伊馬替尼減輕大鼠蛛網膜下腔出血后早期腦損傷的作用研究

韓雨薇 王晨辰 梁國標 李曉明

【摘要】 目的 探討伊馬替尼對大鼠蛛網膜下腔出血（SAH）后早期腦損傷（EBI）的影響及其可能的作用機制。方法 采用頸內動脈穿刺法構建SAH模型，Sprague-Dawley雄性大鼠分為假手術組、模型組和伊馬替尼給藥組。SAH模型制作30 min后，腹腔注射一次給予伊馬替尼50 mg/kg。24 h后對出血情況，神經功能評分，平衡木評分，腦水腫和伊文思藍滲出進行考察；Western blot考察過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ），Toll樣受體4（TLR4），白細胞介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的表達量；TUNEL染色考察凋亡的情況。結果 實驗結果表明伊馬替尼能夠顯著減輕SAH后的神經損傷和腦損傷。在SAH大鼠模型中，伊馬替尼給藥顯著增加PPARγ表達，抑制TLR4及炎癥因子TNF-α，IL-1β的表達從而抑制細胞凋亡的發生。結論 伊馬替尼能夠激活PPARγ，從而抑制炎癥反應減輕SAH后的EBI。

【關鍵詞】 伊馬替尼；蛛網膜下腔出血；PPARγ；炎癥

【中圖分類號】 R965;R651 【文獻標志碼】 A 【文章編號】 1672-7770（2023）01-0057-05

Abstract： Objective To explore the effect of imatinib on early brain injury（EBI） after subarachnoid hemorrhage（SAH） in rats. Methods The SAH model was established by internal carotid artery puncture. Sprague-Dawley male rats were divided into sham operation group， model group and imatinib administration group. After the SAH model was made for 30 minutes 50 mg/kg of imatinib was given by intraperitoneal injection. After 24 hours， hemorrhage， neurological function score， balance beam score， cerebral edema and Evans blue exudation were investigated. Western blot examined the peroxisome proliferator activated receptors γ（PPARγ）， toll-like receptor 4（TLR4）， interleukin-1 beta（IL-1β） and tumor necrosis factor（TNF-α）. TUNEL staining was used to investigate apoptosis. Results The results showed that imatinib can significantly reduce nerve injury and brain injury after SAH. In the SAH rat model， imatinib administration significantly increased the expression of PPARγ and inhibited the expressions of TLR4 and inflammatory factors TNF-α and IL-1β， thereby inhibiting the occurrence of apoptosis. Conclusion Imatinib can activate PPARγ to inhibit inflammatory reaction and alleviate EBI after SAH.

Key words： imatinib; subarachnoid hemorrhage; PPARγ; inflammation

基金項目：國家自然科學基金面上項目（81971133）；沈陽市科技計劃項目（20-205-4-098）；中國博士后面上基金（2020M673679）

作者單位：110016 沈陽，北部戰區總醫院神經外科

通信作者：李曉明

蛛網膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是一種病死率高、致殘率高的危重疾病，并且SAH患者的預后很差［1-2］。早期腦損傷（early brain injury，EBI）被認為是SAH患者預后不良的主要原因之一。在EBI過程中，動脈瘤破裂可導致顱內壓升高、腦血流量減少和全腦缺血，這些生理變化導致血腦屏障破壞、神經炎癥、氧化反應和隨后的細胞死亡［3］。其中，炎癥和細胞凋亡被認為是SAH后EBI的主要原因［4］。

過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）屬于核激素受體超家族，在中樞神經系統發揮抗炎作用［5］。已有報道表明，PPARγ在調節炎癥和免疫反應以及保護細胞凋亡和氧化應激方面具有重要作用［5-7］。PPAR-γ激動劑在中風、阿爾茨海默病、感染、脊髓損傷和創傷性腦損傷等神經炎癥性疾病中的治療潛力受到特別關注［8-12］。 PPARγ激活劑伊馬替尼（imatinib），一種被批準用于治療慢性粒細胞白血病和其他惡性腫瘤的抗腫瘤藥物［13］。有報道稱，PPARγ激活劑伊馬替尼抑制Tenascin-C表達預防大鼠SAH后腦血管痙攣［14］，但伊馬替尼在SAH后EBI中仍未見報道。因此，本研究將討論PPARγ激動劑伊馬替尼是否對大鼠SAH后的EBI有保護作用。此外，本研究將討論伊馬替尼可能的保護機制。

