序列物種有美洲黑楊（Podel.10G025500.1.p）、紅皮柳（Sapur.010G011800.1.p）、木薯（Manes.15G022800.1）、柑橘（orange1.1g020362m）、棉花（Gohir.A10G114600.1）、擬南芥（AT5G19040.1）、蘋果[JP+2]（MD13G1182800）、[JP+1]白樺（BPChr08G05156）、黃瓜（Cucsa.253940.1）、蒺藜苜蓿（Medtr2g022140.1）、大豆（GlymaLee.13G173000.1.p）、玉米（ZmLH145.02G232200.1.p）、水稻（LOC_Os03g59570.1）、小麥（Traes_5BL_CC443DA6C.1）和番茄（Solyc01g080150.3.1） 。運用MEGA 6.0軟件構建系統進化樹（圖6）。

由圖6可知，系統進化樹分為三大類分支：茄科雙[CM（21]子葉番茄單獨聚為一類分支；禾本科水稻、玉米和小麥聚為一類分支；毛果楊、美洲黑楊、紅皮柳、木薯、柑橘、棉花、擬南芥、蘋果、白樺、黃瓜、蒺藜苜蓿和大豆共同聚為一類分支，其中木本植物楊柳科中毛果楊、美洲黑楊和紅皮柳的IPT蛋白共同聚為一類。結合同源氨基酸序列比對分析，毛果楊PtIPT5與美洲黑楊、紅皮柳和木薯的IPT蛋白相似度分別為 98%、86%、72%，與番茄、大豆和水稻的IPT蛋白相似度為57%、55%和54%，表明毛果楊與美洲黑楊、紅皮柳IPT蛋白的親緣關系和進化關系較近且符合生物學分類規律。

2.1.5 IPT基因結構和蛋白保守結構域分析 PtIPT5同源基因保守基序預測分析結果顯示，所有基因均含有基序（motif） 1～6，表明上述6個基序高度保守；除大豆和蒺藜苜蓿外的所有IPT基因均含有基序7，除木薯、水稻、小麥和玉米外的所有IPT基因均含有基序8， 表明基序7和基序8較為保守。

結合蛋白功能域分析，結果顯示，上述6個高度保守基序均在Cas3_I superfamily結構域上，并且本試驗分析的16個IPT蛋白均有且只有Cas3_I superfamily結構域，表明該結構域為IPT家族的核心結構域。同源基因結構分析結果顯示，美洲黑楊、木薯、棉花、柑橘、擬南芥、蘋果、黃瓜、大豆、蒺藜苜蓿和番茄的IPT基因均含有3個外顯子，水稻、小麥的IPT和PtIPT5中含有2個外顯子，除毛果楊、紅皮柳、白樺、水稻、小麥和玉米以外的其他IPT均有內含子（圖7）。

2.1.6 PtIPT5蛋白二級、三級結構預測分析 應用SOPMA在線軟件對蛋白的二級結構進行預測和分析，結果表明，在構成PtIPT5蛋白的327個氨基酸中，有48.62%的α螺旋（alpha helices）、11.31%的延伸鏈（extended strand）、7.34%的β折疊（beta turn）和32.72%的無規則卷曲（random coil）等結構（圖8）。

通過在線軟件SWISS-MODEL預測PtIPT5蛋白的三級結構，結果顯示，該蛋白在二級結構的基礎上進行盤曲或折疊，形成具有規律的三維空間結構。PtIPT5蛋白三維結構由1個PDB號3a8t.1.A的結構為模板建立，屬于植物腺苷酸異戊烯基轉移酶與ATP的復合物，序列的相似性為0.43，一致性為46.89%，氨基酸序列的相似范圍為31～298，GMQE值為0.7（圖9）。

