圓錐角膜關鍵差異基因的鑒定與生物信息學分析

［摘要］ 目的 鑒定圓錐角膜（KC）發病過程中的差異表達基因（DEGs），探討KC潛在發病機制。

方法 分別收集5對KC與正常角膜捐獻者的角膜組織，通過mRNA表達譜芯片篩選DEGs；借助KEGG通路富集分析明確其生物學功能；通過RT－qPCR驗證候選DEGs的表達水平。

結果 共篩選出1 885個DEGs，其功能與TGF－β信號通路、ErbB信號通路、鞘磷脂信號通路、谷氨酸能突觸等有關。RT－qPCR驗證顯示，絲氨酸/蘇氨酸激酶25（STK25）、酰基輔酶A結合結構域蛋白4（ACBD4）、鋅指蛋白基因ZBTB38、組織蛋白酶B（CTSB）、3－羥基－3－甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGCR）、血小板凝血酶敏感蛋白的解聚蛋白樣金屬蛋白酶6（ADAMTS6）、DLG相關蛋白1（DLGAP1）等候選基因的表達水平與芯片結果一致。

結論 明確了KC差異基因表達譜，為后續KC發病機制的深入研究提供了基礎數據。

［關鍵詞］ 圓錐角膜；寡核苷酸序列分析；計算生物學

［中圖分類號］ R772.23

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 2096－5532（2023）02－0221－05

doi：10.11712/jms.2096－5532.2023.59.005

［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

圓錐角膜（KC）是一種常見的退行性角膜疾病，其特征是角膜中央和旁中央區基質變薄，角膜曲率增加，通常伴有不規則散光、高度近視等。全世界范圍內，KC的患病率為5‰～25‰，尤其好發于青少年。既往研究表明，遺傳和環境因素是決定KC發生和發展的關鍵要素。系列證據表明，KC的發病機制主要包括膠原纖維排列紊亂、膠原片擴張和增寬、基質層分裂成多束膠原纖維，最終導致基質層變薄。但KC的發病機制在分子層面上尚未完全明確。mRNA表達譜芯片作為一種高通量基因表達分析平臺，廣泛應用于分子診斷、基因表達譜分析等領域。本研究以KC病人及正常角膜捐獻者的角膜組織為研究對象，利用人mRNA表達譜芯片鑒定KC中差異表達基因（DEGs），并結合生物信息學分析初步揭示其生物學功能，為后續KC發病機制研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 標本收集

KC樣本來自山東第一醫科大學附屬眼科醫院收治的5例角膜移植術病人術后組織，其中男4例，女1例，年齡14～21歲，平均（16.0±2.9）歲；其診斷基于病史以及裂隙燈顯微鏡和角膜地形圖等檢查結果。對照樣本（CON）為5例健康角膜捐獻者的角膜環，男4例，女1例，年齡15～21歲，平均（18.2±2.4）歲。兩組樣本的性別、年齡差異無統計學意義（Pgt;0.05）。5對樣本用于mRNA表達譜芯片檢測。本研究由山東第一醫科大學附屬眼科醫院倫理委員會批準和監督，并根據赫爾辛基宣言的原則進行操作。所有參與者均簽署知情同意書。

1.2 總RNA的提取

將收集的角膜樣本采用Trizol法提取RNA，按照試劑盒說明書進行操作，并將純化的RNA保存于-80 ℃冰箱備用。

1.3 DEGs的鑒定

利用上海康成生物科技公司提供的mRNA表達譜芯片（8×60 K，Arraystar）進行表達譜分析。首先將RNA樣品擴增并轉錄成熒光cDNAs，然后將cDNAs與人mRNA微陣列4.0雜交。清洗和固定后，用安捷倫掃描儀G2505C系統對陣列進行掃描。最后使用GeneSpring GX Version 12.1軟件對所獲得的原始數據進行分位數歸一化和進一步的數據處理，并對KC與CON的數據集進行分層聚類分析與火山圖可視化分析。以基因表達差異倍數≥2以及統計學處理結果顯示Plt;0.05作為標準鑒定DEGs。

1.4 KEGG通路富集分析

通過DAVID6.8數據庫（https：//david.ncifＧcrf.gov/），以Plt;0.05、差異倍數≥2為界值，對DEGs進行KEGG通路富集分析。

