環狀RNA hsa_circ_103809 在結腸癌中的表達及其臨床意義

張繼超，滕賢麟，顏喜勝，林恒軍，邱學科

1.金華市人民醫院腫瘤肛腸外科，浙江金華 321000；2.金華市人民醫院檢驗科，浙江金華 321000

近年來隨著人們生活水平的提高，不良的生活飲食習慣導致結腸癌發病率升高，且已成為近年來發病率上升最快的惡性腫瘤，目前發病率高居第4位[1]。結腸癌細胞浸潤可沿壁環行發展或沿腸管縱行發展，早期可無明顯癥狀，易被患者忽視，從而耽誤最佳的治療時機[2]。因此，對結腸癌“早診斷、早治療”可能是提高患者生存率與治愈率的重要途徑。環狀RNA（circular RNA，circRNA）進化保守，血清中表達穩定，可作為微小RNA（microRNA，miR）的分子海綿參與人體多項生理功能調控，成為腫瘤標志物的潛力巨大[3]。hsa_circ_103809 已被證實在多種惡性腫瘤中呈異常表達[4-5]，已有研究顯示，該基因可通過miR-532-3p/叉頭轉錄因子O4（forkhead transcription factor O4，FOXO4）軸對結直腸癌細胞的增殖和遷移進行調控[6]，但關于該基因與結腸癌患者預后及生存的相關報道較少。本研究擬對不同細胞株結腸癌細胞hsa_circ_103809 表達進行檢測，以驗證既往研究結果，再對結腸癌組織及癌旁組織中該基因的表達進行檢測分析，并運用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線、Kaplan-Meier 生存曲線、Log rank 檢驗及Cox風險回歸模型闡明hsa_circ_103809在結腸癌中的表達及其臨床意義，為尋找結腸癌診斷標志物提供新思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2018 年6 月至2019 年6 月于金華市人民醫院結直腸肛門外科且術后病理明確為結腸癌患者80 例為觀察對象，納入標準：①術后病理顯示均符合結腸癌診斷標準[7]；②年齡35～75 歲；③均為首次確診為結腸癌且首次進行結腸癌根治術者；④術前未接受放、化療者；⑤病例完整者。排除標準：①肝腎衰竭者；②血液系統疾病者；③合并除結腸癌外其他惡性腫瘤者；④其他惡性腫瘤轉移至結腸者；⑤傳染性疾病者。男42 例，女38 例，年齡35～75 歲，平均（56.00±8.25）歲；病理分期：Ⅰ期16 例，Ⅱ期41 例，Ⅲ期23 例；分化程度：高分化27 例，中分化38 例，低分化15 例；腫瘤類型：腺癌65 例，黏液腺癌15 例；腫瘤位置，左半結腸44 例，右半結腸36 例。所有入組患者均知曉本研究內容，并簽署知情同意書，獲得金華市人民醫院醫學倫理委員會批準（倫理審批號：L20180336）。

1.2 實驗細胞、試劑及儀器

結腸癌HCT116、SW480、DLD-1、SW620 細胞株及正常結腸上皮NCM460 細胞株均購自中國科學院上海生物細胞研究所。RPMI 1640 培養基購自（美國Sigma 公司，貨號SLBT7314）；胎牛血清（上海依科賽生物科技有限公司，貨號20210928）；直送風超凈工作臺（上海篤特科學儀器有限公司）；M5 型酶標儀（美國Mo-lecular Devices Spectramax 公司）；恒溫培養箱（美國Nuaire 公司）；-80℃冰箱（東莞皓天鑫公司）；ABI Prism7500 PCR 儀（美國Applied Biosystems 公司）。

1.3 細胞培養

正常結腸上皮 NCM460 細胞株及結腸癌HCT116、SW480、SW620、DLD-1 細胞株解凍后使用RPMI 1640 培養基進行培養，并向培養基中加入10%胎牛血清及1%青霉素（100U/ml）、鏈霉素（100μg/ml），觀察無漂起細胞后放入細胞培養箱中在37℃、5%CO2條件下培養，當細胞融合度超過80%時進行傳代。

1.4 不同結腸癌細胞系hsa_circ_103809 檢測

取各傳代后對數期生長結腸癌細胞株及正常結腸上皮NCM460 細胞株，采用TRIzol 法提取各組細胞樣品中總RNA，并設計hsa_circ_103809 引物，進行hsa_circ_103809 表達水平檢測，反應條件：75℃預變性2min，90℃變性5min，72℃延伸0.5min，循環40 次，使用2-ΔΔCT法計算基因相對表達量。實驗獨立重復3 次。

1.5 結腸癌患者樣本中hsa_circ_103809 檢測

取結腸癌腫瘤組織及癌旁組織（距腫瘤邊緣≥5cm）小塊作為研究樣本，體積為0.4cm×0.4cm×0.3cm，取材后迅速投入液氮中，術后轉移至-80℃冰箱中保存。hsa_circ_103809 檢測：取出結腸癌腫瘤組織及癌旁組織，冷研磨后采用TRIzol 法提樣本中總RNA，并檢測樣本中hsa_circ_103809 表達。方法同1.3 中檢測方法。