2.1.7 PtIPT5蛋白亞細胞定位預測分析 利用WOLF PSORT軟件對PtIPT5蛋白進行亞細胞定位預測，結果表明，PtIPT5蛋白在葉綠體中得分為9.5，初步推斷該蛋白可能在葉綠體內發揮一定作用（表3）。

2.1.8 順式作用元件分析 利用在線軟件PlantCARE分析PtIPT5基因啟動子區域2 000 bp的順式作用元件（表4）。該基因啟動子區域具有多種順式作用元件，如光響應元件AE-box、G-box、L-box、TCT-motif、AT1-motif、GA-motif等，以及低溫誘導元件LTR、脫落酸響應元件ABRE、赤霉素響應元件P-box、生長素響應元件TGA-element等。表明PtIPT5基因可能與光響應、激素響應和低溫等生物脅迫和非生物脅迫的多種生物功能相關。

2.2 PtIPT5基因的組織特異性表達分析

以毛果楊莖段、頂芽、腋芽、主根、側根、幼嫩葉、擴展葉和泛黃衰老葉不同組織的cDNA為模板，通過qRT-PCR檢測分析各組織PtIPT5基因的相對表達量（圖10）。結果顯示，PtIPT5基因在上述各組織中均有表達，其中在泛黃衰老葉中的表達量最低，其次是莖段；在頂芽和根部中表達量較高，其次是幼嫩葉，說明PtIPT5基因在根部、頂芽和幼嫩葉等分生能力強的組織中表達量較高。

2.3 低溫脅迫下PtIPT5基因的表達分析

對毛果楊組培苗進行低溫脅迫，利用qRT-PCR檢測其幼嫩葉中PtIPT5基因的相對表達量。由圖11可知，在25 ℃下，幼嫩葉隨時間變化其PtIPT5基因的相對表達量幾乎不變，維持在1.2左右；之后溫度降低，在10 ℃脅迫下，幼嫩葉隨時間變化其PtIPT5基因的相對表達量降低，在24 h時略微升高；在5 ℃脅迫下，幼嫩葉隨時間變化其PtIPT5基因的相對表達量降低，在12 h時升高，隨后又降低，在24 h時趨近于0；在0 ℃脅迫下，幼嫩葉隨時間變化其PtIPT5基因的相對表達量降低，在24 h時趨近于0。在0～3 h 時，在10、5、0 ℃脅迫下幼嫩葉基因的相對表達量均急劇下降，而在12～24 h 時下降幅度較緩。以上結果表明，不同的低溫及脅迫時長均影響幼嫩葉中PtIPT5基因的表達，該基因對低溫逆境具有一定程度的適應和調控。

3 討論與結論

異戊稀基轉移酶由IPT基因編碼，根據其氨基酸序列結構分為ATP/ADP-IPTs和tRNA-IPTs等2類：ATP/ADP-IPTs以ATP或ADP作為其首選底物，參與異戊烯基腺嘌呤（iP）型和反式玉米素（tZ）型細胞分裂素的生物合成；而tRNA-IPTs通過將異戊烯基轉移到tRNA中腺嘌呤的N6原子上，參與順式玉米素（cZ）型細胞分裂素的合成［21-22］。

克隆獲得毛果楊中與細胞分裂素相關的PtIPT5基因，通過生物信息學分析方法了解該基因及其編碼蛋白的結構特點與功能。該基因CDS序列長984 bp，可編碼327個氨基酸殘基。PtIPT5與擬南芥氨基酸序列中均含有GxxGxGK［S，T］保守功能區段，該區段是ATP/GTP 和 DMAPP 的結合域，也是細胞分裂素底物合成的結合位點［23］。毛果楊和擬南芥IPT家族的同源氨基酸序列比對顯示，擬南芥AtIPT2序列中含有（C-X2-C-X12，18-H-X5-H）鋅指基序（圖6），該基序在保持真核生物tRNA-IPTs酶活性中具有重要的作用［23］。PtIPT5[JP3]序列中無此基序，推測PtIPT5屬于ATP/ADP-IPTs并參與異戊稀基腺嘌呤（iP）和反式玉米素（tZ）的生物合成。同源蛋白結構域比對表明，PtIPT5蛋白高度保守，Cas3_I superfamily是該蛋白保守結構域。本研究中PtIPT5亞細胞定位預測主要在葉綠體中，Huynh等研究發現IPT基因可以調控CTK的生物合成，提高葉綠素含量，從而提高植物光合效率［24］，由此推測該蛋白可能參與葉片光合作用。

