雛鴨腹瀉大腸埃希菌耐藥性和氨基糖苷類抗生素耐藥基因檢測與分析

方光遠　張萍　郭大偉　談福利　張智敏　陳俊紅　蔣加進

摘要：目的 研究雛鴨腹瀉大腸埃希菌的耐藥性和氨基糖苷類抗生素耐藥基因的存在情況。方法 采取山東濟寧某養鴨場腹瀉雛鴨糞便病料，通過實驗室分離培養，對雛鴨腹瀉大腸埃希菌進行藥敏試驗，比較雛鴨腹瀉大腸埃希菌分離株對抗菌藥物的敏感性，并采用PCR法對氨基糖苷類抗生素耐藥菌株進行氨基糖苷類抗生素耐藥基因aac（3）-Ⅰ、aac（3）-Ⅱ、aac（6）-Ⅰb、aac（6）-Ⅱ、ant（3”）-Ⅰ和aph（3）-Ⅱ的檢測。結果 在24種藥物敏感性試驗中，雛鴨腹瀉大腸埃希菌對頭孢他啶、頭孢哌酮、頭孢吡肟和阿米卡星4種藥物敏感，對氧氟沙星、頭孢曲松、頭孢噻肟和大觀霉素4種藥物中度敏感；對青霉素、鏈霉素、慶大霉素和四環素等16種藥物耐藥。在20株菌株中，檢測的氨基糖苷類抗生素耐藥基因中5株細菌檢測出aac（3）-Ⅰ，10株細菌檢測出aac（3）-Ⅱ，5株細菌檢測出aac（6）-Ⅰb，6株細菌檢測出aac（6）-Ⅱ，8株細菌檢測出ant（3”）-Ⅰ，17株細菌檢測出aph（3）-Ⅱ。結論 此次試驗分離培養出的雛鴨腹瀉大腸埃希菌呈現普遍耐藥性，普遍檢測出氨基糖苷類抗生素耐藥基因aac（3）-Ⅰ、aac（3）-Ⅱ、aac（6）-Ⅰb、aac（6）-Ⅱ、ant（3”）-Ⅰ和aph（3）-Ⅱ，其中aph（3）-Ⅱ檢出率高達85%。

關鍵詞：雛鴨腹瀉大腸埃希菌；耐藥性；耐藥基因；氨基糖苷類抗生素；藥敏試驗；檢測；分析

中圖分類號：R978.1? ? ? ? 文獻標志碼：A? ? ? ? ?文章編號：1001-8751（2023）03-0150-05

Detection and Analysis of Drug Resistance and Aminoglycoside Resistance Genes of Escherichia coli in Ducklings with Diarrhea

Fang Guang-yuan1， Zhang Ping1， Guo Da-wei2， Tan Fu-li1， Zhang Zhi-min1， Chen Jun-hong1， Jiang Jia-jin1

（1 College of Animal Science and Food Engineering of Jinling Institute of Technology， Nanjing? ?210038;?2 College of Veterinary Medicine， Nanjing? ?210095）

Abstract： Objective To study the drug resistance of Escherichia coli with ducklings diarrhea and the existence of aminoglycoside antibiotic resistance genes. Methods Take the feces of diarrhea ducklings from a duck farm in Jining City， Shandong Province， isolated and cultured in the laboratory， and the susceptibility of duck Escherichia coli with ducklings diarrhea was tested to compare the susceptibility of Escherichia coli with ducklings diarrhea isolates to antibiotics. Aminoglycoside antibiotic resistance genes aac（3）-Ⅰ， aac（3）-Ⅱ， aac（6）-Ⅰb， aac（6）-Ⅱ， ant（3”）-Ⅰ and aph（3）-Ⅱ were detection by PCR. Results Escherichia coli with duckling diarrhea was sensitive to 4 kinds of ceftazidime， cefoperazone， cefepime and amikacin in 24 drug susceptibility tests. Four kinds of drugs， including fluloxacin， ceftriaxone， cefotaxime， and spectinomycin， were moderately sensitive， and were resistant to 16 kinds of drugs， including penicillin， streptomycin， gentamicin， and tetracycline. Among the 20 strains， aac（3）-I was detected in 5 bacteria， aac（3）-II was detected in 10 bacteria， aac（6）-Ib was detected in 5 bacteria， aac（6）-II was detected in 6 bacteria， ant（3”）-I was detected in 8 strains， and aph（3）-II was detected in 17 strains. Conclusion The duckling diarrhea Escherichia coli isolated and cultured in this experiment has shown general resistance to most antibiotics， and aminoglycoside antibiotic resistance genes aac（3）-Ⅰ， aac（3）-Ⅱ， aac（6）-Ib， aac（6）-II， ant（3”）-I and aph（3）-II were generally detected. The detection rate of aps （3'）-Ⅱ is as high as 85%.

