青稞內(nèi)生細(xì)菌RKZ-05對(duì)禾谷鐮刀菌的拮抗作用及其分子鑒定

摘要：由禾谷鐮刀菌復(fù)合種引起的小麥赤霉病和鐮刀菌毒素污染嚴(yán)重影響小麥的產(chǎn)量和質(zhì)量。從山南、日喀則、林芝3個(gè)地區(qū)的青稞中篩選出對(duì)禾谷鐮刀菌具有較好拮抗作用的菌株，為赤霉病病害及毒素污染控制提供生物防治菌株資源，同時(shí)為高原地區(qū)植物內(nèi)生菌的資源開發(fā)提供參考。從青稞樣品中分離篩選出對(duì)禾谷鐮刀菌具有較好生防效果的菌株RKZ-05，經(jīng)過形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化特征分析和分子生物學(xué)鑒定分析，明確其為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。利用平板對(duì)峙法分析其抑菌譜范圍，隨后對(duì)RKZ-05無菌發(fā)酵液的抑菌控毒效果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其能顯著抑制禾谷鐮刀菌菌絲生長和DON毒素合成。通過對(duì)拮抗物質(zhì)合成相關(guān)基因的擴(kuò)增，確定該菌具有生防相關(guān)的 3 個(gè)合成基因——桿菌霉素 D 合成相關(guān)基因 bamC、豐原素合成相關(guān)基因 fenB 以及桿菌溶素合成相關(guān)基因 bacAB，預(yù)測該菌株可以合成桿菌霉素 D 、豐原素及芽孢桿菌溶素3種拮抗物質(zhì)。菌株RKZ-05除了對(duì)禾谷鐮刀菌具有較好的拮抗性，還對(duì)其他多種病原真菌具有明顯抑制作用，說明該菌株具有廣譜的拮抗能力。

關(guān)鍵詞：禾谷鐮刀菌；青稞；內(nèi)生細(xì)菌RKZ-05；拮抗作用；分子鑒定；生防效果

中圖分類號(hào)：S182；S435.121.4+5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2023）22-0113-08

小麥赤霉病是影響小麥健康的重要真菌病害，它是以禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）為主的多種鐮刀菌復(fù)合侵染所致［1］，容易受氣候等多方面因素影響。小麥赤霉病在我國發(fā)病率不斷上升，長江中下游和江淮地區(qū)是高發(fā)地區(qū)，在最嚴(yán)重的年份，25%的種植區(qū)域會(huì)受到影響，引起重大經(jīng)濟(jì)損失［2］。赤霉病的發(fā)生不僅嚴(yán)重影響小麥的產(chǎn)量，而且在病害侵染過程中會(huì)產(chǎn)生多種有毒次生代謝產(chǎn)物，如脫氧雪腐鐮刀烯醇（deoxynivalenol，DON）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN），這類生物毒素會(huì)直接存留、累積在籽粒中，嚴(yán)重影響谷物質(zhì)量安全，對(duì)人類健康產(chǎn)生危害［3］。其中屬DON毒素污染范圍最大，污染情況最為嚴(yán)重。在生產(chǎn)上，化學(xué)藥劑防控是控制病害和鐮刀菌毒素產(chǎn)生的最有效措施之一［4］。但長期使用化學(xué)農(nóng)藥不僅嚴(yán)重威脅環(huán)境生態(tài)健康，還會(huì)導(dǎo)致禾谷鐮刀菌抗性菌株大量出現(xiàn)，有時(shí)還會(huì)刺激鐮刀菌毒素的合成與積累，加劇毒素污染等問題［5］。因此，探尋針對(duì)小麥赤霉病及禾谷鐮刀菌毒素的生物防治措施，對(duì)保障小麥質(zhì)量安全意義重大［6］。近年來，以特異性抑菌效果的微生物或其衍生物為核心的生物防治措施日益受到關(guān)注，其中芽孢桿菌屬、假單胞菌屬及鏈霉菌屬等是最為常見的生防菌，他們具有顯著的防治赤霉病能力［7］。而芽孢桿菌屬是研究最多的生防菌，如枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefacien）等對(duì)禾谷鐮刀菌都有一定的抑制作用。生物防治具有對(duì)環(huán)境沒有污染、不容易產(chǎn)生抗性且對(duì)人畜危害較低的優(yōu)勢，因此篩選出對(duì)禾谷鐮刀菌具有拮抗效果的菌株，并研制出新的生防菌劑已成為人們?nèi)諠u關(guān)注的重點(diǎn)。

