基于巨噬細胞極化的腫瘤治療

顧佳丹,戴蓓英

(中國藥科大學新藥安全評價與研究中心,江蘇 南京 211198)

巨噬細胞從骨髓中的祖細胞而來,隨后進入外周血在內環境穩態、炎癥反應及腫瘤免疫中發揮作用[1]。巨噬細胞具有高度可塑性,能夠依據不同微環境的刺激在不同表型之間轉換,這種轉換被稱為“極化”[2]。腫瘤微環境中的巨噬細胞又稱為腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages,TAMs),與腫瘤的發生發展有著密切的關系,能夠影響腫瘤的進展及治療的耐藥,因此有望成為抗癌藥物的新靶點[3]。目前基于TAMs的各類亞型和功能出現了四類TAMs相關的免疫療法,包括直接清除TAMs,限制TAMs的募集與腫瘤定位,對TAMs進行再極化或重編程以及利用巨噬細胞靶向腫瘤給藥[4]。本文主要聚焦于通過對TAMs進行重編程以使其重新獲得抗腫瘤能力的免疫療法。

1 巨噬細胞的極化

目前巨噬細胞被主要分為兩種具有不同功能的亞型,包括經典激活的M1型(classically activated macrophage,CAMs),又稱炎癥型,以及替代性激活的M2型(alternatively activated macrophage,AAMs),又稱抗炎型[5]。人外周血單核細胞用粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage-colony stimulating factor,GM-CSF)刺激時會向M1型極化,而與巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)則會向M2型極化[6]。

M1型巨噬細胞是正常免疫反應的主要表型,通常由γ干擾素(interferon-γ,IFN-γ)或脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)激活[7],參與針對不同病原體的I型輔助性T細胞(T helper type 1 cells,Th1)的免疫反應,并產生能夠殺傷癌細胞和微生物的促炎細胞因子[6,8],如TNF-α(tumor necrosis factor-α)、IL-1β(interleukin-1β)及低水平的IL-10[5,9]。而M1型巨噬細胞產生的活性氧成分(reactive oxygen species,ROS)雖然能夠參與病原體的清除[5],但也會導致DNA損傷[10]。

由于促炎反應會損傷DNA,因此M2型巨噬細胞介導的抗炎反應就十分重要。M2型巨噬細胞通常由IL-4、IL-13、IL-10激活,能夠誘導免疫抑制、腫瘤形成,并參與寄生蟲的清除及傷口修復[11]。M2型巨噬細胞根據功能可分為3個亞型:①有助于組織修復及傷口愈合的M2a和M2c型;②有助于抗炎和免疫調節的M2b型;③有助于血管生成和腫瘤進展的M2d型[12-13]。M2a型主要由肥大細胞分泌的IL-4、IL-13以及Th2細胞和嗜堿性粒細胞誘導[12],M2c型由TGF-β(transforming growth factor-β)、IL-10和糖皮質激素誘導[14],M2b型由LPS或IL-1R配體與免疫復合物的相互左右誘導[15],M2d型則由腫瘤相關因子誘導產生,同時也是腫瘤微環境(tumor microenvironment,TME)中TAMs的主要組成部分[16]。

機制上來說,STAT1和STAT3/STAT6激活通路間的平衡決定了巨噬細胞的極化和功能[17]。NF-κB和STAT1的表達增加促進了巨噬細胞向M1型極化,STAT3和STAT6介導了巨噬細胞向M2型極化[18],此外,過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors,PPAR)如PPARγ和PPARδ同樣參與了M2型巨噬細胞的激活與氧化代謝[12]。轉錄因子KLF4協同STAT6,通過阻斷NF-κB共激活因子促進M2型相關基因如ARG-1、MRC1、FIZZ1、PPARγ的表達,抑制M1型相關基因如TNFα、COX-2、CCL5、iNOS的表達。與KLF4同家族的KLF2則通過抑制NF-κB/HIF-1α的激活調控巨噬細胞活化[19]。IL-4一方面通過誘導c-Myc激活M2型巨噬細胞[18],另一方面通過誘導M2型極化的Jmjd3-IRF4軸抑制IRF5介導的M1型極化。此外,IL-10能通過誘導c-Maf、STAT3和p50 NF-κB同源二聚體活性促進M2型極化[17]。

