煙草秸稈綠原酸提取工藝優化及其抑菌效果研究

張豫丹 王衛民 倪博 馬曉寒 李俊領 許自成 賈瑋 史久長

摘要：為擴展煙草秸稈的利用途徑，探究煙草秸稈綠原酸對煙草疫霉的抑菌效果，采用單因素試驗和響應面分析法優化煙草秸稈綠原酸微波輔助提取工藝，并通過離體培養探討煙草秸稈綠原酸對煙草疫霉菌的抑制作用。單因素及響應面結果表明，煙草秸稈綠原酸最佳提取工藝為料液比1∶15（g·mL-1），提取溫度50.03 ℃，乙醇體積分數50%，此時粗提物中綠原酸含量為3.48 mg·g-1；離體條件下，煙草秸稈綠原酸的添加均抑制了疫霉菌的生長，其中175 mg·L-1煙草秸稈綠原酸對菌落直徑的抑制效果最為顯著，抑菌率高達32%。此外，碘化丙啶（PI）染色結果表明，175 mg·L-1的煙草秸稈綠原酸可通過破壞煙草疫霉菌細胞膜的完整性抑制菌絲生長。研究結果為煙草秸稈有效利用和新型天然植物源殺菌劑開發奠定了基礎。

關鍵詞：煙草秸稈；綠原酸；響應面優化；抑菌效果doi：10.13304/j.nykjdb.2021.0888

中圖分類號：S38 文獻標志碼：A 文章編號：10080864（2023）01011909

煙草，茄科（Solanaceae）煙草屬（Nicotiana）植物[1]，是一種重要的葉用經濟作物[23]。我國是世界上最大的煙草生產國，每年煙草生產量占世界總量的40%[4]。煙草秸稈（以下簡稱煙稈）是煙草生產中占比最高的農業廢棄物，我國年產煙稈高達270萬t[5]。由于煙稈成分復雜，所含木質纖維素和尼古丁不易被微生物分解，還田處理困難，煙稈焚燒不僅造成大量生物資源浪費，還造成嚴重的環境污染[67]。因此，亟需尋找新的利用方式。

綠原酸（chlorogenic acid， CGA）是植物經莽草酸途徑產生的一種次生代謝物質[8]，素有“植物黃金”的美稱[9]，具有抑菌、抗氧化等多種生物活性[1011]。研究表明，綠原酸可誘導活性氧的積累，導致藤倉鐮孢菌（Fusarium fujikuroi）死亡，進而降低圣女果采后腐爛病的發生[12]。此外，綠原酸通過破壞真菌細胞膜的通透性對核盤菌（Sclerotiniasclerotiorum）、番茄鐮刀菌（Fusarium solanieumartii）、黃萎病菌（Verticillium dahliae）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）等病原真菌產生抑制作用[13]。

綠原酸是煙草中含量較高的多酚類化合物，占煙草總多酚含量的75%～95%[14]，目前有關煙草綠原酸的研究大多集中在煙葉上，而煙稈的綠原酸鮮有報道。本研究以煙草秸稈為原料，采用微波輔助提取工藝，結合響應面法進行優化，并以煙草疫霉菌（Phytophthora nicotianae）為對象檢測煙稈綠原酸的抑菌效果，以期實現資源的良性循環利用。此外，研究結果也有助于煙草的多用途利用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑

煙草品種為‘秦煙96，秸稈取自洛陽植煙區；綠原酸標準品購自北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇等試劑為國產分析純。受試菌株為本實驗室保存的煙草疫霉菌。

1.2 方法

1.2.1 煙草秸稈樣品的預處理 將煙草秸稈在105 ℃殺青15 min，80 ℃烘干至恒重后冷卻，用粉碎干燥機將秸稈粉碎后過60目篩，裝入自封袋保存備用。

1.2.2 綠原酸標準曲線的繪制 準確稱取綠原酸標準品10 mg，用純水完全溶解后定容至100 mL容量瓶中，分別吸取綠原酸標準品5.00、7.50、10.00、12.50、15.00、17.50、20.00 mL 置于7 個100 mL容量瓶中，用純水定容后搖勻，以純水為對照，在最大吸收波長327 nm處測其吸光度。以吸光光度值為Y 軸；綠原酸質量濃度為X 軸，繪制標準曲線。