植物內(nèi)生菌（endophyte）存在于植物器官或組織的細(xì)胞或細(xì)胞間隙中，對(duì)宿主植物的正常生長和植株健康不會(huì)產(chǎn)生影響［8］，并且已有研究發(fā)現(xiàn)大部分的內(nèi)生菌具有促進(jìn)植物生長和增加對(duì)病害、逆境的抵抗力等作用。此外，內(nèi)生菌還可以分解有毒物質(zhì)［9］。青稞（Hordeum vulgare L.var.nudum HK.f.）是禾本科大麥屬的一種禾谷類作物，一般也可稱為裸大麥、米麥和元麥，其在成熟時(shí)籽粒內(nèi)外稃與穎果分離，籽粒裸露［10］。青稞具有成熟期短、耐寒性強(qiáng)等生長特性，在我國主要種植區(qū)域?yàn)槲鞑刈灾螀^(qū)和青海省全境及甘肅省、四川省和云南省的局部地區(qū)，是高原地區(qū)主要的糧食作物之一［11］。由于青稞特殊而極端的生長條件，其內(nèi)生細(xì)菌的作用仍然未被充分發(fā)掘。本研究以山南、日喀則及林芝3地的青稞籽粒內(nèi)生菌為來源，篩選出對(duì)禾谷鐮刀菌具有較好生防效果的菌株RKZ-05；進(jìn)一步對(duì)該菌株進(jìn)行研究，分析其形態(tài)學(xué)、生理生化特征和分子生物學(xué)基因序列特征，并對(duì)其抑菌譜和抑菌控毒效果進(jìn)行研究，以期為抑菌機(jī)制研究和菌劑開發(fā)提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)為高原地區(qū)植物內(nèi)生菌的資源開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌株：擬枝孢鐮刀菌 （Fusarium sporotrichiodies）、梨孢鐮刀菌（F. poae）、層出鐮刀菌（F. proliferatum）、藤倉鐮刀菌（F. fujikuroi）、輪枝鐮刀菌（F. verticillioides）、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）、木賊鐮刀菌（F. equiseti）、亞洲鐮刀菌（F. asiaticum）、禾谷鐮刀菌（F. graminearum）、厚垣鐮刀菌（F. chlamydosporum）、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、黑附球菌（Epicoccum nigrum）及鏈格孢菌（Alternaria alternate）。以上菌株由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所分離并置于50% 甘油中，-80 ℃ 保存。

培養(yǎng)基：LB 培養(yǎng)基/培養(yǎng)液（Luria-Bertani培養(yǎng)基/培養(yǎng)液），用于細(xì)菌菌株的分離和擴(kuò)繁；PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基），用于真菌菌株的生長及抑菌譜的測定；綠豆湯培養(yǎng)基，用于誘導(dǎo)禾谷鐮刀菌分生孢子的產(chǎn)生［12］；TBI培養(yǎng)基（單端孢霉烯生物合成誘導(dǎo)培養(yǎng)基），用于誘導(dǎo)禾谷鐮刀菌DON毒素的合成［13］。

試劑盒：細(xì)菌DNA提取試劑盒（FastPure Bacteria DNA Isolation Mini Kit，諾唯贊，DC103-01）；革蘭氏染色試劑盒（Gram Staining Kit索萊寶，G1060）；芽孢桿菌生理生化分析試劑盒（HiBacillusTM Identification Kit，HiMedia Laboratories，KB-013）。

1.2 青稞內(nèi)生拮抗細(xì)菌的分離

2022年7月在西藏地區(qū)收集青稞籽粒，并帶回江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所完成后續(xù)試驗(yàn)。以禾谷鐮刀菌標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)H-1為篩選菌株，分離青稞內(nèi)生拮抗細(xì)菌。取75% 乙醇消毒后的青稞籽粒10 g于無菌粉碎機(jī)中，加入 90 mL 無菌水充分研磨并梯度稀釋，取106倍稀釋后的 100 μL稀釋液涂布于LB平板上，37 ℃倒置培養(yǎng) 24 h。待上述平板長出菌落后，均勻噴灑 PH-1 的孢子液（105 個(gè)/mL）到平板上，待表面干燥后放入 37 ℃ 培養(yǎng)箱，倒置培養(yǎng) 24 h。挑選可產(chǎn)生抑菌圈的菌落進(jìn)行復(fù)篩，統(tǒng)計(jì)抑菌圈產(chǎn)生情況，選擇拮抗作用較好的菌株進(jìn)行進(jìn)一步分析。