2 腫瘤相關巨噬細胞與腫瘤微環境

TME由免疫細胞、基質細胞及非細胞成分構成,免疫細胞包括T細胞、B細胞、TAMs等,基質細胞包括腫瘤干細胞、腫瘤相關成纖維細胞及腫瘤相關脂肪細胞等[20],非細胞成分包括細胞外基質(extracellular matrix,ECM)蛋白、生長因子、細胞因子及代謝物[21]。TME的穩態和演變離不開所有細胞密切的細胞間串擾[3],其構成成分也會隨著癌癥種類的不同而變化[22]。

TAMs構成了TME中一群具有可塑性和異質性的細胞,在某些實體瘤中占比可達50%[3],并且在抑制免疫反應、促進組織重塑、癌癥轉移和耐藥方面發揮著重要作用[23]。最新研究表明,TAMs與正常巨噬細胞類似,具有中間激活態,能夠適應復雜的TME[24],并且在TME中表型和功能各不相同的TAMs亞型都表達M1和M2的標記物[25]。然而只有在腫瘤發生非常早期的階段會產生促炎因子,促進M1型TAMs的募集和極化,M1型TAMs則通過產生細胞毒性因子、吞噬并摧毀腫瘤細胞以及釋放促炎因子發揮抗癌效果[26]。隨著M1型TAMs長期存在導致的慢性炎癥,癌細胞會將TAMs重編程為M2型[27],M2型TAMs通過分泌生長因子、促血管生成因子、免疫抑制因子以及重塑蛋白水解酶發揮促腫瘤作用[28]。因此基于TAMs的各類亞型和功能出現了4類TAMs相關的免疫療法,包括直接清除TAMs,限制TAMs的募集與腫瘤定位,對TAMs進行再極化或重編程以及利用巨噬細胞靶向腫瘤給藥[4]。

3 重編程TAMs治療癌癥的研究進展

有研究證明巨噬細胞是化療和免疫治療所必需的[29],并且考慮到TAMs的可塑性及不同亞型的功能,利用環境刺激促癌的M2型TAMs重編程為抗癌的M1型TAMs是一種可能的腫瘤治療策略[4]。目前重編程TAMs的方法多種多樣,包括抑制TAMs極化相關基因調控極化,利用化合物等直接誘導TAMs再極化,通過納米顆粒遞送系統誘導極化以及利用機械高強度聚焦超聲等技術誘導TAMs極化。

3.1 直接抑制TAMs極化相關基因調控極化通過基因調控TAMs主要分為兩條途徑,一是重新激活STAT1通路,使TAMs向M1型極化,二是抑制STAT3/STAT6信號通路,抑制TAMs向M2型極化。目前兩條通路相關的基因均有文獻報道。

RIP1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,在部分癌癥中能夠促進癌細胞死亡[30],但巨噬細胞中的RIP1信號會導致胰腺導管癌抵抗免疫治療。抑制巨噬細胞的RIP1能夠激活STAT1信號通路,使TAMs重編程為MHCIIhiTNFα+IFNγ+的腫瘤殺傷型,從而導致細胞毒性T細胞激活和輔助性T細胞向混合Th1/Th17表型分化。因此,巨噬細胞RIP1可能作為控制腫瘤免疫的檢查點激酶發揮作用[31]。

ATP作為在實體瘤中高表達的物質可能與腫瘤增殖和免疫細胞通訊有關[32],細胞外ATP的功能主要由P2X7介導,該受體廣泛表達于大多數腫瘤細胞和免疫細胞如TAMs上[33]。TAMs上的P2X7能通過激活STAT6/IRF4軸促進肺腫瘤細胞增殖、血管生成和T細胞免疫抑制,從而促進TAMS的M2極化。抑制或敲除P2X7可抑制TAMs向M2型極化,并顯著抑制體內肺癌的進展。此外抑制P2X7克服了肺癌對免疫治療和化療的耐藥性,是一種潛在的治療復發及難治性肺癌的手段[34]。