1 材料與方法

1.1 材料 伊馬替尼（北京諾華公司），二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma公司），PPARγ，NF-κB，IL-β，TNF-α（美國Cell Signaling Technology公司），TLR4，β-actin（美國Santa Cruz Biotechnology公司），BCA蛋白定量試劑盒，蛋白酶磷酸酶抑制劑，RIPA裂解液，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒，ECL化學發光試劑盒，5×loading buffer（碧云天生物技術公司）。IL-β和TNF-α ELISA試劑盒（南京建成生物技術有限公司）。

1.2 實驗動物及分組給藥 實驗動物符合美國國立衛生研究院于1996年出版的《National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals》。Sprague Dawley雄性大鼠，8周，購自北部戰區總醫院實驗動物中心（中國沈陽），實驗動物合格證號0005095。恒溫，給予充足食物和水。大鼠隨機分為3組，每組30只：假手術組（Sham），模型組（SAH），模型+伊馬替尼（imatinib）。SAH模型制作30 min后，腹腔注射給予伊馬替尼50 mg/kg［14］。

1.3 模型制作 每只動物腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉。從頸外動脈殘端向左側頸內動脈插入一條銳化的4-0單絲尼龍線，穿透左側大腦前動脈和大腦中動脈的分叉處。假手術大鼠接受相同的手術，只是在沒有穿刺的情況下拔除縫線。

1.4 SAH嚴重程度評分 如前所述，將基底池分為6個節段，根據蛛網膜下腔出血量將每個節段劃分為0～3級。通過將分數相加，得到的總分從0～18不等［15］。

1.5 神經功能評分 采用兩種方法對神經功能缺損進行盲法評估。評估由六個測試組成，分數可以是0～3或1～3。這六項測試包括：自發活動，0分：不活動；1分：僅可移動；2分：能觸壁，不到3面；3分：自由運動，觸到籠子至少3面；四肢運動的對稱性，0分：肢體不能運動；1分：肢體極度無力，僅有輕微活動；2分：肢體無力，運動遲緩；3分：四肢對稱，與正常無差異；前爪伸展，0分：無動作；1分：僅有輕度伸展；2分：較正常差；3分：同SAH前；攀登，1分：不能攀爬，滾下；2分：攀爬困難；3分：爬行容易，抓籠有力；身體本體感覺，1分：無反應；2分：僅有輕微反應；3分：迅速轉頭，對側對稱；對胡須刺激的反應，1分：無反應；2分：輕微反應；3分：雙側對稱反應。最高分為18分，最低分為3分。分數越高，功能越強［15］。平衡木測試研究了動物在狹窄的木梁（2.25）上行走60秒的能力：四分，行走≥20 cm；三分，20 cm≥行走≥10 cm；兩分，行走≥10 cm但墜落；一分，行走10 cm；零分，行走10 cm以內墜落。計算5分鐘內連續三次試驗的最高得分［16］。分數越高，表明這兩種方法的功能都更強。

1.6 腦水含量 腦水含量通過濕重/干重方法進行評估［17］。迅速收集大腦并將其分為左右半球及小腦。所有樣品立即稱量以獲得濕重，并在105 ℃下脫水72 h后再次稱重以獲得干重。計算每個標本的腦含水量為（濕重-干重）/濕重×100%。

1.7 伊文思藍檢測 通過伊文思藍外滲試驗評估血腦屏障的血腦屏障滲透性［18］。在SAH后23 h，麻醉大鼠左側股靜脈注射伊文思藍染料（2%；5 mL/kg）。取腦左右半球及小腦。稱重后浸泡在甲酰胺中（10 mL/g），60 ℃孵育，用分光光度計測量滲出物在620 nm處的吸光度。

1.8 Western blot檢測 腦組織用RIPA裂解液裂解提取蛋白，并用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。等量的蛋白質（60 μg）在SDS-聚丙烯胺上電泳并轉移到PVDF膜上，5%BSA封閉，然后與一抗在4 ℃下孵育過夜PPARγ（1∶400），TLR4（1∶200），NF-κB（1∶400），β-actin（1∶200）。在室溫下與對應的二抗兔抗和鼠抗孵育1 h，用ECL化學發光試劑盒顯影，并用Image J定量分析。

1.9 TUNEL染色 在SAH后24 h將大鼠深度麻醉，并向心內灌注60 mL冰冷的PBS和60 mL 10％的多聚甲醛。收集全腦，然后在10％多聚甲醛中固定24 h，然后在30％蔗糖溶液中固定72 h。在-80 ℃下冷凍后，將大腦切成4 μm厚的冠狀切片。將腦切片PBS洗3次每次10 min，含0.3%TritonX-100的5%BSA封閉1 h。加入對應的TUNEL檢測液37 ℃避光孵育1 h。抗體熒光顯微鏡（尼康）拍照。