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT－qPCR）驗證DEGs

根據試劑盒的說明書，將提取的總RNA反轉錄成cDNA，進行RT－qPCR檢測。以靶基因濃度/GAPDH濃度作為靶基因校正相對水平。候選靶基因的引物名稱及其序列見表1。

1.6 統計學分析

使用Graph Pad Prism 7.00軟件進行統計學分析。計量資料結果以±s形式表示，組間比較采用t檢驗。應用Fisher精確檢驗鑒定KEGG通路富集分析顯著富集的途徑。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 KC組織DEGs的聚類分析以及火山圖可視化分析

本文分層聚類分析結果表明，KC組與CON組樣本出現明顯聚類現象，存在明顯的基因富集（圖1A）。火山圖可視化結果表明，共鑒定出1 885個DEGs，其中1 071個上調基因（6.19%），814個下調基因（4.71%）；15 412個基因無顯著變化（89.1%）（圖1B）。表明KC角膜組織發生明顯的基因表達差異。

2.2 KC組織DEGs的KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析結果顯示，下調基因主要參與松弛素信號通路、鞘磷脂信號通路、長壽調控通路、谷氨酸能突觸等信號通路（圖2A）；而上調基因主要富集在TGF－β信號通路、ErbB信號通路、軸突導向、FcγR介導的吞噬等信號通路（圖2B）。

2.3 候選DEGs的RT－qPCR水平驗證

針對15個候選差異基因進行的RT－qPCR水平驗證結果顯示，與CON組比較，KC組STK25、ACBD4、CRBN、ZBTB38、CTSB、ABHD16A、SAR1B等基因的表達水平明顯增加，差異有統計學意義（t=2.821～8.945，Plt;0.05）；而HMGCR、ADAMTS6、SRPX2、DLGAP1等基因的表達水平則明顯降低，差異有顯著統計學意義（t=2.802～7.838，Plt;0.05）。見表2。

A：DEGs的分層聚類分析圖，紅色條碼代表表達上調基因，藍色條碼代表表達下調基因；B：DEGs的火山圖，藍點代表下調基因，紅點代表上調基因。橫坐標為表達差異倍數log2（Fold Change），縱坐標為－log10（P value）。

3 討 論

作為一種常見的好發于青春期的擴張性角膜疾病，KC會導致視力嚴重降低。大量證據表明，遺傳與環境因素均在KC的發病中起關鍵作用，但目前對KC的確切病理機制仍不明確。本研究通過mRNA表達譜芯片數據分析，建立了KC角膜差異基因表達譜，并且這些DEGs在功能上與TGF－β信號通路、ErbB信號通路、鞘磷脂信號通路以及谷氨酸能突觸等信號通路有關。這些結果為后續探討KC的發病機制研究提供了有價值的線索。

研究表明，TGF－β信號通路、鞘磷脂信號通路、Hedgehog信號通路等信號通路失調參與KC的發病。本文通過KEGG通路富集分析發現，TGF－β信號通路以及鞘磷脂信號通路等在KC角膜DEGs中顯著富集，進一步表明本研究數據的可靠性。此外，本研究還在KC角膜DEGs中富集到了松弛素信號通路、ErbB信號通路以及FcγR介導的吞噬等尚未報道的信號通路。相關研究顯示，松弛素信號通路、Erb信號通路以及FcγR介導的吞噬等信號通路在角膜發育、損傷修復等方面發揮重要的作用。這提示本文新鑒定的信號通路可能在KC發病過程中發揮重要的調節作用，但需實驗證據支持。

角膜是神經纖維非常豐富的組織，但神經在KC發病機制中的作用尚不明確。有研究通過共聚焦顯微鏡研究發現，KC病人的角膜神經在形態上發生明顯變化，主要表現為神經纖維變短、基底神經叢纏繞過程增強、基底神經叢密度下降。在功能上，KC病人的角膜神經支配與神經敏感度較正常角膜顯著下降。但目前有關KC病人角膜神經的形態與功能改變的分子機制尚不清楚。本研究顯示，KC組織部分DEGs在功能上與谷氨酸能突觸、神經軸突導向等信號通路密切關聯，這在分子層面上支持KC病人的角膜神經功能異常，但需后續實驗驗證。