TGR5(又稱GPBAR1)是細胞膜G蛋白偶聯的膽汁酸受體,表達與單核細胞和巨噬細胞上,在調節炎癥反應中發揮重要作用[35]。TGR5通過激活cAMP-STAT3/STAT6信號,是TAMs向M2型極化所必需的。TGR5缺失能夠恢復TAMs導致的CD8+T細胞的抑制,從而恢復非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的抗腫瘤免疫反應。TGR5是NSCLC針對TAMs的抗腫瘤免疫治療的一個有潛力的藥物靶點,可能使免疫檢查點阻斷療法無效的患者受益[36]。

ERK5是絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPKs)家族的一員,能夠將胞外信號轉化為各種細胞反應[37]。STAT3磷酸化依賴于ERK5,ERK5缺失導致骨髓來源巨噬細胞(bone marrow-derived macrophage,BMDMs) 表達低水平的M2型相關基因,并減少TGF-β及IL-10的產生,從而阻止免疫抑制微環境的形成。因此,通過阻斷ERK5重編程TAMs將成為一種潛在的治療手段[38]。

此外,也有文獻報道部分臨床用藥如卡巴他賽、卡非佐米等能夠重編程TAMs,這就意味著這些藥物具有與免疫療法聯用從而發揮更好的抗腫瘤效果的潛力。卡巴他賽是治療前列腺癌的二線用藥,通過穩定微管中的微管蛋白以抑制細胞分裂來發揮細胞毒性[39]。但在三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)中,卡巴他賽并非直接發揮細胞毒性作用,而是誘導巨噬細胞向M1型極化,從而通過TLR/NF-κB通路的激活和促炎細胞因子的表達從而發揮抗腫瘤作用[40]。此外,紫杉醇已被證明是一種TLR4配體,它直接與髓樣分化蛋白2 (myeloid differentiation protein-2,MD-2)結合,并激活下游信號傳導[41]。因此除了卡巴他賽外其他的紫杉醇衍生物也可能具有重編程TAMs的能力?？ǚ亲裘鬃鳛椴豢赡娴牡鞍酌阁w抑制劑,能夠破壞細胞蛋白質的穩定[42],常用于復發/難治性多發性骨髓瘤的治療。高通量篩選發現卡非佐米還能在M2型巨噬細胞中誘導未折疊蛋白反應(unfolded protein response,UPR),激活IRE1a來募集TRAF2,并激活NF-κB轉錄M1型巨噬細胞相關基因,從而誘導M2型巨噬細胞表達M1型巨噬細胞因子,發揮吞噬腫瘤細胞以及將抗原遞呈給T細胞的功能。此外,卡菲佐米與PD-1抗體有協同作用,可能成為PD-1抑制劑聯合治療的優秀藥物[43]。

3.2 利用納米材料重編程TAMs相較于傳統藥物遞送系統,納米遞送技術利用細胞特異性靶向定位、分子轉運到特定細胞器等手段克服了諸多局限,包括生物體分布和細胞內運輸等[44],納米粒子還能夠提高封裝內容物的溶解度和穩定性,促進跨膜運輸并延長循環時間以提高安全性和有效性[45]。隨著技術進步,納米粒子的受控合成利用復雜架構的合并、生物響應部分以及靶向劑提高遞送能力[46]。目前納米粒子根據材料主要分為3類,包括脂質體納米粒子、聚合物納米粒子及無機材料納米粒子[44],利用這3類材料對TAMs重編程均有文獻報道。

