量子點標記免疫層析試紙條檢測谷物中T-2毒素

張 瀅，彭 濤，苗 茜，劉笑笑，丁 輝

（蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院，甘肅蘭州 730050）

單端孢霉烯族毒素是一大類化學結構相關的真菌毒素，根據其特征官能團的不同可分為A、B、C、D 4種類型。T-2是A類型中毒性最強的，廣泛分布在谷物及動物飼料中，性質穩定，不易滅活。T-2會引起急性和慢性毒性，對人和動物的多種組織和器官產生毒害作用，能夠引起的毒性效應包括消化系統和肝臟毒性、骨系統損傷、基因與細胞毒性、血液系統毒性、免疫系統毒性、神經毒性和生殖發育毒性等[1]。

隨著檢測技術的快速發展，目前國內外對T-2的測定方法主要有液相色譜（Liquid Chromatography，LC）、 液 質 聯 用（Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，LCMS）、氣相色譜（Gas Chromatography，GC）、氣質聯 用（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GCMS）及免疫法[2]。其中LC-MS不需要在檢測過程中對T-2進行復雜的衍生，故成為T-2最常用的分析檢測方法，但其費時費力，成本高。最便捷、靈敏度高的檢測方法是酶聯免疫吸附測定（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）法，可用于廣泛的糧食樣品T-2的篩查。基于ELISA衍生出的免疫層析法，成本低且適用于大量樣品的現場快速分析[3]，對減少T-2的污染和降低暴露風險有積極作用。

QDs是一種新型納米材料，制備簡單，發光效率高，化學穩定性好。QDs憑借其諸多優點及獨特的熒光效應，在食品中有毒有害小分子物質的快速檢測領域得到廣泛應用[4-5]。本研究以量子點和T-2抗體為基礎，制備QDs-Ab熒光探針，建立一種T-2-QDICA新方法，以期能夠縮短谷物中T-2的檢測時間，降低檢測成本。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品墊、結合墊、吸水紙墊、PVC板、Milipore HF 140s硝酸纖維素膜，上海金標公司；羧基化水溶性量子點，武漢珈源公司；T-2單克隆抗體（T-2-Ab）、T-2包被原（T-2-BSA）、T-2 ELISA試劑盒，山東綠都生物科技有限公司；T-2毒素（T-2）、黃曲霉毒素B1（AFB1）、黃曲霉毒素M1（AFM1）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、伏馬毒素B1（FB1）、嘔吐毒素（DON）、赭曲霉毒素A（OTA），德國Dr.Ehrenstorfer公司；羊抗鼠二抗（IgG）、乙基碳二亞胺（EDC），美國Sigma公司；玉米，當地超市。

1.2 設備與儀器

HM3035噴金儀、ZQ2000自動斬切機，上海金標生物有限公司；ZF1-Ⅱ紫外分析儀，上海嘉鵬科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 QDs-Ab復合物的制備

取25 μL QD（s8 μmol·L-1）于2.0 mL離心管中，加入 93 μg EDC，再分別加入 12 μg、24 μg、30 μg T-2-Ab，混合均勻，210 r·min-1室溫下避光充分反應4 h。然后將溶液在4 ℃條件下12 000 r·min-1離心3 min除團聚。然后用規格為100 kDa的超濾離心管將離心后的上清液濃縮，使用尺寸排阻柱對濃縮液純化，最終得到QDs-Ab復合物。

1.3.2 QDICA的組裝

將140s硝酸纖維素膜、吸水紙墊、結合墊和樣品墊依次粘貼在PVC板上，將羊抗鼠IgG、T-2-BSA分別包被在NC膜上，作為QDICA的質控線（C線）、檢測線（T線），于37 ℃烘箱中放置4～6 h，用自動斬切機斬斷成寬為3.7 mm的試紙條，儲存在常溫、干燥、避光的條件下。

1.3.3 QDICA實驗條件優化

樣品的上樣緩沖液、QDs-Ab復合物的添加量、工作液的加入量、二抗和T-2-BSA的稀釋倍數等都直接影響試紙條的準確性以及靈敏度。分別選擇QDs-Ab 的添加量為 0.1 μL、0.3 μL、0.5 μL，工作液添加量為 3 μL、5 μL、8 μL、10 μL 以及 4 種不同的上樣緩沖液進行試紙條檢測，當試紙條C、T線熒光強度一致且適中、熒光條帶清晰以及背景干擾程度小時，確定為QDICA最佳工作條件。

1.3.4 QDICA方法檢測限確定

將 T-2 用上樣稀釋液依次稀釋為 0 μg·L-1、1.0 μg·L-1、2.5 μg·L-1、5.0 μg·L-1、8.0 μg·L-1、10.0 μg·L-1、25.0 μg·L-1，分別和一定量的 QDs-Ab復合物、工作液在試紙條最優工作條件下上樣，10 min后通過紫外分析儀觀察檢測結果。T線熒光條帶恰好完全消失時所對應的T-2最小濃度確定為T-2-QDICA的可視化檢測限。

