一種小鼠背根神經節原代神經元細胞分離與培養的優化方法

張皞晟 王培民

【摘要】 目的 探索一種可以大量快速培養活力好且衛星膠質細胞污染少的原代神經元細胞的方法。方法 混合酶溶液消化體式顯微鏡下提取的背根神經節（DRG），隨后接種于纖維連接蛋白提前包被的培養皿中，8 h后更換含5-氟尿嘧啶的維持培養基，抑制非神經元細胞增殖。結果 分離培養的感覺神經元細胞在培養過程中可維持15 d左右，部分細胞可維持更長時間。原代細胞于第3天即可觀察到交錯的軸突網絡，接種細胞密度大，衛星膠質細胞污染情況少，細胞在7 d之內可投入使用，操作者經短時間訓練后即可快速掌握方法。結論 新方法在傳統方法的基礎上進行了改良，可獲取較多數量細胞活性好、純度高的原代神經元細胞，相較傳統方法具有可操作性高，重復率高的優勢。

【關鍵詞】 背根神經節；神經元細胞；細胞培養；TRPA1

【中圖分類號】 Q813.1+1；R651 【文獻標志碼】 A 【文章編號】 1672-7770（2023）02-0189-06

Abstract：Objective To explore a method that can rapidly cultivate a large number of primary neurons with good vitality and less pollution of satellite glial cells. Methods Dorsal root ganglion（DRG） extracted under microscope was digested with mixed enzyme solution， and then inoculated into fibronectin coated culture dish. After 8 hours， the maintenance medium containing 5-fluorouracil was changed to inhibit the proliferation of non-neuronal cells. Results The isolated and cultured sensory neuron cells could last for about 15 days， and some of them could last longer. On the third day， the primary cells could observe the crisscross axon network. The density of the inoculated cells was high， and the pollution of satellite glial cells was less. The cells could be put into use within 7 days. The operator could quickly master the method after a short period of training. Conclusions The new method is improved on the basis of the traditional method， which can obtain a large number of primary neurons with good cell activity and high purity. Compared with the traditional method， the new method has the advantages of high operability and high repetition rate.

Key words： dorsal root ganglion； neuron cell； cell culture； TRPA1

基金項目：國家自然科學基金資助項目（82074460）；江蘇省自然科學基金（BK20201501）

作者單位：210022 南京，南京大學現代生物研究院（張皞晟）；南京中醫藥大學附屬醫院骨傷科（王培民）

通信作者：王培民

原代背根神經節（dorsal root ganglion，DRG）感覺神經元被廣泛運用于瘙癢［1］、疼痛［2］、神經損傷［3］、神經再生、細胞間相互作用［4］以及軸突運輸等方面的研究中。因此原代DRG感覺神經元細胞的提取及培養，為識別新的藥物分子靶標、基因功能、代謝差異等提供了材料［5-6］，然而如何有效且快速地提取培養原代DRG神經元細胞仍是難題。小鼠DRG原代培養方法多種多樣，早期使用小鼠胚胎作為提取DRG感覺神經元的材料，操作難度大、耗時較長，長時間的手術操作增加了污染風險，體式顯微鏡下DRG提取難度極大，難以批量提取，所用試劑材料較多，耗費較大，耗時也較長［7］。近兩年的研究中提出，使用馬血清替代胎牛血清，從而抑制非神經元細胞增殖，但神經元的功能與神經元軸突分叉與再生長關聯較小，無血清也可滿足神經細胞再生需求［8］；但成纖維細胞與衛星膠質細胞的存在對神經元生長影響較大。因此，在不影響神經元活性，盡可能減少衛星膠質細胞或成纖維細胞污染［9］的前提下，快速、大量地提取原代DRG感覺神經元細胞，減少實驗所需的花銷，保證足夠密度和數量的神經元細胞，是后續實驗成功的前提。在過去的基礎上，本研究比較并改良了原代DRG神經元的提取方法，依據此方法，在多脊柱水平培養了DRG內的感覺神經元細胞，并降低了實驗的操作難度及時間。培養的原代神經元細胞，可以作為功能和遺傳學研究的工具來驗證在動物模型中的分子靶點。通過膜片鉗記錄、鈣離子成像、免疫組化、基因敲除和病毒基因轉染等實驗方法，可以更準確地描述感覺神經元的基本生理特性［10］。這些方法可以幫助研究新的靶受體或通道、細胞內信號轉導、細胞間信號傳遞等［11］。通過微陣列測序、RNA和全基因組測序等先進方法，利用全神經節或原代神經元幫助識別小鼠慢性疼痛和瘙癢的生物標志物已獲得一定的成效［12］。此外，原代培養的DRG神經元細胞具有新的治療干預包括基因治療和細胞活動的光遺傳學和化學遺傳學操作的潛力，可應用于疼痛性疾病［13］、神經退行性疾病［14］的病理生理及治療研究，為特異性藥物的研究及運用提供研究目標。