1.3 菌株RKZ-05形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定

取分離純化完成的菌株在 LB 培養(yǎng)基上進(jìn)行平板劃線，37 ℃培養(yǎng) 24 h 后觀察菌落形態(tài)。取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng) 24 h后收集菌液，2 000 r/min 離心 15 min后棄上清，收集菌體，經(jīng)戊二醛固定細(xì)胞形態(tài)，乙醇梯度脫水后，在電子顯微鏡（EVO-LS10，ZEISS，Jena，Germany）下觀察其微觀形態(tài)。使用試劑盒進(jìn)行革蘭氏染色、甲基紅試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、糖醇類發(fā)酵試驗(yàn)和耐鹽試驗(yàn)等生理生化試驗(yàn)。

1.4 菌株RKZ-05的分子生物學(xué)鑒定

以菌株 RKZ-05 的基因組 DNA 為模板，擴(kuò)增16S rDNA及gyrB基因并進(jìn)行T-A克隆，隨后送至生工生物工程（上海） 股份有限公司進(jìn)行測序，引物序列見表1。根據(jù)測序結(jié)果，在 NCBI 網(wǎng)站下載相關(guān)序列，用 ClustalX 1.83 軟件進(jìn)行比對(duì)，之后利用MEGA 7.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 菌株RKZ-05抑菌譜測定

采用皿內(nèi)對(duì)峙的方式，在PDA雙層平板中央分別接入 5 mm 大小的鐮刀菌屬及其余病原真菌的菌餅，在距平板中心 25 mm 處的4點(diǎn)放置牛津杯，隨后在牛津杯中加入100 μL搖床培養(yǎng) 24 h 的 RKZ-05 的菌液，25 ℃培養(yǎng) 3～5 d，測量牛津杯邊緣至真菌菌落邊緣的距離，即抑菌帶寬度。每個(gè)處理重復(fù) 3 次。

1.6 菌株RKZ-05無菌發(fā)酵液對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌控毒作用分析

取LB培養(yǎng)液中搖床培養(yǎng) 24 h 的 RKZ-05 菌液（1×109 CFU/mL），菌液經(jīng)12 000 r/min 離心 15 min，取上清液過0.22 μm 微孔濾膜，由此獲得無菌發(fā)酵液。在 PDA 培養(yǎng)基中加入無菌發(fā)酵液，搖勻后配制成終濃度為10%、20%和50%的培養(yǎng)基，倒板后接種禾谷鐮刀菌，25 ℃培養(yǎng) 3 d，以添加 LB 培養(yǎng)基為空白對(duì)照，3 d 后測量菌落直徑。

接種1 mL禾谷鐮刀菌分生孢子（1×105個(gè)/mL）于含有10%、20%、50%無菌發(fā)酵液的30 mL TBI 培養(yǎng)基中，以空白 TBI 培養(yǎng)基為對(duì)照，25 ℃避光培養(yǎng) 7 d 后用滅菌紗布過濾收集菌絲和2 mL濾液，菌絲烘干并稱質(zhì)量，濾液進(jìn)行氮吹，隨后用1 mL甲醇復(fù)溶，過0.22 μm有機(jī)相濾膜后采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）測定 DON 毒素含量并計(jì)算單位菌絲的產(chǎn)毒量［13-14］。

1.7 拮抗基因預(yù)測

以菌株 RKZ-05 的基因組 DNA 為模板，PCR擴(kuò)增已報(bào)道的抗菌物質(zhì)合成相關(guān)基因［15］，包括伊枯草菌素（iturin）合成基因 ituC、桿菌霉素 D（bacillomycin D）合成基因 bamC、豐原素（fengycin）合成基因 fenB、芽孢桿菌表面活性素（sufaction）合成基因 sfp、羊毛硫類抗菌物質(zhì)（ericin）合成基因 esiSa、芽孢桿菌溶素（bacilysin）合成基因 bacAB。引物序列見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 青稞內(nèi)生拮抗菌的篩選

經(jīng)過初篩和復(fù)篩，從山南、日喀則及林芝3地的青稞籽粒中共篩選到26株對(duì)禾谷鐮刀菌具有拮抗效果的內(nèi)生菌，抑菌圈寬度范圍為2～10 mm，其中RKZ-05的拮抗作用較為明顯，分生孢子抑菌圈寬度為（8.35±0.11） mm（圖1）。