Key words： E.coli diarrhea in ducklings;? ?drug resistance;? ?drug resistance genes;? aminoglycoside antibiotics;? drug susceptibility testing;? ?detect;? ?analyse

由于我國養鴨業迅猛發展，雛鴨腹瀉大腸埃希菌病已成為危害雛鴨的一種主要傳染病[1]。雛鴨腹瀉大腸埃希菌主要感染20 d齡左右的雛鴨，通過從外界環境侵入鴨的腸道內造成感染。大腸埃希菌血清型眾多且分布廣泛，因此大腸埃希菌耐藥表現也不相同，存在時間性差異及地區性差異[2]。我國家禽養殖場常采用一些抗生素對大腸埃希菌感染進行預防和治療，但對抗生素使用量有時不加以控制，從而導致大腸埃希菌耐藥性持續擴大，出現一些大腸埃希菌菌株無藥可用的境地。因此，根據各地養殖場大腸埃希菌流行情況，規范、合理使用抗生素十分迫切。吳信明等[3]對38株鴨源大腸埃希菌的藥敏試驗結果顯示38株細菌對慶大霉素、卡那霉素和磷霉素具有耐藥性，且均表現出多重耐藥性。本試驗通過對雛鴨腹瀉大腸埃希菌進行分離培養、藥敏試驗和PCR檢測氨基糖苷類抗生素耐藥基因的存在情況，分析雛鴨腹瀉大腸埃希菌的耐藥機理，對臨床雛鴨腹瀉大腸埃希菌病的預防和治療具有一定的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細菌菌種

采取山東濟寧某養鴨場腹瀉雛鴨糞便病料20份，通過分區劃線接種SS瓊脂平板進行分離培養獲得紅色菌落，經革蘭染色鏡檢觀察、接種CYZ-15e腸桿菌科細菌生化編碼鑒定管和三糖鐵瓊脂斜面進行生化鑒定、16SrDNA基因片段PCR擴增基因測序試驗，結果表明從20份腹瀉雛鴨糞便病料中分離培養獲得的20株細菌均為大腸埃希菌，對獲得的20株雛鴨腹瀉大腸埃希菌，凍干保存備用。

1.1.2 培養基

普通營養瓊脂、SS瓊脂培養基和營養肉湯，自行配制。

1.1.3 試劑

所用主要實驗試劑有藥敏紙片（杭州濱河微生物試劑有限公司）；2×Taq PCR mix、DL 2000 DNA Marker、瓊脂糖（Agarose）、TBE緩沖液、黃金視圖核酸染料（Goldview）和ddH2O等試劑（南京擎科生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細菌復蘇純化培養

取出備用SS瓊脂平板，依次按照接種細菌的編號對其標記，寫明細菌種類和日期，用滅菌接種環挑取少量菌種凍干物，以分區劃線法接種SS瓊脂平板，放入培養箱37 ℃培養24 h后觀察結果。然后挑取SS瓊脂平板上單個典型菌落接種營養肉湯和普通營養瓊脂培養基平板，然后置于培養箱內37 ℃培養24 h備用。

1.2.2 細菌藥敏試驗

首先將制備的普通營養瓊脂平板標記好有關信息，每個平板對應一個不同的菌株。挑選普通營養瓊脂平板上分離培養好的20株雛鴨腹瀉大腸埃希菌菌落置于滅菌的0.9%氯化鈉溶液中，制成均勻懸液，使其濁度與0.5麥氏單位比濁管濁度一致。用滅菌棉簽蘸取制備好的菌液，均勻涂布整個平板表面。然后用滅菌鑷子夾取藥敏紙片一張，貼在平板表面，一塊平板上貼4種不同的藥敏紙片，各藥敏紙片間隔≥32 mm，且紙片距平板邊緣≥16 mm。操作完成的平板置于培養箱中，37 ℃培養24 h后取出，仔細觀察結果，用直尺測量出各藥敏紙片抑菌圈直徑（mm）并記錄。結果判定參考抗微生物藥物敏感試驗執行標準CLSI-M100-S20。

1.2.3 細菌耐藥基因檢測

（1）氨基糖苷類抗生素耐藥基因引物設計與合成，參照周家琦等[4]的文獻合成aac（3）-Ⅰ、aac（3）-Ⅱ、aac（6）-Ⅰb、aac（6）-Ⅱ、ant（3”）-Ⅰ和aph（3）-Ⅱ氨基糖苷類抗生素耐藥基因引物，引物序列及相關參數見表1。