相關研究顯示，細胞外基質降解、細胞凋亡與自噬等是KC的重要病理機制。作為一種常見的溶酶體半胱氨酸肽酶，CTSB在調控細胞外基質降解、細胞凋亡等方面發揮重要作用。KC組織中CTSB的表達上調提示其可能通過上述機制參與KC的發病過程。HMGCR是膽固醇合成途徑的關鍵限速酶，其表達水平與施尼德結晶狀角膜營養不良發生有關，提示其可能通過影響膽固醇合成參與KC的發病過程。另外還有研究結果顯示，ABHD16A和SAR1B基因與脂質穩態調節等密切相關。而本文研究結果顯示，KC組織中的ABHD16A和SAR1B表達上調，推測上述兩種基因可能通過調控脂質代謝途徑影響KC的發病過程。此外，ADAMTS可以調節基質降解、生理和病理組織重塑、細胞侵襲和轉移，而KC的病理過程與基質降解密切相關，ADAMTS6表達水平上調提示其可能通過調控基質降解過程參與KC的發病。

KABZA等通過轉錄組研究發現，KC組織中存在異常的TGF－β信號通路。本研究結果顯示，TGF－β信號通路在KC組織的上調DEGs中顯著富集，并且TGF－β表達水平下降。TGF－β信號是參與調節細胞外基質（ECM）分泌和組裝的關鍵信號通路之一，與纖維化密切相關。而TGF－β主要作用是抗纖維化，并且可以刺激KC基質細胞（HKC）生成正常的ECM，促進正常ECM合成。推測TGF－β信號通路的失調可能與KC組織ECM的改變有關。

綜上所述，本文通過人mRNA表達譜芯片檢測明確了KC差異基因表達譜，在功能上DEGs與TGF－β信號通路、ErbB信號通路、鞘磷脂信號通路、谷氨酸能突觸等有關。本文結果可為后續KC的診斷與機制研究等提供參考。

［參考文獻］

MAS TUR V， MACGREGOR C， JAYASWAL R， et al. A review of keratoconus： diagnosis， pathophysiology， and gene－tics." Survey of Ophthalmology， 2017，62（6）：770－783.

WOJCIK K A， BLASIAK J， SZAFLIK J， et al. Role of biochemical factors in the pathogenesis of keratoconus." Acta Biochimica Polonica， 2014，61（1）：55－62.

GORDON－SHAAG A， MILLODOT M， SHNEOR E， et al. The genetic and environmental factors for keratoconus." BioMed Research International， 2015， 2015：795738.

WOJAKOWSKA A， PIETROWSKA M， WIDLAK P， et al. Metabolomic signature discriminates normal human Cornea from keratoconus-a pilot GC/MS study." Molecules （Basel， Switzerland）， 2020，25（12）： E2933.

KHALED M L， HELWA I， DREWRY M， et al. Molecular and histopathological changes associated with keratoconus." BioMed Research International， 2017， 2017：7803029.

KHALED M L， BYKHOVSKAYA Y， YABLONSKI S E R，et al. Differential expression of coding and long noncoding RNAs in keratoconus－affected corneas." Investigative Oph－thalmology amp; Visual Science， 2018，59（7）：2717－2728.

HAN S H， CHOE J. Diverse molecular functions of m6A mRNA modification in cancer." Experimental amp; Molecular Medicine， 2020，52（5）：738－749.

SHARIF R， BAK－NIELSEN S， HJORTDAL J， et al. Pathogenesis of Keratoconus： the intriguing therapeutic potential of Prolactin－inducible protein." Progress in Retinal and Eye Research， 2018，67：150－167.

ENGLER C， CHAKRAVARTI S， DOYLE J， et al. Transforming growth factor－β signaling pathway activation in Keratoconus." American Journal of Ophthalmology， 2011，151（5）：752－759.e2.

LYON D， MCKAY T B， SARKAR－NAG A， et al. Human keratoconus cell contractility is mediated by transforming growth factor－beta isoforms." Journal of Functional Biomaterials， 2015，6（2）：422－438.

QI H， PRIYADARSINI S， NICHOLAS S E， et al. Analysis of sphingolipids in human corneal fibroblasts from normal and keratoconus patients." Journal of Lipid Research， 2017，58（4）：636－648.

YOU J J， CORLEY S M， WEN L， et al. RNA－Seq analysis and comparison of corneal epithelium in keratoconus and myopia patients." Scientific Reports， 2018，8（1）：389.

HAMPEL U， CHINNERY H R， GARREIS F， et al. Ocular phenotype of relaxin gene knockout （rln-/-） mice." Current Eye Research， 2020，45（10）：1211－1221.