2.2 菌株RKZ-05的形態(tài)學(xué)及生理生化分析

菌株RKZ-05在LB培養(yǎng)基上形成了不透明、乳白色的菌落，邊緣具有不規(guī)則性，表面較為平滑，無褶皺。在革蘭氏染色試驗(yàn)中菌體被染成藍(lán)紫色，說明其為陽性菌。其電鏡照片表明菌體呈桿狀，長度為1.0～2.0 μm。生理生化結(jié)果表明，菌株 RKZ-05 可以利用甘油、蔗糖、甘露醇、葡萄糖、阿拉伯糖、海藻糖，丙二酸試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用反應(yīng)和精氨酸脫羧反應(yīng)等試驗(yàn)為陰性，V-P反應(yīng)、ONPG反應(yīng)呈陽性（圖2、表2）。

2.3 菌株RKZ-05的分子生物學(xué)鑒定

以提取的RKZ-05的DNA為模板，分別擴(kuò)增16S rDNA以及gyrB基因序列，得到1 600 bp左右的條帶并進(jìn)行測序。將測序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)（圖3），結(jié)果表明拮抗菌株 RKZ-05 的16S rDNA 核酸序列與多株芽孢桿菌屬菌株的同源性較高，初步鑒定為芽孢桿菌屬。隨后對(duì)芽孢桿菌鑒定基因gyrB進(jìn)行擴(kuò)增，獲得1 450 bp左右的片段并在NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)（圖3），結(jié)果發(fā)現(xiàn)RKZ-05的[CM（21]gyrB基因序列與多株貝萊斯芽孢桿菌相似性較高，但未發(fā)現(xiàn)處于同一分支的貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis，圖4），根據(jù)其生理生化及形態(tài)學(xué)特征，鑒定菌株RKZ-05為貝萊斯芽孢桿菌。

2.4 菌株RKZ-05的抑菌譜分析

平板對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果（圖5） 表明，菌株 RKZ-05 對(duì)多種植物病原真菌都具有明顯的抑制作用，其中對(duì)鐮刀菌屬中的梨孢鐮刀菌、木賊鐮刀菌及禾谷鐮刀菌抑菌效果較好，抑菌帶寬度范圍為 4～6 mm；對(duì)擬枝孢鐮刀菌、層出鐮刀菌和亞洲鐮刀菌抑制效果較差；對(duì)其他病原真菌中的稻瘟病菌的抑菌效果最好，抑菌帶寬度達(dá) 8 mm 左右；對(duì)大麗輪枝菌、灰葡萄孢及黑附球菌抑菌效果較差，抑菌帶寬度均小于3 mm。

2.5 菌株RKZ-05無菌發(fā)酵液對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌控毒作用分析

由圖6可以看出，菌株RKZ-05的無菌發(fā)酵液能顯著抑制禾谷鐮刀菌 PH-1 菌絲的生長，20%濃度處理下菌絲生長抑制率達(dá) 45%，50%濃度無菌發(fā)酵液處理下菌絲生長抑制率達(dá)62%（圖6-A、圖 6-B）。 進(jìn)一步分析無菌發(fā)酵液對(duì) DON 毒素產(chǎn)生的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其能顯著抑制毒素的合成，10% 濃度無菌發(fā)酵液處理后菌絲中DON毒素的含量較對(duì)照降低了79%，當(dāng)無菌發(fā)酵液濃度達(dá)50%時(shí)，菌絲中DON毒素的含量為0（圖6-C）。

2.6 菌株RKZ-05拮抗物質(zhì)基因的鑒定

以RKZ-05的DNA為模板，PCR擴(kuò)增拮抗物質(zhì)合成相關(guān)基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)幾種常見抗菌脂肽類物質(zhì)合成基因，例如桿菌霉素D合成相關(guān)基因bamC、豐原素合成相關(guān)基因fenB以及桿菌溶素合成相關(guān)基因bacAB被成功擴(kuò)增（圖7）。由此推測，菌株RKZ-05的拮抗產(chǎn)物中可能包含桿菌霉素D、豐原素及芽孢桿菌溶素， 但具體的拮抗物質(zhì)還需進(jìn)一步的分離純化和鑒定。

3 討論

植物內(nèi)生菌物種極為豐富，主要包括真菌、細(xì)菌和放線菌三大類，由于其能夠產(chǎn)生豐富多樣的具有農(nóng)藥活性的次生代謝產(chǎn)物，在植物病害生物防治方面發(fā)揮著巨大作用［16］。我國藏區(qū)居民主要食糧、燃料和牲畜飼料——青稞主要分布于我國西北和西南各省，適宜生長于高原清涼氣候環(huán)境中，因此對(duì)于青稞內(nèi)生微生物資源的研究具有廣闊的探索和發(fā)展前景。本研究從山南、日喀則及林芝3地的青稞籽粒中分離篩選出26株內(nèi)生菌，并從中挑選出1株對(duì)禾谷鐮刀菌具有較好拮抗效果的細(xì)菌RKZ-05，通過16S rDNA和 gyrB基因序列鑒定，顯示其為貝萊斯芽孢桿菌。此外，菌株RKZ-05不僅對(duì)禾谷鐮刀菌有一定的拮抗效果，還對(duì)多株鐮刀屬真菌及多株常見病原真菌均具有拮抗效果，這表明該菌株抑菌范圍較廣，對(duì)多種真菌病害防治均具有一定療效。