1 資料與方法

1.1 材料 12只C57BL/6小鼠，雌雄不限，8周左右，體質量約20～30 g，由南京中醫藥大學實驗動物中心提供。使用隨機數字表法進行動物分組，分為舊方法組與新方法組。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑藥品 MEM-ALPHA培養基（BI，01-042-1ACS）；青霉素-鏈霉素溶液（HyCLone，SV30031）；35 mm細胞培養皿（Nest，706001）；Collagenase Type I powder（Thermo，17100-017）；人血漿纖維連蛋白（fibronectin human plasma，Sigma，F0895-1MG）；脫氧尿嘧啶核苷（5-Fluoro-2′-deoxyuridine，Sigma， F0503-100MG）；分散酶（源葉生物，S25046-1g）；胎牛血清（FBS）（Gibco）；βⅢ-tubulin抗體（Sigma）；GFAP抗體（Sigma）；熒光二抗（anti-rabbit）；熒光二抗（anti-mouse）；曲拉通X-100（Triton X-100）；DAPI；多聚甲醛；PBS；ddH2O；QuickBlock免疫染色一抗稀釋液；QuickBlock免疫染色封閉液；免疫熒光染色二抗稀釋液；抗熒光淬滅封片液；TRPA1抗體（Affinity Biosciences）；TRPV4抗體（Affinity Biosciences）；TRPM8抗體（Affinity Biosciences）；tau抗體（Affinity Biosciences），synapsin抗體（Affinity Biosciences）。

1.2.2 實驗所用主要儀器 CO2恒溫細胞培養箱；體視顯微鏡；200目細胞篩；倒置式顯微鏡；熒光顯微鏡；眼科顯微鑷子（尖端有齒）；普通不銹鋼剪刀；顯微角膜剪直剪或彎剪（11.5 cm）；普通剪刀；鑷子；培養皿；流式細胞儀；HCA（Operetta， Perkinelmer，PE）。

1.2.3 用于提取與培養的試劑配置 （1）提取培養基：MEM-ALPHA培養基+2%血清，分裝為1 mL溶液并儲存在2 mL離心管中，全程置于冰上；（2）混合消化酶：I型膠原酶+分散酶（消化酶與分散酶各取100 mg溶于1 mL PBS或培養基內制成母液，母液濃度為100 mg/mL，使用時稀釋成工作液，濃度為5 mg/mL），1 mL工作液裝在2 mL離心管置于冰上，分裝工作液在-20 ℃保存時間不多于3個月；（3）完全培養基：MEM-ALPHA培養基+10%FBS+1%雙抗；（4）Fibronectin：母液濃度為1 mg/mL，工作液：取20 uL溶于1 mL ddH2O；（5）5-Fluoro 1.5 mg/mL，取1 mL溶于100 mL ddH2O；（6）換液培養基：MEM-ALPHA培養基+5%FBS+1%雙抗+1% 5-Fluoro。

1.3 方法 小鼠DRG原代神經元的提取與培養，擬使用兩種方法提取原代DRG神經元細胞。方法一參考任旺等的研究［7］，改良方法如下。

1.3.1 實驗前準備 在培養皿中滴加1 mL Fibronectin溶液提前包被培養皿，于37 ℃恒溫培養箱中浸泡1 h，浸泡開始20 min后可以進行DRG原代提取實驗。浸泡開始后即刻準備75%乙醇溶液用于小鼠消毒，提取培養基以臨時儲存DRG，混合消化酶溶液用于后續操作，準備妥當后可進行下一步實驗。