1.10 統計學分析 所有數據以Mean±S.E.M.表示，使用SPSS 19.0對數據進行統計分析。對所有數據進行單因素方差分析，然后進行Tukey檢驗進行多重比較。以P<0.05認為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 伊馬替尼對SAH評分和神經功能評分的影響SAH 24 h后，對SAH出血程度進行評分。評分結果顯示，模型組評分顯著增加出血嚴重，伊馬替尼給藥后能夠明顯減輕SAH的出血情況，降低SAH評分（圖1B）。與假手術組相比，SAH后神經功能評分和平衡木評分明顯受損，而伊馬替尼給藥可顯著改善SAH后神經學評分（圖1C-D）。

2.2 伊馬替尼對SAH后腦水腫和血腦屏障的影響與假手術組相比，SAH后腦含水量增加，伊馬替尼能夠降低腦含水量（圖2A）。為了評估血腦屏障的完整性，靜脈注射伊文思藍，并對滲出量進行檢測。結果表明伊馬替尼能夠降低SAH后伊文思藍的滲出量（圖2B），改善血腦屏障。

2.3 伊馬替尼對SAH后PPARγ和TLR4表達量的影響 Western blot結果顯示，與假手術組相比，SAH后PPARγ表達量無顯著變化，而伊馬替尼給藥能夠顯著增加PPARγ的表達（P<0.05）。SAH后TLR4表達顯著上調，而伊馬替尼給藥能夠降低TLR4的表達量。

2.4 伊馬替尼對SAH后炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達影響 本研究采用Western blot和ELISA方法檢測炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達情況，Western blot和ELISA均顯示SAH后，炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達量增加，而伊馬替尼給藥能夠抑制SAH誘導的TNF-α和IL-1β的表達（圖4）。

2.5 伊馬替尼對SAH后細胞凋亡的影響 本研究利用TUNEL染色考察了伊馬替尼對SAH后細胞凋亡的影響。SAH后TUNEL陽性細胞數目增加，伊 馬替尼給藥減少了TUNEL陽性細胞數目，抑制了細胞凋亡的發生（圖5）。

3 討 論

伊馬替尼是一種被批準用于治療慢性粒細胞白血病和其他惡性腫瘤的抗腫瘤藥物［13］。它抑制幾種酪氨酸激酶，包括PDGFR-α，并且已經被證明可以減輕缺血性中風和纖溶酶原激活劑治療后的腦水腫［19］。此外，伊馬替尼聯合抑制PDGFR-α在腦出血小鼠模型中改善了血腦屏障的完整性［20］。然而，伊馬替尼在SAH中的作用及作用機制尚未闡明。因此，本研究將討論伊馬替尼在SAH中的作用以及其可能的作用機制。

本研究中，為了檢測伊馬替尼對SAH后EBI的影響，對神經功能評分、腦水腫和伊文思藍滲出率進行考察。結果發現，伊馬替尼給藥能夠顯著改善腦含水量和血腦屏障功能，并且提高神經功能評分。說明伊馬替尼對SAH后EBI具有保護作用。另外，為了檢測伊馬替尼保護SAH后EBI的作用機制，本研究對PPARγ、TLR4、TNF-α和IL-1β的表達進行了考察。觀察到伊馬替尼給藥后PPARγ表達增加，TLR4表達減少，抑制炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達。此外，采用了ELISA方法檢測了TNF-α和IL-1β的表達量，伊馬替尼抑制炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達。為了進一步闡明伊馬替尼對SAH后細胞凋亡的影響，進行了TUNEL染色。染色結果說明，伊馬替尼能夠抑制SAH后的細胞凋亡。以上實驗結果表明，PPARγ激活對SAH后EBI具有保護作用，伊馬替尼可能通過上調PPARγ減少TLR4的表達從而抑制炎癥反應發揮抗凋亡作用。

目前的研究有幾個局限性。首先，沒有考察SAH后72 h的腦水腫和神經功能缺損情況，這個時間點的變化情況有待被研究。其次，SAH后的血腦屏障通透性和腦水腫程度可以用更具創新性的方法來評估，例如磁共振成像。

綜上所述，伊馬替尼通過激活PPARγ減少TLR4的表達抑制SAH后炎癥和凋亡的發生，維持血腦屏障的完整性。雖然伊馬替尼保護SAH后EBI的作用機制仍需進一步闡明，但本研究認為靶向PPARγ可能是改善SAH后EBI的關鍵策略。

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（收稿2021-07-15 修回2022-02-26）