貝萊斯芽孢桿菌屬于芽孢桿菌屬的一個(gè)新種，由于其具有廣譜抑菌活性和促生長作用，在生物防治、醫(yī)療醫(yī)藥、食品加工和化能化工等方面具有重要作用［17］。近些年國內(nèi)外利用貝萊斯芽孢桿菌進(jìn)行生物防治的研究報(bào)道不斷涌出，主要體現(xiàn)在協(xié)同植物生長、拮抗病原菌、誘導(dǎo)產(chǎn)生系統(tǒng)抗性和分泌抑菌物質(zhì)等方面。沙月霞等從水稻葉片中分離出能抑制稻瘟病病菌菌絲生長的貝萊斯芽孢桿菌E69，并明確其具有廣譜的抑菌活性［18］；宗英等從感染赤霉病的麥穗上篩選到 1 株可高效抑制禾谷鐮刀菌的貝萊斯芽孢桿菌 JS25R［19］；劉雪嬌等分析了貝萊斯芽孢桿菌 3A3-15 對(duì)由尖孢鐮刀菌引起的大豆根腐病的生防作用和促生機(jī)理［20］；Wambacq等評(píng)估了NRRL B-23189對(duì)青霉菌株的拮抗作用［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌菌株 RKZ-05 能夠抑制禾谷鐮刀菌菌落生長，10%的無菌發(fā)酵液處理后能顯著抑制菌絲生長和DON毒素的產(chǎn)生，表明其具備防治由禾谷鐮刀菌引起的小麥赤霉病病害的潛力，同時(shí)亦能降低小麥鐮刀菌毒素污染，但其具體的防治效果還需進(jìn)一步的田間試驗(yàn)驗(yàn)證。

已有研究報(bào)道，芽孢桿菌能夠產(chǎn)生表面活性素、伊枯草菌素等多種拮抗類物質(zhì)，破壞病原菌的細(xì)胞膜，引起細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外滲，從而達(dá)到抑制病原真菌生長的作用［22］。貝萊斯芽孢桿菌主要通過分泌脂肽類抗生素、聚酮類化合物［23-25］和抗菌蛋白等［26］產(chǎn)生抑菌作用。Chowdhury 等研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌菌株FZB42 能夠產(chǎn)生表面活性素、豐原素和桿菌霉素D等物質(zhì)，能夠改變立枯絲核菌的菌絲體和分生孢子的細(xì)胞壁以及細(xì)胞質(zhì)膜的形態(tài)，抑制病原菌的生長［27］。Gao等研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌菌株V4能夠產(chǎn)生伊枯草菌素、大環(huán)內(nèi)酰亞胺A和地非西丁等抗菌物質(zhì)，可以影響殺鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida）的細(xì)胞膜完整性，引起菌體死亡［28］。Thurlow等分析貝萊斯芽孢桿菌AP193菌株的拮抗機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其中關(guān)鍵的次級(jí)代謝產(chǎn)物是聚酮類化合物地非西丁，且缺失表達(dá)相關(guān)基因dfnD后失去對(duì)番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病的防控效果［29］。本研究中通過對(duì)RKZ-05的拮抗物質(zhì)合成相關(guān)基因進(jìn)行擴(kuò)增，初步預(yù)測其拮抗產(chǎn)物中可能包含桿菌霉素D、豐原素及芽孢桿菌溶素，但是具體物質(zhì)種類還需要通過后續(xù)試驗(yàn)來進(jìn)一步的分析和鑒定。

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收稿日期：2023-01-13

基金項(xiàng)目：西藏自治區(qū)重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃 （編號(hào)：XZ202001ZY0038N）；農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估項(xiàng)目（編號(hào)：GJFP20220102）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金［編號(hào)：CX（21）1005］。

作者簡介：周 萍（1999—），女，江蘇南通人，碩士研究生，主要從事生物防治相關(guān)工作。E-mail：1844547274@qq.com。

通信作者：高 弢，博士，副研究員，主要從事鐮刀菌毒素綠色防控相關(guān)工作，E-mail：gaotao8806@jaas.ac.cn；仇劍波，博士，副研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全方面的研究，E-mail：qiujianbo@jaas.ac.cn。