脂質納米粒子(lipid- based NPs,LNPs)通常由4個部分組成,與帶負電的遺傳物質結合并有助于核內逃逸的陽離子或可電離脂質,形成粒子結構的磷脂,有助于穩定和膜融合的膽固醇以及改善穩定性和循環的聚乙二醇化的脂質。DLin-MC3-DMA (MC3 LNPs)是一種高效的siRNA運輸載體,將能夠同時編碼CCL2和CCL5的雙特異性單結構域抗體BisCCL2/5i的mRNA包裹其中,可以形成一種肝歸巢生物材料,誘導TAMs向M1型極化,并減少腫瘤微環境中的免疫抑制。此外,該脂質納米粒子與PD-L1聯合使用,能夠延長原發性肝癌及結直腸癌和胰腺癌肝轉移模型的小鼠生存期[47]。甘露糖磺酸酯脂質體(Man-PEG-Lipo)也被開發運用到了TAMs的靶向遞送中,在其中包裹綠原酸(chlorogenic acid,CHA)的脂質體具有較好的粒徑和穩定性,并能有效改善CHA在體內快速清除和腫瘤蓄積較少的情況。甘露糖受體介導的TAMs靶向作用能夠使該脂質體優先蓄積在腫瘤中,釋放出的CHA能夠使M2型TAMs重編程為M1型,從而抑制膠質瘤的生長[48]。此外,LNPs還能夠包裹C6-神經酰胺(LipC6),注射LipC6一方面能夠抑制腫瘤細胞的增殖和AKT的磷酸化,增加腫瘤細胞的凋亡,另一方面能夠誘導TAMs極化為M1型,減少免疫抑制,增加CD8+T細胞的活性,從而減緩肝癌生長[49]。盡管LNPs能夠靶向遞送并提高了內容物的穩定性,但其也存在載藥量低、肝臟和脾臟高攝取等不足[50]。

相較于LNPs,聚合物納米粒子具有更多變的結構與特性,也就產生了可變的藥物遞送能力,治療藥物可以封裝在納米粒子核心內、包埋在聚合物基質中、化學結合到聚合物上或結合到 納米粒子表面,因此聚合物納米粒子能夠承載多種類型的藥物,是理想的遞送載體[51]。PLGA(Lactic-co-glycolic acid)是常用的一種聚合物納米粒子載體。可以在其中包裹Toll樣受體 7/8 (toll-like receptor 7/8,TLR7/8) 激動劑瑞喹莫德(R848),再將PLGA-R848通過靜電吸附到大腸桿菌MG1655上,可以實現腫瘤靶向,并將TAMs重編程為M1型[52]。PLGA還能包裹小分子黃芩苷和蛋白黑色素瘤抗原Hgp肽片段,PLGA表面還可以綴合M2pep和α-pep,使其對M2型巨噬細胞有更高的親和力,PLGA納米粒子外部還能夠再包裹一層聚多巴胺(polydopamine,pD),使單鏈DNA片段CpG-ODN能夠吸附在pD上。M2型TAMs能有效地攝取納米復合體,酸性溶酶體環境導致pD從納米粒子表面解體,釋放CpG將TAMs重編程為M1型,納米粒子內部的黃芩苷則具有免疫調節和選擇性細胞毒性的雙重功能。該納米復合體實現了高親和力靶向遞送系統以及較好的免疫調節、腫瘤殺傷功能,再次證明了聚合物納米粒子有較好的應用前景[53]。除了PLGA,功能化兩親性多肽(functionalized amphiphilic peptide,PCP)也能夠聚合形成納米粒子,與PD1、PD-L1組成納米粒子骨架,并在其中包裹阿霉素(doxorubicin,DOX)和R848,就可形成多藥前藥。PCP中包含成纖維細胞激活蛋白-α(fibroblast activation protein-α,FAP-α)反應底物片段,在到達腫瘤部位時骨架結構能夠解離釋放出內容物,使DOX和R848觸發免疫原性細胞死亡(immunogenic cell death,ICD),并對TAMs進行重新編程,從而實現抗腫瘤免疫[54]。聚合物納米粒子的骨架可修飾性及內容物的多樣性使其在癌癥醫學、基因治療和診斷中發揮重要作用,但也存在粒子聚集和毒性的風險[55]。