1.3.2 小鼠DRG的分離 小鼠備皮，脫頸處死，待完全死亡后置入提前預冷的75%乙醇溶液浸泡消毒3～5 min，待消毒完畢，沿背部正中線剪開小鼠皮膚，向兩側鈍性分離小鼠背部筋膜，此時可見小鼠背部白色韌帶組織，手術刀片沿韌帶棘突交界處迅速離斷韌帶，隨后使用刀柄向兩側鈍性分離小鼠背部肌肉群，露出肌肉下附著于橫突的韌帶，刀片分離后，迅速清理周圍肌肉組織，刀片離斷脊柱，取出脊柱后，含雙抗PBS沖洗，清除多余血液及影響視野的肌肉。

以下操作均在體視顯微鏡下操作，清洗脊柱后沿正中線自椎間孔處剪開錐體，分為左右兩半；必要時剪去棘突以方便分離錐體，清理椎間孔內的脊髓組織與神經纖維，注意動作輕柔緩慢，以防誤將DRG連同脊髓組織與神經纖維一同清理；使用吸入PBS注射器沖洗椎間孔，清理多余血液，即可見側隱窩；DRG處于側隱窩內，為淡黃色結節狀組織，兩端均有神經纖維組織，使用帶齒眼科顯微鑷攝取DRG組織，輕輕提起后使用顯微角膜剪（直剪或彎剪）剪斷兩端神經纖維；修理多余神經纖維后，將DRG置于提取培養基內；以相同方法攝取剩余DRG組織，提取過程中提取培養基全程置于冰上。見圖1。每只小鼠至少提取20個的DRG。

提取后，緩慢吸棄1.5 mL離心管中的提取培養基，加入混合消化酶工作液1 mL，水浴消化60～70 min，每10 min顛倒搖勻一次，注意動作輕柔。消化完成后，吸棄混合消化酶，加入完全培養基1 mL，槍頭吹打18下，此時經消化的DRG組織分散，試管內組織肉眼難見，含DRG細胞溶液過200目細胞篩清除雜質，隨后使用1 mL完全培養基沖洗篩子一次， 1 000 rpm離心8.5 min。離心過程中取出事先準備好的Fibronectin溶液包被的培養皿，吸取Fibronectin溶液（可重復使用2～3次），2 mL ddH2O清洗培養皿3次，最后一次清洗后ddH2O留在培養皿內，防止培養皿過于干燥，待種板時吸棄。離心結束后，1 mL槍頭吸棄離心管液體，注意不要吸入底部沉淀，加入1 mL完全培養基重懸溶液，洗棄培養皿內ddH2O，計數后種入35 mm培養皿內；隨后另補1 mL完全培養基，37 ℃ 5%CO2恒溫培養箱培養8～12 h。8～12 h后，使用“換液培養基”維持細胞生長，換液培養基內含有5-氟尿嘧啶用于抑制衛星膠質細胞增殖，同時對非增殖性細胞（神經元細胞）影響較小，隨后2～3 d更換培養基的1/2，最多取用存活15 d的DRG神經元，培養時宜用35 mm培養皿以保持神經元細胞的密度，維持神經元細胞之間的突觸的高效連接。部分培養至第6天的DRG原代神經元細胞使用LPS（5 μg/mL）干預8 h，用于后續高內涵細胞成像拍攝免疫熒光圖片。

1.3.3 免疫熒光染色 按上述方法提取培養DRG原代神經元細胞，分別在種板后的第3天、第5天及第7天進行神經元特異性的免疫熒光染色。一抗選取βⅢ-tubulin抗體與GFAP抗體。完全吸棄培養基，取1 mL的PBS溶液清洗培養皿（3次），Triton X-100孵育細胞，取1 mL的PBS溶液清洗培養皿（3次），2 mL 4%多聚甲醛固定細胞，取1 mL的PBS溶液清洗培養皿（3次）。配置βⅢ-tubulin與GFAP一抗（QuickBlock免疫染色一抗稀釋液配置），4 ℃冷庫孵育過夜，次日取1 mL的PBS溶液清洗培養皿（3次），取適量QuickBlock免疫染色封閉液，37 ℃封閉1 h，取1 mL的PBS溶液清洗培養皿（3次），37 ℃熒光二抗孵育1 h（免疫熒光染色二抗稀釋液配置），取1 mL的PBS溶液清洗培養皿（3次），自此時起，后續操作全程避光。DAPI染液孵育染色，孵育僅需1 min，取1 mL的PBS溶液清洗培養皿（3次），滴加適量抗熒光淬滅封片液。將培養皿置于免疫熒光顯微鏡下觀察、拍照。每次添加試劑時均需PBS清洗3次。這些圖像由HCA（Operetta、Perkinelmer、PE）拍攝。圖像分析由Columbus和Image J完成。

