白術內酯Ⅰ對慢傳輸型便秘模型大鼠腸道菌群影響

［摘要］ 目的 探討白術內酯Ⅰ對復方地芬諾酯（CDT）誘導的慢傳輸型便秘（STC）模型大鼠的治療作用及對大鼠腸道菌群的影響。

方法 將40只SD大鼠隨機分為正常對照組、模型組、白術內酯Ⅰ組和普蘆卡比利組，每組10只。除正常對照組外，其余3組均以CDT懸濁液連續灌胃3周，制備STC大鼠模型。造模成功后，白術內酯Ⅰ組和普蘆卡比利組分別應用白術內酯Ⅰ、普蘆卡比利治療3周。檢測大鼠的糞便含水率、腸道炭末推進率；采用16S rRNA測序法分析大鼠腸道菌群變化；采用氣相色譜－質譜聯用（GC－MS）法檢測大鼠腸道內容物中短鏈脂肪酸含量。

結果 與模型組相比較，白術內酯Ⅰ組大鼠糞便含水率和腸道炭末推進率增加（F=38.144、34.676，Plt;0.01）。與模型組相比較，白術內酯Ⅰ組大鼠腸道菌群Simpson指數降低（F=12.112，Plt;0.01），物種組成中門分類水平下厚壁菌門豐度降低（H=12.347，Plt;0.05），屬分類水平下普雷沃菌科_UCG－003、擬桿菌屬、副擬桿菌屬等豐度增加（H=8.280～9.663，Plt;0.05）。與模型組相比較，白術內酯Ⅰ組大鼠腸道內容物短鏈脂肪酸中乙酸、丙酸含量顯著上升（F=35.216、35.897，Plt;0.01）。

結論 白術內酯Ⅰ可以增加大鼠糞便含水量、加快腸道蠕動，改善大鼠便秘癥狀。其作用機制可能是通過改善腸道菌群紊亂，增加腸道菌群代謝產物乙酸、丙酸含量。

［關鍵詞］ 白術內酯Ⅰ；便秘；胃腸道微生物組；脂肪酸類，揮發性；大鼠

［中圖分類號］ R574.62;R285

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 2096－5532（2023）02－0216－05

doi：10.11712/jms.2096－5532.2023.59.036

［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

慢傳輸型便秘（STC）是由于腸道推進力不足導致的功能性便秘。其主要臨床表現為排便次數減少、排便困難、糞便干硬等。STC具體發病原因尚不明確，有研究表明，腸道菌群失衡與STC有著密不可分的關系，厚壁菌門等菌群比例改變可導致便秘的發生。腸道是細菌代謝的溫床，其主要產物是短鏈脂肪酸，包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸等。大量研究報道，中草藥生白術能有效改善便秘癥狀。而白術內酯Ⅰ是白術的主要成分之一，關于其通便功能的研究較少，具體機制未知。本實驗旨在探討白術內酯Ⅰ對STC模型大鼠便秘癥狀及腸道菌群的作用，進一步明確白術內酯Ⅰ治療STC的藥理作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性SPF級SD大鼠40只，6～7周齡，體質量（180±20）g。實驗動物合格證號：SCXK（魯）2019－0003；青島大學動物倫理委員會批準號：AHQU20200625。

1.1.2 主要藥物 造模藥物復方地芬諾酯（CDT），由常州康普藥業有限公司生產（批號H32022716），臨用時以蒸餾水制成15 mg/kg懸濁液；治療藥物白術內酯Ⅰ，由大連美侖生物技術有限公司生產（批號MB6520），臨用時以蒸餾水配制成10 mg/kg懸濁液；對照藥物普蘆卡比利，由西安楊森制藥有限公司生產（批號H20171241），規格為每片2 mg，臨用時以蒸餾水配制成0.18 mg/kg懸濁液。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與處理 大鼠每籠5只，按照國家《實驗動物管理條例》要求飼養，飼養環境需保持充分通風，并定時更換敷料，飼養期間大鼠可自由進食、飲水。按隨機化原則將40只大鼠分為正常對照組（N組）、模型組（M組）、白術內酯Ⅰ組（A組）和普蘆卡比利組（P組），每組10只。后3組參考李根林等的研究以CDT懸濁液連續灌胃3周（每天15 mg/kg），制備STC大鼠模型；N組則以等量蒸餾水連續灌胃3周。造模結束后，每組隨機取4只大鼠檢驗造模效果。造模成功后，N、M組大鼠予以蒸餾水0.1 mL/kg灌胃，A組大鼠給予10 mg/kg白術內酯Ⅰ懸濁液灌胃，P組給予0.18 mg/kg普蘆卡必利懸濁液灌胃，均連續灌胃3周。

