水產品中孔雀石綠、結晶紫藥物殘留檢測方法的優化

田雪蓮，楊堃，蘭承興，李樹林，李雪林

（福泉市農業農村局，貴州 福泉 550500）

孔雀石綠（malachite green, MG）為綠色有金屬光澤的晶體，易溶于水以及乙醇、甲醇和戊醇，水溶液呈藍綠色，是有毒的三苯甲烷類化學物，既是染料，也是殺菌和殺寄生蟲的化學制劑[1]。結晶紫（crystal violet, CV）是一種帶有金屬光澤的深綠色結晶性粉末，易溶于水，具有較好的殺菌作用，其結構、性質與孔雀石綠相似[2]。由于二者抗菌效果好，價格便宜，曾被廣泛使用于水產養殖。它們在魚體內可分別代謝為隱色孔雀石綠和隱色結晶紫，且殘留時間長，具有潛在的致癌、致畸、致突變等副作用，已被列為水產養殖的禁用藥物[3]。因此，準確快速測定水產品中孔雀石綠、結晶紫，具有重要意義。

目前，水產品中孔雀石綠、結晶紫的常用測定方法，主要有液相色譜熒光法、液相色譜串聯質譜法和膠體金免疫層析法等[4]。《水產品中孔雀石綠和結晶紫殘留量的測定 高效液相色譜熒光檢測法》（GB/T 20361—2006）[5]由于前處理時間長，需多次萃取，多次離心，操作方法煩瑣，有機溶劑用量大。現從提取、濃縮等方面，對該國標中水產品殘留檢測的前處理過程進行了優化，以此提升水產品中孔雀石綠、結晶紫的回收率與檢測靈敏度。

1 材料與方法

1.1 材料

供試魚購自農貿市場，經檢測，不含孔雀石綠、結晶紫類藥物。

1.2 試劑與儀器

孔雀石綠、結晶紫標準溶液由農業農村部環境保護科研監測所提供，質量濃度為100 mg/L；酸性氧化鋁固相萃取柱（500 mg, 3 mL），PRS 固相萃取柱（500 mg, 3 mL）；乙腈為色譜純，二氯甲烷、酸性氧化鋁、二甘醇、無水乙酸銨、冰乙酸、氨水、對-甲苯磺酸、乙酸胺、硼氫化鉀、鹽酸羥胺均為分析純；試驗用水為去離子水。分別配制0.05 mol/L對-甲苯磺酸溶液（稱取0.95 g 對-甲苯磺酸，用水稀釋至100 mL）、0.1 mol/L 乙酸胺緩沖溶液（稱取1.71 g 無水乙酸胺，溶解于1 000 mL 水中，氨水調pH 值至10）、0.125 mol/L 乙酸胺緩沖溶液（稱取9.64 g 無水乙酸胺，溶解于1 000 mL 水中，冰乙酸調pH 值至4.5）。

Agilent 1220 液相色譜儀（配熒光檢測器，美國安捷倫公司）；Scout SE 電子天平（奧豪斯儀器有限公司）；XW-80A 渦旋震蕩混合器（上海精科實業有限公司）；旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；TGL 16 M 離心機（長沙邁佳森儀器設備有限公司）；0.45 μm 濾膜。

1.3 色譜條件

C18（250 mm×4.6 mm）色譜柱；流動相：乙腈+乙酸胺緩沖溶液（0.125 mol/L，pH 值4.5）=80+20（V∶V）；流量：1.3 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量20 μL；熒光檢測器激發波長265 nm，發射波長360 nm。

1.4 提取、凈化與濃縮

按照文獻[5]中前處理過程操作。

1.5 水產品中孔雀石綠、結晶紫藥物殘留的檢測

取魚肉樣品5.00 g，按照60 μg/kg 的添加量，添加2 種標準品，按照添加不同體積硼氫化鉀溶液、二氯甲烷溶液濃縮至1~2 mL，測定回收率與精密度試驗，每個樣品平行測定3 次，計算樣品的加標回收率。

2 結果與討論

2.1 不同體積硼氫化鉀對回收率的影響

硼氫化鉀作為強還原劑，能夠把樣品中殘留的孔雀石綠或結晶紫，還原為其相應的代謝產物隱色孔雀石綠或結晶紫。以硼氫化鉀3，4 和5 mL進行平行試驗，結果見表1。按照文獻[5]，在加標質量比為60 μg/kg 條件下，孔雀石綠、結晶紫回收率分別為83.67%和71.33%；當硼氫化鉀體積為4 mL 時，孔雀石綠、結晶紫回收率分別為91.33%和76.50%；當硼氫化鉀體積為5 mL 時，孔雀石綠、結晶紫回收率分別為90.83%和76.00%。表明硼氫化鉀體積為4 mL，回收效果最佳，孔雀石綠、結晶紫回收率分別提升7.66%和5.17%。

表1 不同體積硼氫化鉀對孔雀石綠、結晶紫回收率的影響

2.2 不同體積二氯甲烷體積對回收率的影響

不同體積二氯甲烷對孔雀石綠、結晶紫回收率的影響見表2。采用25 和30 mL 二氯甲烷能提高孔雀石綠、結晶紫的回收率，當二氯甲烷體積為25 mL時，孔雀石綠、結晶紫回收率分別為93.00%和73.17%，且二氯甲烷不會發生倒向。因此，二氯甲烷體積為25 mL，回收效果最佳。

表2 不同體積二氯甲烷對孔雀石綠、結晶紫回收率的影響

2.3 不同旋轉蒸發最終體積對回收率的影響

不同旋轉蒸發最終體積對回收率的影響見表3。由表3 可見，旋轉蒸發最終體積約為1 mL時，回收率最低，孔雀石綠、結晶紫分別為70.83%和64.33%；而濃縮至近干，以瓶底濕潤為準，孔雀石綠、結晶紫回收率最高，分別為91.00%和76.17%。因此在試驗中，旋轉蒸發最終體積濃縮應該近干，以此提升孔雀石綠、結晶紫回收率。

表3 旋轉蒸發最終體積對回收率的影響

3 結論

以文獻[5]為藍本，對魚肉中的孔雀石綠、結晶紫藥物殘留檢測方法進行優化及確認，發現強還原劑硼氫化鉀的體積為4 mL、萃取劑二氯甲烷為25 mL、樣品濃縮至近干時孔雀石綠、結晶紫回收率均較高。優化后的方法具有結果準確性高、穩定性好等優點，適用于水產品中孔雀石綠和結晶紫殘留的檢測。