1.3.4 流式細胞術 含EDTA胰蛋白酶于37 ℃消化神經元細胞3 min，顯微鏡下可見神經元細胞之間的突觸連接，輕吹至分散；200目篩網過濾，收集細胞懸液，1 000 rpm/min離心5 min；加入2 mL 0.25%triton-X重懸細胞，室溫孵育10 min；離心后PBS洗滌兩次；加入βⅢ-tubulin（1∶200）500 μL，4 ℃孵育過夜；第2天4 ℃離心洗滌兩次，每管加入500 μL二抗室溫避光孵育1 h；4 ℃離心洗滌2次，1 mL PBS重懸細胞，準備上機；陰性對照一抗二抗均用PBS代替，其余步驟同實驗組。

1.3.5 圖像和統計學分析 使用Image J進行圖像處理，包括免疫熒光圖像merge及比例尺添加。所有計量數據資料統計使用GraphPad Prism（version 8.0.1），采用均數±標準差（x-±s） ，兩組之間比較采用t檢驗（Student's t-test），以P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 感覺神經元形態學觀察 培養時間為3 d時的神經元細胞（圖2A），部分神經元細胞被衛星膠質細胞所覆蓋（圖2B右側箭頭），但仍可見未被完全覆蓋的神經元細胞膜，未較多被衛星膠質細胞包裹的神經元細胞；隨著培養時間的增加，附著在神經元細胞表面的衛星膠質細胞會脫離神經元（圖2C ?右側箭頭），轉移并黏附在培養皿表面（左側箭頭示完全裸露的神經元細胞）；第5～6 d時，神經元細胞的胞質大量暴露，此時可見神經元細胞全部的胞體及周圍的突觸，衛星膠質細胞幾乎全部脫離神經元細胞，此時的神經元細胞可用于膜片鉗實驗或鈣成像實驗。

2.2 免疫熒光染色鑒定 免疫熒光顯微鏡按標準步驟，拍攝了培養天數為6 d時的神經元細胞（圖3）。

2.3 細胞純度測定 比較種板前細胞技術的結果顯示，改良法相較原方法能夠得到更多的細胞，細胞純度的鑒定方法參照前文提及文獻［5］中的方法，細胞純度可達90%。流式細胞術所示細胞純度結果見圖4。

2.4 炎癥相關神經元TRPA1免疫熒光染色 為了進一步明確所提取DRG原代神經元細胞是否可用于炎癥相關研究，實驗使用高內涵細胞成像技術攝取的LPS干預后的神經元細胞免疫熒光染色圖像，圖5為相鄰四個孔內攝取的細胞圖像，圖5（a）為原代DRG神經元TRPA1蛋白免疫熒光，圖（b）為DRG神經元特異性標志物βⅢ-tubulin蛋白免疫熒光；圖（c）為DRG神經元細胞核Dapi免疫熒光染色；（d）Image J軟件合并TRPA1、βⅢ-tubulin、Dapi免疫熒光染色圖像。結果表明，神經元胞體及突觸均有大量TRPA1表達。

3 討 論

本研究運用原代細胞培養，免疫熒光，流式細胞術等方法，比較了傳統的小鼠DRG提取培養方法和優化后的提取培養方法。研究結果顯示，通過βⅢ-tubulin、GFAP免疫熒光染色，流式細胞術等方法證明了改良后的提取培養方法具有一定的優點，如細胞純度較高，提取培養步驟簡便，可重復性高等；TRPA1、Tau、Synapsin等蛋白的表達，提示這些原代神經元細胞可以被用作研究疼痛、神經損傷等方面的研究。