1.2.2 糞便含水率的測定 分別于造模結束后、治療藥物干預后收集各組大鼠當日糞便，稱濕質量。將糞便放入烤箱，以150 ℃烘烤15 min后稱其干質量。糞便干濕質量差值與糞便濕質量比值為糞便含水率。

1.2.3 炭末推進率測定 造模結束后每組隨機取4只大鼠進行測定，治療藥物干預后對各組剩余6只大鼠進行測定。方法如下：禁食24 h（不禁水），每只大鼠灌服100 g/L活性炭懸液2 mL；置于籠中自由活動30 min后采用烏拉坦腹腔注射法麻醉大鼠；麻醉成功后迅速剖開腹腔，摘除全部小腸，在無張力狀態下測量小腸全長和幽門至炭末推進最前端的距離。炭末推進最前端到幽門的距離與全小腸長度的比值為炭末推進率。

1.2.4 腸道菌群測定 藥物干預結束后，收集大鼠新鮮糞便，置于－80 ℃保存。基于二代測序平臺，采用16S rRNA測序法，對高變區段PCR產物進行高通量測序，分析大鼠腸道菌群變化。在此基礎上進行Alpha多樣性分析，通過Simpson指數反映菌群多樣性。

1.2.5 氣相色譜－質譜聯用（GC－MS）法檢測短鏈脂肪酸含量 藥物干預結束后，收集大鼠盲腸內容物，置于－80 ℃保存。GC條件：HP FFAP毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口的溫度為260 ℃；進樣量為1 μL，分流進樣，分流比10∶1；柱溫起始溫度設置為80 ℃，維持1 min，以40 ℃/min速度升溫至120 ℃，然后以10 ℃/min速度升溫至200 ℃；載氣為高純氦氣，流量為1.0 mL/min。MS條件：電子轟擊離子源（EI離子源）；離子源溫度為230 ℃；四級桿溫度150 ℃；傳輸線溫度230 ℃；電子轟擊能量70 eV；選擇離子掃描模式（SIM）。

1.3 統計學方法

采用SPSS 24.0軟件進行數據統計分析。計量數據以±s形式表示，糞便含水率、炭末推進率、短鏈脂肪酸含量、Simpson指數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD（Least Significant Difference）法。各組腸道菌群結構組成比較采用Kruskal－Wallis檢驗，組間兩兩比較采用Wilcoxon檢驗。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 造模效果

CDT干預3周后，4組大鼠糞便含水率和炭末推進率差異具有統計學意義（F=38.144、34.676，Plt;0.01）。兩兩比較結果顯示，M、P、A組大鼠糞便含水率和炭末推進率較N組均顯著下降（Plt;0.01）。說明造模各組大鼠糞便在腸道內滯留時間增長，腸蠕動受到影響，致使出現便秘癥狀，提示造模成功。見表1。

2.2 白術內酯Ⅰ對STC模型大鼠糞便含水率影響

治療藥物干預3周后，4組大鼠糞便含水率差異具有統計學意義（F=7.242，Plt;0.01）。兩兩比較結果顯示：與N組比較，M組大鼠糞便含水率顯著下降（Plt;0.01）；與M組比較，P、A組大鼠糞便含水率均顯著上升（Plt;0.05）。提示經治療藥物干預后，STC模型大鼠便秘癥狀得到改善。見表2。

2.3 白術內酯Ⅰ對STC模型大鼠炭末推進率影響

治療藥物干預3周后，4組大鼠腸道炭末推進率差異具有統計學意義（F=33.669，Plt;0.01）。兩兩比較結果顯示：與N組相比，M組大鼠炭末推進率顯著下降（Plt;0.01）；與M組相比，P、A組大鼠炭末推進率均顯著升高（Plt;0.01）。提示經治療藥物干預后，STC模型大鼠腸動力得到恢復。見表2。

兩指標組間比較，F=38.144、34.676，Plt;0.01。與N組相比較，**Plt;0.01。

兩指標組間比較，F=7.242、33.669，Plt;0.01。與N組相比較，*Plt;0.05，**Plt;0.01；與M組相比較，#Plt;0.05，##Plt;0.01。

2.4 白術內酯Ⅰ對大鼠腸道菌群的影響

2.4.1 白術內酯Ⅰ對大鼠腸道菌群多樣性的影響

4組大鼠Simpson指數差異具有統計學意義（F=12.112，Plt;0.01）。兩兩比較結果顯示：與N組相比，M組大鼠Simpson指數顯著增加（Plt;0.01）；與M組相比，P組和A組大鼠Simpson指數顯著降低（Plt;0.05）。說明CDT干預后大鼠腸道菌群多樣性遭到破壞，而白術內酯Ⅰ干預可改善腸道菌群多樣性。見表3。