IPT基因的表達具有組織特異性。張停林等對黃瓜中的IPTs進行分析，發現不同的IPT基因在黃瓜各個組織中的表達量有明顯差異，在根、葉、幼果中表達量較高［25］。Cai等在麻風病樹中克隆了6個IPT基因，分析發現這些基因主要在根、頂端分生組織和成熟葉片中表達［26］。張勇研究發現，SlIPT4在番茄幼嫩葉中表達量較高，隨葉片的發育和成熟其表達量逐漸降低［27］。研究認為，內源細胞分裂素合成后能通過維管系統長距離運輸到其他部位，進而影響植物的生長發育［28］。Lacombe等研究發現，tZ型CTK主要在植物根系中合成，通過木質部轉移到形態學上端幼嫩組織中，而iP型CTK多數在幼嫩葉中合成并通過韌皮部轉移到根系［29］。綜上可知，PtIPT5基因可能參與tZ型和iP型CTK的生物合成，因此該基因在毛果楊根、頂芽和幼嫩葉中的相對表達量較高，結果與前人研究結果［27］相符，推測其可能調控葉片的前期生長發育和后期衰老。

低溫是影響植物生命活動的非生物脅迫之一［30］。植物自身可以通過調節光合呼吸，改變酶活性和激素含量，調控相關基因的表達，以減緩長時間低溫脅迫的傷害［31-32］。低溫脅迫下，植物內源脫落酸（abscisic acid，ABA）的含量發生變化［33］。擬南芥和水稻在低溫下其葉片中ABA含量顯著增加，而CTK含量逐漸減少，且有研究表明IPT基因的表達受ABA的負調控［34-36］。通過對野生型毛果楊組培苗進行不同程度低溫脅迫處理后，對幼嫩葉中PtIPT5基因進行qRT-PCR分析，發現溫度的降低和脅迫時間的延長均抑制了PtIPT5基因的表達。本研究中毛果楊幼嫩葉在5、0 ℃脅迫下其PtIPT5基因的相對表達量呈下降趨勢，其原因可能是葉片受到低溫脅迫后，ABA含量增加，抑制了PtIPT5基因表達，由于植物發生應激反應，在處理12 h時該基因的相對表達量有所上調繼而下降；在10 ℃處理組中，毛果楊葉片的應激反應可能出現在24 h時或脅迫更長時間時；在0 ℃處理組中，幼嫩葉耐低溫能力相對較低，PtIPT5基因的相對表達量持續下降。以上結果表明，PtIPT5基因可能在低溫脅迫的過程中發揮著調控作用，其表達受低溫負調控并可能參與突發環境變化或長期響應的過程。

為進一步挖掘IPT基因在楊樹抗逆分子機制，定向改良楊樹品種方面的潛能，計劃對PtIPT5進行基因功能驗證，以闡明該基因在毛果楊細胞分裂素生物合成途徑的催化特性以及在生長發育過程中的調控作用，為培育抗逆楊樹優良新品種提供候選基因。

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收稿日期：2023-01-02

基金項目：國家科技重大專項（編號：2018ZX08020002-005-005）。

作者簡介：畢田田（1997—），女，遼寧朝陽人，碩士研究生，主要從事林木生物技術研究。E-mail：1756988574@qq.com。

通信作者：白玉娥，博士，教授，主要從事林木遺傳育種研究。E-mail：baiyue@imay.edu.cn。