1.2.3 煙草秸稈中綠原酸提取單因素試驗 將乙醇體積分數、料液比、提取溫度和提取時間作為考察因素，固定提取溫度50 ℃、提取時間30 min、乙醇體積分數50%、料液比1∶10 （g·mL-1）、微波時間180 s，設計乙醇體積分數為30%、40%、50%、60%；料液比（g·mL-1）為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25；提取溫度為40、50、60、70 ℃；提取時間為60、80、100、120 min。依據單因素試驗結果，選取料液比（A）、乙醇體積分數（B）、提取溫度（C）為自變量，利用Design Expert 8.0.6軟件進行3因素3水平的Box-Behnken中心組合試驗設計，對煙草秸稈中綠原酸提取條件進行優化。因素水平見表1。

綠原酸含量=（C × V/W）×10-3 （1）

式中，C 為根據回歸方程計算得出的綠原酸質量濃度，mg·L-1；V 為提取液體積，mL；W 為煙草秸稈干質量，g。

1.2.4 優化煙草秸稈中綠原酸提取工藝 使用Design Expert 8.0.6軟件對響應面試驗數據進行分析，最終獲得煙稈中綠原酸的最佳提取條件。

1.2.5 OA培養基制備 對照組：將30 g燕麥加水煮爛（25 min 左右，燕麥膨脹微微裂開即可），用4層紗布過濾于燒杯中，加水補足至1 000 mL，加入15 g瓊脂，充分攪拌均勻后，分裝于三角瓶中，121 ℃、0.1 MPa條件下滅菌25 min。

試驗組：將最佳條件下提取的綠原酸溶液（得率約為3.5 mg·g-1）旋轉蒸發至恒重后，用純水完全溶解，定容至10 mL（溶液A：綠原酸質量濃度為0.003 5 mg·L-1）。將15 g燕麥加水煮爛，用4層紗布過濾于燒杯中補水至475 mL，加入稱量準確的7.5 g瓊脂，充分攪拌均勻后，分裝于三角瓶中（溶液B），121 ℃、0.1 MPa 條件下滅菌25 min。分別取1.0、2.5、5.0 mL A液與B液混勻至100 mL，制成帶藥平板，此時換算得到培養基中綠原酸質量濃度分別為35.0、87.5和175.0 mg·L-1。

1.2.6 綠原酸對煙草疫霉菌絲生長的影響 試驗前，超凈工作臺進行紫外燈殺菌消毒，同時將工作服以及雙手用75% 酒精消毒；試驗中所用器具滅菌后置于超凈工作臺，整個試驗過程在酒精火焰旁進行[15]。用打孔器在培養5～7 d 的等直徑疫霉菌落邊緣（生長狀況基本一致）打取直徑為5 mm 的圓形菌餅，再用接菌針挑至平板中間，用封口膜封好后將培養基倒置于26 ℃培養箱中恒溫培養。待對照組長滿后觀察試驗組菌絲的生長情況，采用十字交叉法測量菌落直徑，計算抑菌率，每個處理重復3次。

抑菌率=對照菌絲直徑- 試驗菌絲直徑／對照菌絲直徑（2）

1.2.7 菌絲染色 用無菌刮刀分別刮取1.2.5中對照組和試驗組適量菌絲，在10%福爾馬林溶液中浸泡固定1 h，用PBS緩沖液反復沖洗數次，滴加20 mg·L-1 的碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液200 mL，置于暗處30 min，將帶有菌落的液滴放在熒光顯微鏡下觀察。

2 結果與分析

2.1 綠原酸標準曲線

根據綠原酸標準曲線（圖1），用最小二乘法擬合，得到回歸方程：y=0.048 1x-0.002 2，R2=0.999 9。

2.2 各因素對煙草秸稈粗提物中綠原酸含量的影響

2.2.1 料液比對綠原酸含量的影響 由圖2可知，隨著料液比的增加，煙草秸稈粗提物中的綠原酸含量呈逐漸上升的趨勢，在料液比為1∶25時綠原酸含量高達2.5 mg·g-1，相較于1∶10的提高了1倍多。這說明酚類物質的提取與料液比有關，料液比越大，溶劑對酚類的浸提越充分。但是增加料液比的同時也會導致生產成本增加，因此需選取最適宜的料液比。