2.4.2 白術內酯Ⅰ對大鼠腸道菌群結構組成的影響 在門分類水平上，各組大鼠腸道菌群主要為厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteriota）、擬桿菌門（Bacteroidota）和螺旋菌門（Spirochaetota）等。4組大鼠厚壁菌門豐度差異具有統計學意義（H=12.347，Plt;0.05）。兩兩比較結果顯示：與N組相比較，M組大鼠腸道厚壁菌門豐度顯著增加（Plt;0.01）；而經治療藥物干預后，與M組相比，P組和A組厚壁菌門豐度顯著降低（Plt;0.05）。見圖1。在屬分類水平上，4組大鼠柯林斯菌屬（Collinsella）、普雷沃菌科_UCG－003（Prevotellaceae_UCG－003）、擬桿菌屬（Bacteroides）、副擬桿菌屬（Parabacteroides）差異均具有統計學意義（H=8.280～9.663，Plt;0.05）。兩兩比較結果顯示，與M組相比較，P組大鼠腸道柯林斯菌屬豐度顯著增加（Plt;0.01），A組大鼠腸道普雷沃菌科_UCG－003、擬桿菌屬、副擬桿菌屬豐度顯著增加（Plt;0.05）。見圖2。

2.5 白術內酯Ⅰ對大鼠腸道內容物短鏈脂肪酸含量的影響

短鏈脂肪酸含量變化主要以乙酸、丙酸、丁酸變化為主。4組大鼠乙酸、丙酸、丁酸含量差異均具有統計學意義（F=14.656～35.897，Plt;0.01）。兩兩比較結果顯示：與N組相比，M組大鼠腸道內容物乙酸、丙酸和丁酸含量顯著降低（Plt;0.01）；治療藥物干預后，與M組相比，P組和A組大鼠腸道內容物乙酸和丙酸含量均顯著增加（Plt;0.01），而丁酸含量無顯著變化（P＞0.05）。說明白術內酯Ⅰ可增加腸道中乙酸、丙酸的釋放，但對丁酸含量無明顯影響。見表3。

3 討 論

STC是功能性便秘中最為常見的一種，主要表現為腸道內容物通過時間延長，在世界各地廣泛發病。越來越多的臨床和動物實驗證據表明，基于腦－腸－菌群軸，腸道菌群和STC密切相關。腸道菌群結構改變可影響胃腸動力，例如菌群比例失調或單純有益菌群的匱乏均會減弱胃腸蠕動，從而促使便秘的發生。為闡明腸道菌群如何影響腸動力，研究者們對腸道微生物組成結構及其代謝產物做了一系列研究。健康成年人腸道菌群門類以厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門為優勢菌門。而便秘病人腸道菌群的改變主要體現為厚壁菌門和擬桿菌門比值的改變。例如ZHU等研究發現，便秘病人腸道中厚壁菌門和擬桿菌門比值高于健康人，且普雷沃菌數量顯著減少。本實驗結果顯示，白術內酯Ⅰ能下調大鼠腸道菌群中厚壁菌門豐度，與有關研究結果一致。在菌群相關的治療方案中，可以通過糞菌移植、應用益生菌類藥物等方法改變病人腸道菌群結構，以達到治療便秘的目的。

短鏈脂肪酸是腸道細菌主要的代謝產物，其含量的多少顯著影響腸道內環境穩態。有研究結果顯示，便秘病人腸道中不產生丁酸的普雷沃菌顯著減少，產生丁酸的羅氏菌屬顯著增加，提示丁酸產量的增加可能會導致便秘。另有研究結果顯示，乙酸產生菌與小腸傳輸率和糞便含水量呈正相關，表明乙酸對緩解便秘也有一定的作用。乙酸含量增高可以促進腸道激素5－羥色胺等的分泌，從而改變腸壁通透性，加速胃腸蠕動以及黏液分泌。WANG等研究發現，小鼠腸道內益生菌可通過提高丙酸的含量，降低腸道內pH值，縮短腸內容物排出體外的時間。有研究指出，擬桿菌是腸道菌群中多糖降解酶的主要生產者之一。而各種難以消化的多糖降解后的主要產物有短鏈脂肪酸、CO2、H2等，與宿主的健康密切相關。短鏈脂肪酸中丙酸的生成有兩種途徑，一是通過擬桿菌的琥珀酸途徑產生；二是通過厚壁菌的乳酸途徑，經丙烯酸酯代謝產生。本實驗中，白術內酯Ⅰ可增加腸道中丙酸含量，同時上調擬桿菌屬豐度，推測白術內酯Ⅰ可能是通過影響琥珀酸途徑造成丙酸含量變化。