1.3.5 QDICA方法特異性評價

在試紙條最佳工作條件下，分別檢測T-2、AFB1、FB1、ZEN、OTA、DON和AFM1，通過觀察C、T線顯色情況，進行方法特異性評價。

1.3.6 QDICA實際樣品的檢測及有效性驗證

選擇陰性谷物樣品作為實際樣品進行測定。準確稱取5 g粉碎均勻的谷物樣品，精密加入5 mL 75%的甲醇溶液作為樣品提取液充分提取，渦旋20 min后，離心機3 900 r·min-1下離心10 min，留下上清液待用。將陰性樣品上清液用上樣緩沖液稀釋4倍來消除基質影響，最后進行試紙條上樣檢測。

本實驗利用商品化ELISA試劑盒驗證QDICA方法的有效性。

2 結果與分析

2.1 制備QDs-Ab時QDs和T-2-Ab添加比例的優化

QDs和T-2-Ab的添加比例會影響QDs-Ab復合物的偶聯效率，最終影響QDICA方法的靈敏度。本研究選擇摩爾比為1∶4、1∶8、1∶10的QDs和 T-2-Ab制 備 QDs-Ab。 由 圖 1可 知，QDs和T-2-Ab摩爾比為1∶8時，熒光強度最強，所以選擇QDs和T-2-Ab摩爾添加比例為1∶8。

圖1 QDs和T-2-Ab的添加比例的優化圖

2.2 上樣緩沖液的優化

試紙條的上樣緩沖液會影響免疫反應活性，緩沖液的pH值、溶液中不同離子的濃度均會影響C、T線的熒光強度。本研究選擇pH值為5.7和7.4的PB、pH值為7.4的PBS、pH值為8.3的BBS作為上樣緩沖液進行試紙條檢測。結果發現，緩沖液為pH=5.7的PB時，C、T線處熒光亮度差；緩沖液為pH=7.4的PB時，C、T線處熒光條帶均勻清晰，QDICA靈敏度較好；緩沖液為pH=7.4的PBS時，QDICA靈敏度稍差；緩沖液為pH=8.3的BBS時，C線處熒光條帶亮度稍弱，可能引起實驗結果無效的誤判。綜上，最終選擇pH=7.4的PB作為試紙條上樣緩沖液和樣品稀釋液。

2.3 QDs-Ab復合物和工作液添加量的確定

QDs-Ab復合物的加入量決定著QDICA C、T線處熒光強度，直接影響QDICA方法的靈敏度。工作液的加入主要影響樣品溶液在QDICA上的層析速度，進而影響QDs-Ab與T-2-BSA結合效率，間接影響了實驗結果的準確性。本文研究QDs-Ab的添加量為 0.1 μL、0.3 μL、0.5 μL，工作液添加量為3 μL、5 μL、8 μL、10 μL 時，QDICA C、T 線處的熒光強度。結果發現，當加入QDs-Ab復合物量較少（0.1 μL）時，C、T線熒光強度較弱，說明沒有足夠的QDs-Ab復合物與C、T線上二抗和T-2-BSA結合；當加入QDs-Ab復合物量太多（0.5 μL）時，導致C、T線熒光亮度太強而靈敏度降低。隨著工作液添加量的增加，變化梯度由一般到明顯再到一般。因此，本文最終確定QDs-Ab和工作液的加入量分別為 0.3 μL 和 8.0 μL。

2.4 QDICA檢測限的確定

將配制成不同濃度的T-2混合樣品溶液滴加在樣品墊上，10 min后通過紫外分析儀觀察檢測結果。

如圖2所示，當樣品中不含T-2時，C、T線上熒光條帶清晰，亮度均勻一致。隨著T-2濃度逐漸升高，C線不變，T線的熒光強度逐漸變弱直至消失不見。T-2濃度為5 μg·L-1時，T線上熒光條帶恰好完全消失。經過幾次重復實驗，確定T-2-QDICA方法的可視化檢測限為 5 μg·L-1。

圖2 T-2-QDICA可視化檢測限的確定圖

2.5 T-2-QDICA特異性的評價

如圖 3所示，5 μg·L-1的 T-2就能夠使 QDICA T線處的熒光條帶消失，而其余6種高濃度真菌毒素標準品溶液（濃度均為1 mg·L-1）都不能與T線處包被物結合，從而使T線熒光條帶消失。說明QDs-Ab復合物只能和其對應的T-2抗原結合，與其他6種常見的真菌毒素均無交叉，特異性好。

圖3 T-2-QDICA交叉反應圖

2.6 T-2-QDICA有效性的驗證

經過驗證發現，實驗中QDICA方法與ELISA試劑盒的檢測結果一致，證明QDICA方法高效、有效，可簡單、快速實現T-2在谷物中的半定量檢測。

3 結論

本研究利用QDs作為熒光標記物，基于免疫特異性識別，建立了一種靈敏、快速的熒光免疫層析方法用于檢測谷物中T-2的殘留量。本方法相較于大型儀器檢驗方法，檢測時間短，操作簡單，實際樣品中測定結果與ELISA試劑盒測定結果一致，證明本方法有效且具有一定實用性。