細述基因表達載體的構建過程
——由一道江蘇高考題引發的思考

何志恒

(湖北省武漢市第十二中學)

基因工程中構建基因表達載體時單酶切、雙酶切、PCR技術與瓊脂糖凝膠電泳是教學難點,在習題中也常出現錯誤,本文將通過瓊脂糖凝膠電泳在雙酶切產物分離中的作用對其進行分析。

1.背景知識,追根溯源

在使用單酶切的載體或者平端載體時,載體本身的兩個DNA末端可以匹配,產生自身連接的產物。如果載體濃度和插入DNA片段濃度均較低,則載體DNA兩個末端之間碰撞的機會大于和目的DNA末端碰撞的機會,就會導致載體DNA分子的自身連接,形成環化的載體分子。

在將目的基因片段插入到載體中的時候,由于酶切位點序列的回文特征,若使用單個限制性酶切位點進行克隆,目的片段插入的方式將會有正向和反向兩種,并且在將目的片段與載體片段連接的時候,載體片段將會發生較高程度的自連,從而降低克隆載體構建的成功率。

可見,導致目的基因環化、載體自身環化、目的基因與載體反向連接的原因是使用單酶切導致目的DNA和載體DNA的兩端只有一種黏性末端,或者酶切后的末端為平末端。

使用兩種限制酶切割即可避免目的基因、載體的錯誤連接。例如圖1和2中要切割目的基因,若使用BamHⅠ和BgtⅡ這兩種限制酶,BamHⅠ和BgtⅡ都可切出序列-GATC-的黏性末端,可以互補配對,因此用BamHⅠ和BgtⅡ同時切割目的基因不能防止酶切后含目的基因的DNA片段自身連成環狀。因此,應該選切出的黏性末端不同的兩種限制酶。

圖1

圖2

用兩種能切出不同黏性末端的限制酶切割質粒后,仍然有微量質粒只被一種限制酶切割,原因可能是反應時間太短,若時間允許,可將PCR產物的限制性酶酶切時間延長到16h以上,以保證酶切完全。

用兩種能產生不同黏性末端的限制酶切割后的質粒和目的基因進行連接反應,為避免產生目的基因、載體的錯誤連接,要先將雙酶切后的DNA片段通過瓊脂糖凝膠電泳分離,選出可用于連接反應的DNA條帶,淘汰不能用于連接反應的DNA條帶,再進行連接反應,避免目的基因、載體錯誤連接。

因此,對目的基因所在DNA、質粒用雙酶切,再進行連接反應,可得到正確的連接產物。在轉化時,轉化效率并不是100%,可能產生兩種受體細胞,一種是含重組質粒的細胞,一種是不含重組質粒的受體細胞。不含重組質粒的受體細胞中既不含重組質粒,也不含質粒,也不含環化的目的基因。

2.例題分析,修正錯誤

用能產生不同黏性末端的限制酶切后得到的是很多種連接產物,還是一種正確的連接產物,在習題中多次出現。下面筆者以三道題為例,分析酶切后的連接產物。

【例題1】(2019·江蘇卷·33)圖3是某基因工程中構建重組質粒的過程示意圖,載體質粒P0具有四環素抗性基因(tetr)和氨芐青霉素抗性基因(ampr)。請回答下列問題:

圖3

(1)EcoR V酶切位點為…GAT↓ATC…

…CTA↑TAG…＇

EcoR V酶切出來的線性載體P1為________末端。

(2)用TaqDNA聚合酶進行PCR擴增獲得的目的基因片段,其兩端各自帶有一個腺嘌呤脫氧核苷酸。載體P1用酶處理,在兩端各添加了一個堿基為________的脫氧核苷酸,形成P2;P2和目的基因片段在________酶作用下,形成重組質粒P3。

(3)為篩選出含有重組質粒P3的菌落,采用含有不同抗生素的平板進行篩選,得到A、B、C三類菌落,其生長情況如表(“+”代表生長,“-”代表不生長)。根據表中結果判斷,應選擇的菌落是________(填表中字母)類,另外兩類菌落質粒導入情況分別是________、________。

表1

(4)為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質粒,擬設計引物進行PCR鑒定。圖4所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質粒中的相應位置,PCR鑒定時應選擇的一對引物是________。某學生嘗試用圖中另外一對引物從某一菌落的質粒中擴增出了400bp片段,原因是________。

圖4

【參考答案】(1)平 (2)胸腺嘧啶(T) DNA連接 (3)B A類菌落含有P0 C類菌落未轉入質粒 (4)乙丙 目的基因反向連接

【補充說明及分析】如何使目的基因兩端各自帶有一個腺嘌呤脫氧核苷酸,質粒的兩端各自帶有一個胸腺嘧啶脫氧核苷酸?可以用末端脫氧核苷酸轉移酶給質粒、目的基因兩端添加一個脫氧核苷酸。反應完成后,會有部分質粒、目的基因沒有被添加上脫氧核苷酸。

能否分離出含有平末端(未添加成功)的質粒、目的基因呢?利用瓊脂糖凝膠電泳能分離的DNA的長度是有限的,雙鏈DNA分子在凝膠中的遷移速率與其堿基對數目的常用對數成反比,上述兩類DNA片段只相差一個堿基對,很難用瓊脂糖凝膠電泳分離開。因此即使進行瓊脂糖凝膠電泳,也很難分離出平末端的質粒、目的基因。