綜上所述，白術內酯Ⅰ很有可能通過調節腸道菌群，增加其代謝產物乙酸、丙酸含量，緩解大鼠便秘癥狀。但本研究針對菌群差異只分析到門、屬水平，對差異菌種等更多分類水平未做研究，下一步將對普雷沃菌科_UCG－003、擬桿菌屬等對腸動力的影響作進一步研究。

［參考文獻］

中華醫學會消化病學分會胃腸動力學組，功能性胃腸病協作組. 中國慢性便秘專家共識意見（2019，廣州）." 中華消化雜志， 2019，39（9）：577－598.

PARTHASARATHY G， CHEN J， CHEN X F， et al. Relationship between microbiota of the colonic mucosa vs feces and symptoms， colonic transit， and methane production in female patients with chronic constipation." Gastroenterology， 2016，150（2）：367－379.e1.

ROS－COVIN D， RUAS－MADIEDO P， MARGOLLES A， et al. Intestinal short chain fatty acids and their link with diet and human health." Frontiers in Microbiology， 2016，7：185.

貢鈺霞，侯毅，錢海華，等. 枳實與生白術配伍對慢傳輸型便秘大鼠腸道傳輸功能的影響." 中醫學報， 2016，31（12）：1936－1938.

LI M N， DONG X， GAO W， et al. Global identification and quantitative analysis of chemical constituents in traditional Chinese medicinal formula Qi－Fu－Yin by ultra－high perfor－

mance liquid chromatography coupled with mass spectrometry." Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis， 2015，114：376－389.

李根林，張顏語，李寒冰. 復方地芬諾酯建立大鼠便秘模型及對腸道菌群的影響." 中國組織工程研究， 2016，20（49）：7404－7410.

HUANG L S， ZHU Q， QU X， et al. Microbial treatment in chronic constipation." SCIENCE CHINA Life Sciences， 2018，61（7）：9.

MARIAT D， FIRMESSE O， LEVENEZ F， et al. The Firmicutes/Bacteroidetes ratio of the human microbiota changes with age." BMC Microbiology， 2009，9：123.

ZHU L X， LIU W S， ALKHOURI R， et al. Structural changes in the gut microbiome of constipated patients." Physiological Genomics， 2014，46（18）：679－686.

胡鈺，尤焱南，趙霞，等. 基于16S rDNA和GC－MS技術研究胡黃連治療便秘小鼠的作用機制." 中國中藥雜志， 2021，46：1－15.

ZHANG X Y， TIAN H L， GU L L， et al. Long－term follow－up of the effects of fecal microbiota transplantation in combination with soluble dietary fiber as a therapeutic regimen in slow transit constipation." Science China Life Sciences， 2018，61（7）：779－786.

DING C， FAN W T， GU L L， et al. Outcomes and prognostic factors of fecal microbiota transplantation in patients with slow transit constipation： Results from a prospective study with long－term follow－up." Gastroenterology Report， 2018，6（2）：101－107.

GE X L， ZHAO W， DING C， et al. Potential role of fecal microbiota from patients with slow transit constipation in the regulation of gastrointestinal motility." Scientific Reports， 2017，7（1）：441.

WANG L L， CEN S， WANG G， et al. Acetic acid and butyric acid released in large intestine play different roles in the alle－

viation of constipation." Journal of Functional Foods， 2020，69：103953.

YANO J M， YU K， DONALDSON G P， et al. Indigenous bacteria from the gut microbiota regulate host serotonin biosynthesis." Cell， 2015，161（2）：264－276.

WANG L L， HU L J， XU Q， et al. Bifidobacterium adolescentis exerts strain－specific effects on constipation induced by loperamide in BALB/c mice." International Journal of Molecular Sciences， 2017，18（2）：E318.

LAPBIE P， LOMBARD V， DRULA E， et al. Bacteroidetes use thousands of enzyme combinations to break down glycans." Nature Communications， 2019，10（1）：2043.

FANG Q Y， HU J L， NIE Q X， et al. Effects of polysaccharides on glycometabolism based on gut microbiota alteration." Trends in Food Science amp; Technology， 2019，92：65－70.

LOUIS P， HOLD G L， FLINT H J. The gut microbiota， bacterial metabolites and colorectal cancer." Nature Reviews Microbiology， 2014，12（10）：661－672.

（本文編輯 馬偉平）