無機物納米粒子在TAMs重編程方面也有所應用。層狀雙氫氧化物作為常用的納米材料本身具有上調促炎細胞因子和共刺激分子的能力[56],在攜帶了miR155后表現出TAMs特異性遞送能力,并能降低腫瘤組織中TAMs和髓系來源的抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)的比例,提高CD4+和CD8+T細胞的浸潤率和活性[57]。無機物納米粒子還能夠與聚合物納米粒子結合使用。PLGA納米粒子作為骨架包裹Fe3O4納米粒子和TLR7激動劑咪喹莫特(R837),隨后表面涂覆經LPS處理的巨噬細胞膜來靶向TAMs,Fe3O4納米粒子通過鐵離子激活IRF5信號通路,R837通過活性氧誘導的NF-κB信號通路協同極化TAMs為M1型,以增強免疫治療[58]。

3.3 其他手段重編程TAMs目前大多數方法都是從極化信號通路的角度重編程TAMs,但也能從巨噬細胞能量代謝的角度入手。M1型巨噬細胞利用糖酵解滿足快速的能量代謝需求,M2型巨噬細胞則更傾向于利用脂肪酸氧化,而TME中恰好富含脂肪酸[59]。研究表明,富含不飽和脂肪酸的環境會影響骨髓細胞的成熟,不論是阻斷脂滴的合成還是降解脂滴都能夠抑制髓系細胞的成熟、線粒體呼吸及免疫抑制功能[60]。

除了化學方法,機械手段也可能影響巨噬細胞的極化。高強度聚焦超聲(high intensity focused ultrasound,HIFU)消融療法通過HIFU將焦點組織溫度提高到60 ℃以上從而使組織消融,一方面由高溫引起的組織壞死造成,另一方面由水和超聲波相互作用導致內部空化引起[61]。但傳統HIFU(T-HIFU)不適用于較大的腫瘤,由此出現了利用高壓爆破產生聲空化的新型治療手段——機械性高強度聚焦超聲(mechanical high- intensity focused ultrasound,M-HIFU)。M-HIFU治療后增加了TME中樹突狀細胞的積累,T細胞的浸潤,還能將TAMs重編程為M1型,并增加了PD-L1的表達。研究表明與單一治療手段相比,M-HIFU與抗PD-L1單抗聯用能夠增強全身抗腫瘤療效,并有助于減少晚期復發和轉移[62]。

4 總結

TAMs是TME的重要組成部分,在腫瘤發生發展中起重要作用,TAMs能夠通過多種途徑創造免疫抑制微環境,包括觸發T細胞免疫檢查點的阻斷,因此靶向TAMs不失為一種改善抗腫瘤免疫治療的新方法[28]。目前針對TAMs及其功能介質為直接靶點已經開發出多種治療策略,包括耗竭TAMs,阻斷單核細胞/巨噬細胞的募集,對TAMs重編程以及利用TAMs靶向腫瘤遞送藥物。盡管大多數治療策略都處于臨床前研究階段,但也有部分耗竭TAMs的拮抗劑已進入實體瘤的臨床測試,而與免疫檢查點阻斷聯合治療用有望改進現有的免疫療法。

然而TAMs的靶向治療仍有許多問題需要解決,例如靶向TAMs針對的信號通路在體內是否存在機制上的重疊或協同,將巨噬細胞復極化為促炎狀態有怎樣的長期后果,哪些巨噬細胞轉錄因子對促進腫瘤免疫抑制和免疫激活至關重要以及靶向靶向TAMs可能會在TME中引發怎樣的連鎖反應等等。

但不可否認,靶向TAMs不僅可以抑制腫瘤發生發展的“種子”,還可以改造腫瘤生長的“土壤”,構建抑癌微環境,從而將促進腫瘤進展的敵人變成抑制腫瘤發展的朋友。TAMs靶向策略本身以及其與其他療法協同使用都有益于癌癥的治療[4]。