（2）細菌DNA模板制備，各取1 mL 20種雛鴨腹瀉大腸埃希菌營養肉湯培養物，以10000 r/min放入離心機內離心3 min，然后移除上清液，加入1 mL的生理鹽水，置于旋渦器中充分混勻后再次離心，棄去上清液后，再加入1 mL生理鹽水混勻，放置待用。

（3）氨基糖苷類抗生素耐藥基因PCR擴增，PCR擴增試劑配制：包括250 μL 2×Taq PCR Mix、上下游引物各取20 μL、210 μL ddH2O。取25 μL上述混合液分別加入標記好的20個PCR管內，然后分別加入20個菌株DNA模板各1 μL，然后將各PCR管置于PCR基因擴增儀。PCR反應程序設置為：94 ℃預變性5 min→94 ℃變性45 s、56 ℃退火45 s、72 ℃延伸1 min共30個循環→72 ℃延伸 10 min→4 ℃維持。1.2%瓊脂糖電泳凝膠板配制：稱取0.6 g瓊脂糖加入到盛有50 mL 1倍TBE緩沖液的錐形瓶中，同時加入3 μL的Goldview，將錐形瓶放入微波爐加熱至完全溶解，倒入凝膠板中等待凝固后使用。反應結束后取各種耐藥基因PCR產物10 μL，分別加到凝膠板的加樣孔中進行電泳。電泳槽中加入1倍TBE緩沖液，電泳儀電泳參數設置為：電壓120 V，電流130 mA，電泳時間45 min。電泳結束后將凝膠塊取出放在紫外檢測儀上觀察結果。

2 結果

2.1 細菌復蘇純化培養結果

采用分區劃線方法將雛鴨腹瀉大腸埃希菌菌種凍干物接種到SS瓊脂平板上37 ℃培養24 h后可見紅色、圓形、表面光滑濕潤、邊緣整齊的直徑為2～3 mm菌落；普通瓊脂平板上可見表面光滑濕潤、圓形隆起、呈半透明狀的直徑為2～3 mm中等大小菌落；營養肉湯試管內均勻渾濁，底部有白色沉淀物，管壁內液面與試管壁交界處有菌環。

2.2 細菌藥敏試驗結果

觀察20株雛鴨腹瀉大腸埃希菌各菌株藥敏試驗結果，測量抑菌圈，根據抗微生物藥物敏感試驗執行標準CLSI-M100-S20進行分析。試驗結果見表2。

本試驗20株雛鴨腹瀉大腸埃希菌所檢測的24種抗菌藥物中，敏感率較高藥物有頭孢他啶（敏感率95%）、頭孢哌酮（敏感率50%）、頭孢吡肟（敏感率90%）、阿米卡星（敏感率45%）；中介率較高藥物有頭孢曲松（中介率55%）、頭孢噻肟（中介率50%）、大觀霉素（中介率35%）、氧氟沙星（中介率40%）；耐藥率較高的藥物有氨芐西林（耐藥率90%）、苯唑西林（耐藥率100%）、青霉素（耐藥率100%）、頭孢呋辛（耐藥率80%）、頭孢唑啉（耐藥率70%）、頭孢噻吩（耐藥率75%）、鏈霉素（耐藥率70%）、四環素（耐藥率95%）、氯霉素（耐藥率90%）等16種藥物。