2.2.2 提取溫度對綠原酸含量的影響 由圖3可知，煙稈粗提物中綠原酸含量隨著提取溫度的升高呈先增加后降低的趨勢，提取溫度為60 ℃時提取率達到最大，約為2.08 mg·g-1，相較于50和70 ℃處理分別提高了15.51%和30.71%。提取溫度增加更有利于提高綠原酸的含量，因為高溫使分子運動加快，傳質擴散系數也急劇增加[16]，綠原酸大量從煙稈中浸出，使綠原酸含量急劇增加，由于綠原酸中含有酯鍵、不飽和雙鍵和多元酚等不穩定結構，故當溫度持續增加時，綠原酸反而會發生分解、氧化和異構化，導致綠原酸含量降低[17]。

2.2.3 提取時間對綠原酸含量的影響 由圖4可知，在微波輔助提取作用下，隨著提取時間的延長，煙草秸稈粗提物中綠原酸含量逐步增加，在100 min時達到最大。綠原酸含量在60～100 min內呈直線上升的趨勢，而在100～120 min內隨著時間增加逐漸下降。這可能是因為提取時間過長導致綠原酸氧化分解或水解[18]，因此高溫下不宜提取過長時間，最佳提取時間為100 min，此時綠原酸含量為1.75 mg·g-1，相較82 和120 min 處理得率提高了17.83%和26.67%。

2.2.4 乙醇濃度對綠原酸含量的影響 由圖5可知，綠原酸含量隨乙醇體積分數增大而增大，乙醇體積分數為50% 時綠原酸含量達到最大值，為1.90 mg·g-1。溶劑增加更有利于綠原酸的析出，但乙醇用量持續增加時，綠原酸含量反而略有降低，這是由于過高的乙醇體積分數不僅會揮發，還可能使其他雜質的滲出率有所增加[19]，從而導致綠原酸純度不高，降低綠原酸含量。

2.3 煙草秸稈中綠原酸提取工藝優化結果

2.3.1 Box-Behnken中心組合試驗設計結果 在單因素試驗基礎上，對煙草秸稈綠原酸進行三因素三水平共17 組響應面分析設計，試驗結果見表2。可以看出，不同因素水平條件下，綠原酸含量在1.45～2.65 mg·g-1 之間，其中料液比為1∶25（g·mL-1）時綠原酸含量均較高（2.49～2.65 mg·g-1），而1∶15 的處理均較低（1.45～1.58 mg·g-1），表明料液比對提取效果影響較大。

2.3.2 回歸模型的建立及顯著性分析 采用Design Expert8.0.6軟件對響應面優化試驗得到的數據進行多元回歸擬合，獲得煙草秸稈粗提物中綠原酸含量對三因素的二元多次回歸模型。

Y=2.11+0.53A ? 0.024B+0.051C ? 0.003 4AB ?0.017AC?0.006 5BC? 0.15A2+0.034B2+0.10C2 （3）

對回歸數學模型進行方差分析（表3），檢驗方程的有效性和各因子的偏回歸系數。通過統計學分析可知，模型F 值為215.52，P 值<0.000 1，表明回歸模型為極顯著；方差的失擬項（0.736 2）>0.05，故失擬項不顯著。模型R2為0.996 4，證明模型的選擇對綠原酸含量的影響可信度較高，可以用于對綠原酸含量的分析與預測。由表3可知，各因素對試驗結果的影響為A>C>B，即料液比對綠原酸含量影響最大，其次是提取溫度，乙醇體積分數影響最小。此外，A2對綠原酸含量影響為極顯著（P<0.001），C2為高度顯著（P<0.01）。