因此再用DNA連接酶進行連接反應后,就會出現平末端的質粒(P1)、目的基因環化的情況,其中P1重新環化為P0。

由于目的基因的兩端是堿基為A的脫氧核苷酸,處理后質粒的兩端是堿基為T的脫氧核苷酸,進行連接反應時,目的基因和質粒能夠正向連接、也能反向連接。因此,轉化后的受體細胞有四種:未轉化的、含重組質粒(P3)的、含質粒的(P0)、含環化目的基因的。因此,只能在含四環素培養基上生長的是含重組質粒(P3)的受體菌,能在含四環素和青霉素培養基上生長的是含質粒P0的受體菌,不能在含四環素培養基上生長的是未轉化的受體菌和含環化目的基因的受體菌。

通過PCR技術擴增、瓊脂糖凝膠電泳就能區分目的基因和質粒的正向連接產物、反向連接產物。如果是正向連接,擴增出的片段長度最長為350 bp,如果是反向連接,擴增出的片段長度最長為400 bp。

這道高考題很好地體現了PCR技術、瓊脂糖凝膠電泳技術在區分DNA連接產物中所起的作用,符合《課程標準》命題建議里提到的“科學性、規范性,要能夠區分出不同素養水平的學生”。但是題目中沒有詳細說明目的基因和載體連接時出現錯誤連接的原因:瓊脂糖凝膠電泳能分離的DNA長度是有限的,兩個DNA片段只相差一個堿基對,很難用瓊脂糖凝膠電泳分離開。這就導致教輔資料在模仿高考題出題時出現錯誤,如例題2。

【例題2】研究人員用圖5中質粒和圖6中含目的基因的片段構建重組質粒(圖中標注了相關限制酶切割位點),將重組質粒導入大腸桿菌后進行篩選及PCR鑒定。以下敘述不正確的是

( )

圖5

圖6

A.構建重組質粒的過程應選用BclⅠ和HindⅢ兩種限制酶

B.使用DNA連接酶將酶切后的質粒和目的基因片段進行重組

C.能在添加四環素的培養基上生存一定是含有重組質粒的大腸桿菌

D.利用PCR鑒定含目的基因的大腸桿菌時應選用引物甲和引物丙

【答案】C

【分析】本題選擇的限制酶應在目的基因兩端存在識別位點,但BamHⅠ會使質粒中的標記基因都被破壞,因此只能選BclⅠ和HindⅢ兩種限制酶切割,BclⅠ和HindⅢ兩種限制酶的識別序列不同,切割后產生的黏性末端也不同。據前文所述,在酶切反應時間充足的條件下,切割后進行瓊脂糖凝膠電泳回收切割產物,由于質粒和目的基因所在DNA被切割后產生的DNA片段長度有明顯差異,瓊脂糖凝膠電泳能將需要的片段篩選出來。再用DNA連接酶進行連接反應,則連接產物只有質粒和目的基因正確連接一種。該重組質粒只有四環素抗性基因是正常的,氨芐青霉素抗性基因因插入了目的基因而失活。因此轉化后的大腸桿菌有兩種類型:未轉化的、含重組質粒的。未轉化的大腸桿菌沒有四環素抗性基因,不能在添加四環素的培養基上生存,含重組質粒的大腸桿菌有四環素抗性基因,能在添加四環素的培養基上生存。從這個角度分析,C選項是正確的。

但此題沒有給出“酶切反應時間充足”這個條件,高中生物學教材也沒有提到:在酶切反應后先進行瓊脂糖凝膠電泳回收產物,再用DNA連接酶進行連接反應,得到的連接產物就是正確的。不了解這個過程,不理解其中的原理,做這一類題往往稀里糊涂的被動接受。可將此題題干條件補充為“酶切反應時間充足,并用瓊脂糖凝膠電泳分離出所需DNA片段后,再進行連接反應的條件下”,C選項修改為“能在添加四環素的培養基上生存的不一定是含重組質粒的大腸桿菌”,C選項才能作為此題的答案。與此題出現的錯誤類似的題有很多,例如例題3。

【例題3】運用轉基因技術,將奶牛細胞中編碼凝乳酶的基因轉移到大腸桿菌細胞中,以達到大規模生產凝乳酶的目的。圖7表示用作載體的質粒和目的基因所在DNA片段。下列操作與實驗目的不符的是

( )

圖7

A.用限制酶BamHⅠ、PstⅠ和DNA連接酶構建基因的表達載體

B.用含氨芐青霉素的培養基篩選出的即為導入目的基因的細菌

C.可用PCR技術大量擴增目的基因

D.用Ca2+處理大腸桿菌使其易于轉化

【答案】B

【分析】據前文所述,只能用BamHⅠ、PstⅠ切割。用雙酶切法產生的質粒、目的基因片段,酶切反應時間充足的條件下,經過瓊脂糖凝膠電泳后,分離出所需的DNA片段再用DNA連接酶進行連接反應,得到的應該只有質粒和目的基因的正確連接產物,含有氨芐青霉素抗性基因。轉化后大腸桿菌的種類有兩種,一種是不含重組質粒的,即只有大腸桿菌本身的DNA,一種是含重組質粒的。因此能在含氨芐青霉素的培養基上生長的即為導入目的基因的大腸桿菌,B選項應該是正確的。此題需要補充“酶切反應時間充足,并用瓊脂糖凝膠電泳分離出所需DNA片段后,再進行連接反應”,此題的B選項可修改為“用含氨芐青霉素的培養基篩選出的不一定為導入目的基因的細菌”,這樣B選項才能作為此題的答案。