鑒于小鼠動物品系穩定、易于繁殖且子代數量較多等優點，小鼠神經元常被選用于原代培養，這些神經元被廣泛應用于瘙癢、疼痛、神經損傷與再生和軸突運輸等臨床前研究［7］。近期研究中神經元細胞的提取培養方法描述并不詳細，參照文中方法提取的原代神經元細胞較少且存活率不高，步驟及所需試劑較多［7］。故在此基礎上提出一個用于提取培養小鼠脊髓背角DRG原代神經元細胞的詳細方法。經過大量嘗試，改良后的方法可以保證原代神經元細胞的數量與存活率，原代的神經元細胞在第8～12 h時即可貼壁。此時換液可以棄去未貼壁細胞及脫落的衛星膠質細胞，在換液后的12～24 h后即可觀察到細胞呈現梭形，大部分細胞可觀察到神經元標志性的突起，神經元的軸突數目逐步增加、延伸范圍逐漸擴大；在3～4 d后即可觀察到清晰的神經纖維網絡，神經元周圍光暈明顯，貼壁緊密；在5～7 d時可見神經元之間的軸突呈大量增加，神經元之間形成了仍在逐步擴大的軸突網絡，這些神經元均可以投入后續實驗使用，同時這些細胞的最佳試用期在6～15 d內。本研究參考并試驗了國內外文獻中提供的實驗方法，具有以下的特點及優勢：（1）選擇小鼠為實驗對象，其基因組與人類相似度較大鼠更高；（2）避免使用胎鼠，既往研究大量使用胎鼠作為研究對象，胎鼠胎齡掌握困難，剖腹取出的胎鼠易死亡，耗時極長、耗費較大，此外胎鼠體積較小，操作難度高，組織極易損傷，影響術野，耗時長的前提下，分離出的細胞較少，細胞活性較差問題難以解決；（3）既往研究中大量使用DMEM/F12或Neurobasal培養基，價格高昂，用途局限，本研究使用MEM-ALPHA培養基，價格較低，且培養效果較好；（4）分離后的背根神經節組織使用Ⅰ型膠原酶及分散酶混合消化，較單純使用胰蛋白酶消化可幫助衛星膠質細胞從神經元細胞上脫落，也可幫助神經元細胞分離，獲得更多的細胞，神經元細胞存活率高；（5）提取培養基與換液培養基的成分不同，在神經元細胞貼壁后，選用含1%的5-氟尿嘧啶的換液培養基，既往研究多使用阿糖胞苷抑制非神經元細胞增殖，使用條件較為苛刻，同時抑制了神經元的細胞活性，針對神經元細胞無法增殖的特點，添加含1%的5-氟尿嘧啶和5%濃度FBS的換液培養基繼續培養，可以有效抑制非神經元細胞，如小膠質細胞的增殖，同時可以促進神經元細胞生長，對神經元細胞損傷較小；（6）選取免疫熒光鑒定神經元細胞，優先使用βⅢ-tubulin作為神經元標志蛋白，GFAP作為衛星膠質細胞標志蛋白，分別選取不同種屬、不同顏色的熒光二抗以方便同時染色，βⅢ-tubulin作為神經元細胞骨架，參與神經發生和軸突的引導和維持［15］，表達量較高，方便染色，因此在染色時可幫助觀察到整個神經元細胞。GFAP作為衛星膠質細胞的特異性標志物，衛星膠質細胞最初包裹著分離出的DRG神經元少數神經干細胞表達GFAP，因此GFAP可用作區分衛星膠質細胞和神經元細胞；（7）本研究培養皿包被時首選纖維連接蛋白，相較使用多聚賴氨酸，神經元細胞貼壁所需時間大大減少，8～12 h即可使用換液培養基換液，提前抑制非神經元細胞的增殖，所得細胞活性更好、純度更佳；（8）在提取神經元細胞時需要操作者大量的操作練習，熟悉流程，同時在練習的幫助下加強實驗的穩定性，盡可能縮短提取DRG所花費的時間，以使神經元原代細胞活性保持在最佳狀態。因流式細胞術所用非流式專用抗體，使用的為βⅢ-tubulin一抗間接標記了神經元細胞；此外，胰蛋白酶消化及離心操作均會導致細胞損傷，甚至破碎、丟失，故神經元細胞所占比例較低；使用傳統計數方法第6天時鏡下觀察計數，原代神經元細胞純度可達90%，與傳統方法一致。此外為了驗證此方法培養的原代神經元細胞是否可用于疼痛、神經損傷與再生等實驗的研究，本研究使用熒光標記了TRPA1、Tau、Synapsin等蛋白，發現這些蛋白均有表達，可用于后續實驗。

綜上所述，這些神經元細胞常用于瘙癢、疼痛、神經損傷與再生等的研究。改良后的方法具有操作簡便、提取培養的細胞純度高、用途廣泛，同時價格便宜等優點，為研究者提供了一種新的用于小鼠DRG神經元細胞原代培養的方法。

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（收稿2022-03-07 修回2022-05-03）