2.3.3 響應面分析 使用Design Expert 8.0.6 軟件得到響應面和等高線，如圖6所示。響應面越陡峭，表明各因素之間的兩兩交互作用越顯著，也表明該因素對響應值的影響越顯著。料液比和提取溫度，乙醇體積分數和料液比兩兩交互作用顯著，表現在這兩組交互的響應面坡度陡峭。

2.3.4 驗證性試驗 由軟件Design Expert 8.0.6分析得出煙稈粗提物中綠原酸含量最高的條件為料液比1∶15，提取溫度50.03 ℃，乙醇體積分數50%，此時綠原酸含量為3.48 mg·g-1。考慮實際操作，以提取溫度為50 ℃，按照優化后的條件進行驗證試驗。結果（表4）表明，所得綠原酸含量均值為3.49 mg·g-1，與預測值3.48 mg·g-1 接近，說明該響應面得到的預測值準確可靠，回歸方程能夠較為準確地反映各因素對綠原酸含量的影響。

2.4 綠原酸對煙草疫霉菌的影響

CK、35和175 mg·L-1 CGA處理下的煙草疫霉菌長勢如圖7所示。可以看出，低水平時，煙稈綠原酸對煙草疫霉菌的生長幾乎沒有徑向抑制，但菌落狀態有明顯的改變，菌落整體分布較為均勻，但菌絲密度顯著降低，能明顯看到中間菌餅，而對照組菌絲密集，幾乎完全掩沒中間菌餅，均勻完整的覆蓋整個培養基。煙稈綠原酸質量濃度為175mg·L-1時，對煙草疫霉菌絲徑向生長抑制效果顯著，菌落直徑明顯減小，且菌絲稀疏，分布明顯不均。煙稈綠原酸質量濃度為175 mg·L-1時對菌絲生長抑制率達到32%。因此，綠原酸質量濃度越高對煙草疫霉菌絲的抑制作用越顯著。

此外，熒光染料PI是一種能對DNA染色的細胞核染色劑，不能透過活細胞膜，但能夠與破損細胞膜內的DNA特異結合，形成紅色熒光[20]。圖8中普通光場下，對照組菌絲密集且飽滿圓潤，表面較為光滑，而在綠原酸的影響下，菌絲形態發生明顯變化，不僅疏松細小、表面粗糙，甚至有部分凹陷。熒光下未經處理的菌絲僅有少許染色，試驗組菌絲幾乎全部變紅，表明綠原酸處理后，菌絲細胞膜破損，綠原酸能夠破壞煙草疫霉菌絲的細胞膜，使細胞死亡，從而達到抑菌效果。

3 討論

煙稈綜合利用新途徑是當前的研究熱點之一，鮮見提取其活性物質用于植物病害防治。綠原酸對葡萄、黃瓜、圣女果、草莓等多種果蔬具有良好的保鮮功能[2122]，此外，綠原酸在增強植物抗病性等方面也發揮著重要的作用。Jiao等[23]研究表明，綠原酸可通過水楊酸介導的信號通路誘導桃對擴展青霉（Penicillium expansum）的抗性。同樣，Xue等[24]認為，綠原酸與內源性水楊酸具有很強的協同調控作用。為推進煙草多用途利用，實現資源最大化利用，本文以煙草秸稈為原料，使用微波輔助提取技術，結合響應面法優化研究了料液比、提取溫度、提取時間、乙醇體積分數對煙稈中粗提綠原酸含量的影響，獲取最佳提取工藝條件：料液比1∶15（g·mL-1），提取溫度50.03 ℃，乙醇體積分數50%，微波時間180 s，此時綠原酸含量為3.48 mg·g-1。進一步開展煙稈綠原酸體外抑菌試驗，證實175 mg·L-1綠原酸對煙草疫霉菌菌絲有顯著的抑制作用，抑菌率可達32%，且通過損害煙草疫霉菌細胞膜的完整性進而達到抑菌效果，這與凌天孝等[25]研究肉桂醛對煙草疫霉菌的抑制機理相一致。煙稈廉價易得，綠原酸提取工藝簡單，煙草秸稈綠原酸有望發展成為一種新的天然植物源殺菌劑。

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（責任編輯：溫小杰）