2.3 氨基糖苷類抗生素耐藥基因檢測結果

2.3.1aac（3）-I 耐藥基因檢測結果

在20株菌株中，檢出5株細菌含有aac（3）-I耐藥基因，檢出率為25% （5/20）。檢測結果見圖1。

2.3.2aac（3）-Ⅱ耐藥基因檢測結果

在20株菌株中，檢出10株細菌含有aac（3）-II耐藥基因，檢出率為50% （10/20）。檢測結果見圖2。

2.3.3aac（6'）-Ib 耐藥基因檢測結果

在20株菌株中，檢出5株細菌含有aac（6）-Ib耐藥基因，檢出率為25% （5/20）。檢測結果見圖3。

2.3.4aac（6'）-Ⅱ耐藥基因檢測結果

在20株菌株中，檢出6株細菌含有aac（6）-II耐藥基因，檢出率為30% （6/20）。檢測結果見圖4。

2.3.5ant（3''）-I 耐藥基因檢測結果

在20株菌株中，檢出8株細菌含有ant（3''）-I耐藥基因，檢出率為40% （8/20）。檢測結果見圖5。

2.3.6aph（3'）-II 耐藥基因檢測結果

在20株菌株中，檢出17株細菌含有aph（3'）-II耐藥基因，檢出率為85% （17/20）。檢測結果見圖6。

3 討論

3.1 雛鴨腹瀉大腸埃希菌耐藥情況

大腸埃希菌是使雛鴨發生大腸埃希菌病的條件致病菌。由于大腸埃希菌十分容易產生耐藥性，因此，大腸埃希菌被認為是耐藥決定因子的“貯藏庫”[5]。大腸埃希菌的血清型很復雜，并且分布較為廣泛，目前已確認有170多種O抗原血清型[6]，所以預防和治療大腸埃希菌病存在很大的難度。大腸埃希菌耐藥菌株的大量產生加上其復雜的血清型，使養殖業的經濟損失嚴重[7]。在本次藥敏試驗中可見，20株雛鴨腹瀉大腸埃希菌對頭孢他啶、頭孢哌酮、頭孢吡肟和阿米卡星4種藥物表現較為敏感；對氨芐西林、苯唑西林、青霉素、頭孢呋辛、頭孢唑啉、頭孢噻吩、鏈霉素、四環素、氯霉素等16種藥物耐藥性表現較高，20株雛鴨腹瀉大腸埃希菌菌株多數表現為多重耐藥，有的甚至是泛耐藥。因此我們應該依據藥敏試驗結果及時挑選相應的敏感藥物，用以預防和治療雛鴨腹瀉大腸埃希菌病，并采取輪換用藥或交替用藥措施，減少耐藥性的產生[8]。

3.2 氨基糖苷類抗生素耐藥基因與耐藥性的關系

眾所周知，抗生素能夠預防和治療人類和動物細菌性疾病。但是，由于抗生素被廣泛使用甚至濫用，導致細菌對抗生素耐藥性相當嚴重[9-10]。氨基糖苷類藥物以前作為抗大腸埃希菌感染治療的首選藥之一，效果顯著，但隨著使用率逐漸頻繁，它和β-內酰胺類抗生素、氟喹諾酮類抗菌藥物對細菌的耐藥率每年都在上升[11]。人們常在預防和治療大腸埃希菌感染過程中使用氨基糖苷類抗生素，導致大腸埃希菌對氨基糖苷類抗生素耐藥性更加嚴重[12]。本試驗通過參照周家琦等[4]和Chen等[13]的試驗方法設計合成了氨基糖苷類抗生素耐藥基因6對引物，使用PCR檢測方法對20株雛鴨腹瀉大腸埃希菌的氨基糖苷類抗生素6種耐藥基因進行了檢測，檢測結果表明，20株雛鴨腹瀉大腸埃希菌氨基糖苷類抗生素耐藥基因aac（3）-Ⅰ、aac（3）-Ⅱ、aac（6'）-Ⅰb、aac（6'）-Ⅱ、ant（3''）-Ⅰ、aph（3'）-Ⅱ檢出率分別為25%、50%、25%、30%、40%和85%。其中aph（3'）-Ⅱ檢出率最高，達85%，在20株雛鴨腹瀉大腸埃希菌菌株中普遍存在。根據耐藥基因檢測結果與藥敏試驗結果相結合可見，同時具有多種耐藥基因的菌株是11號雛鴨腹瀉大腸埃希菌，共有4對耐藥基因；藥敏試驗結果表明，該11號菌株對24種抗菌藥物耐藥達22種，提示其耐藥基因與耐藥性呈正相關，此結果也表明大量使用各種抗生素包括氨基糖苷類抗生素，將可能導致雛鴨腹瀉大腸埃希菌對各種抗生素耐藥性不斷增強以及誘導氨基糖苷類抗生素耐藥基因的產生[14]。另外侯鳳香等[15]研究表明，雛鴨腹瀉大腸埃希菌病的發生與雛鴨的飼養環境和飼養方式緊密相關，通過環境的交叉感染更加難以防治。劉哲通[16]研究表明，加味三黃湯中草藥制劑能夠有效抑制鴨大腸埃希菌生長繁殖，副作用小，也很安全，用于治療鴨大腸埃希菌病具有顯著的療效。

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收稿日期：2022-10-13

基金項目：江蘇省大學生創新訓練計劃重點項目（202013573017Z）；動物藥品創新與制備“創客”虛擬班（2017008）；

江蘇省農業科技創新與推廣掛縣強農富民工程（SJKJ016）；國家重點研發計劃項目（2016YFD0501306）。

作者簡介：方光遠，副教授，主要從事獸醫微生物學和獸醫生物制品學教學及科研工作。

*通訊作者：張萍，副教授，主要從事獸醫藥理學和獸醫毒理學教學及科研工作。