HAMPEL U， KLONISCH T， MAKRANTONAKI E， et al. Relaxin 2 is functional at the ocular surface and promotes corneal wound healing." Investigative Ophthalmology amp; Visual Science， 2012，53（12）：7780－7790.

XU K P， RIGGS A， DING Y， et al. Role of ErbB2 in corneal epithelial wound healing." Investigative Ophthalmology amp; Visual Science， 2004，45（12）：4277－4283.

FLOCKERZI E， DAAS L， SEITZ B. Structural changes in the corneal subbasal nerve plexus in keratoconus." Acta Ophthalmologica， 2020，98（8）： e928－e932.

PATEL D V， MCGHEE C N J. Mapping the corneal sub－basal nerve plexus in keratoconus by in vivo laser scanning confocal microscopy." Investigative Ophthalmology amp; Visual Science， 2006，47（4）：1348－1351.

NIEDERER R L， PERUMAL D， SHERWIN T， et al. Laser scanning in vivo confocal microscopy reveals reduced innervation and reduction in cell density in all layers of the keratoconic cornea." Investigative Ophthalmology amp; Visual Science， 2008，49（7）：2964－2970.

PATEL D V， KU J Y， JOHNSON R， et al. Laser scanning in vivo confocal microscopy and quantitative aesthesiometry reveal decreased corneal innervation and sensation in keratoconus." Eye （London， England）， 2009，23（3）：586－592.

DAVIDSON A E， HAYES S， HARDCASTLE A J， et al. The pathogenesis of keratoconus." Eye， 2014，28（2）：189－195.

NETTESHEIM A， SHIM M S， DIXON A， et al. Cathepsin B localizes in the caveolae and participates in the proteolytic cascade in trabecular meshwork cells. potential new drug target for the treatment of Glaucoma." Journal of Clinical Medicine， 2020，10（1）： E78.

SENDLER M， MAERTIN S， JOHN D， et al. Cathepsin B activity initiates apoptosis via digestive protease activation in pancreatic acinar cells and experimental pancreatitis. "The Journal of Biological Chemistry， 2016，291（28）：14717－14731.

HANDA S， THAKUR A， RAJNEESH D， et al. Schnyder's crystalline corneal dystrophy." QJM： Monthly Journal of the Association of Physicians， 2020，113（1）：66.

JIANG S Y， TANG J J， XIAO X， et al. Schnyder corneal dystrophy－associated UBIAD1 mutations cause corneal cholesterol accumulation by stabilizing HMG－CoA reductase." PLoS Genetics， 2019，15（7）： e1008289.

LEMIRE G， ITO Y A， MARSHALL A E， et al. ABHD16A deficiency causes a complicated form of hereditary spastic paraplegia associated with intellectual disability and cerebral ano－malies." American Journal of Human Genetics， 2021，108（10）：2017－2023.

LU Y， ZHOU S K， CHEN R， et al. Knockdown of SAR1B suppresses proliferation and induces apoptosis of RKO colorectal cancer cells." Oncology Letters， 2020，20（5）：186.

XIE Y X， GOU Q H， XIE K Q， et al. ADAMTS6 suppresses tumor progression via the ERK signaling pathway and serves as a prognostic marker in human breast cancer." Oncotarget， 2016，7（38）：61273－61283.

DI MARTINO E， ALI M， INGLEHEARN C F. Matrix me－talloproteinases in keratoconus－Too much of a good thing" Experimental Eye Research， 2019，182：137－143.

KABZA M， KAROLAK J A， RYDZANICZ M， et al. Collagen synthesis disruption and downregulation of core elements of TGF－β， Hippo， and Wnt pathways in keratoconus corneas." European Journal of Human Genetics： EJHG， 2017，25（5）：582－590.

MENG X M， NIKOLIC－PATERSON D J， LAN H Y. TGF－β： the master regulator of fibrosis." Nature Reviews Nephrology， 2016，12（6）：325－338.

趙桂秋，孟巖，李艷，等. 膠原在圓錐角膜中的表達." 青島大學醫學院學報， 2003，39（1）：58－61，65.

PRIYADARSINI S， MCKAY T B， SARKER－NAG A， et al. Keratoconus in vitro and the key players of the TGF－β pathway." Molecular Vision， 2015，21：577－588.

（本文編輯 黃建鄉）