1.6 研究方法

對患者的臨床資料進行分析，對比腫瘤組織與癌旁組織中hsa_circ_103809 表達差異，分析hsa_circ_103809 表達與臨床病理學特征、復發及生存預后關系進行分析。末次隨訪日期為2022 年6 月31 日。

1.7 統計學方法

采用SPSS 22.0 統計學軟件對數據進行分析處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示，計數資料用例數（百分率）[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同腸癌細胞系hsa_circ_103809 表達

與正常結腸上皮NCM460 細胞相比，HCT116、SW480、SW620 及DLD-1 細胞中has-circ-103809 表達水平均降低，差異有統計學意義（P<0.01）。

2.2 腫瘤組織與癌旁組織hsa_circ_103809 相對表達情況

腫瘤組織與癌旁組織hsa_circ_103809 相對表達分別為（0.67±0.18）和（0.82±0.15）。與癌旁組織相比，腫瘤組織中hsa_circ_103809 相對表達量明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。

2.3 腫瘤組織hsa_circ_103809 表達及臨床病理學分析

hsa_circ_103809 表達與結腸癌患者性別、年齡、病理分期無關（P>0.05），與分化類型、腫瘤類型、癌胚抗原（carcino embryonic antigen，CEA）水平有關，差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

表1 腫瘤組織hsa_circ_103809 的表達及與臨床病理學的關系（±s ）

表1 腫瘤組織hsa_circ_103809 的表達及與臨床病理學的關系（±s ）

2.4 hsa_circ_103809 表達對結腸癌的診斷效應分析

hsa_circ_103809 曲線下面積（area under curve，AUC）為0.736[95%CI:0.661～0.803）]，約登指數為0.375，截斷值為0.726，即hsa_circ_103809 表達≥0.726 為高表達，反之則為低表達，敏感度為65.50%，特異性為70.80%，見圖1。

圖1 腫瘤組織hsa_circ_103809 表達對結腸癌診斷的ROC 曲線

2.5 結腸癌患者術后復發單因素及多因素分析

經隨訪，hsa_circ_103809 高表達復發率為22.58%（7/31），低表達復發率則為63.27%（31/49）。與hsa_circ_103809 高表達患者相比，低表達患者復發率明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）。Cox單因素回歸分析結果顯示：腫瘤分化程度越低、腫瘤類型為黏液腺癌、CEA≥5ng/ml 及hsa_circ_103809低表達是影響結腸癌患者3 年內復發的危險因素（P<0.05）；Cox 多因素回歸分析結果顯示：腫瘤分化程度低及hsa_circ_103809 低表達是結腸癌3 年內復發的獨立危險因素（P<0.05）。

表2 Cox 風險回歸模型分析結腸癌患者術后復發的單因素及多因素分析

2.6 hsa_circ_103809表達與結腸癌患者累積生存時間的關系

對患者術后3 年進行隨訪，結果表明，3 年內共復發37 例，死亡23 例。術后首年內復發20 例，復發率為25%（20/80），死亡11 例，生存率為86.25%（69/80）；次年復發4 例，復發率為30%（24/80），死亡11 例，生存率為72.5%（58/80）；第3 年復發13 例，復發率為46.25%（37/80），死亡1 例，生存率為71.25%（57/80）。采用Kaplan-Meier 生存曲線及Log rank 檢驗對結腸癌患者生存函數進行計算，結果表明，與hsa_circ_103809 高表達患者相比，低表達患者生存時間明顯縮短，差異有統計學意義（P<0.05），見圖2。

圖2 結腸癌組織hsa_circ_103809 表達的生存曲線

3 討論

結腸癌早期癥狀隱匿，且復發率高，生存率低[8]。目前，臨床主要通過免疫組化、基因檢測等多種檢測手段提高結腸癌的診斷率，以達到“早發現、早治療”，提高生存率的目的[9-10]，但仍未尋找到檢測方便，且特異性高的結腸癌腫瘤標志物。circRNA在真核細胞中已發現數千種，其形態以特定的反向剪接機制形成環狀，其中相當一部分已被證明具有一定的生物學功能[11]。近期孫林等[12]通過對3 例結腸癌患者腫瘤組織及癌旁組織樣本進行circRNA 芯片篩查，并采用qPCR 進行驗證，結果表明，共發現114 種circRNA 出現表達差異。Zhen等[13]通過基因芯片對10 例結腸癌患者腫瘤組織進行篩查，最終發現共110 種circRNA 上調，16 種circRNA 下調。此外，也有學者對circRNA 的具體功能進行深入研究，Chen 等[14]通過沉默hsa_circ_101555，觀察發現其下游靶基因miR-597-5p 上調，繼而提高周期蛋白依賴激酶6（cyclin-dependent kinase6，CDK6）表達水平，促進結腸癌細胞增殖、遷移。

既往的研究中顯示，hsa_circ_103809 對肝癌的臨床意義較多[15-17]，但對于結腸癌的研究并不深入。一項基礎研究中顯示，hsa_circ_103809 在結腸腺癌SW480 細胞中呈低表達，p21 表達升高，通過過表達技術證實hsa_circ_103809 具有較好的抑癌性，且具有降低線粒體膜電位及抗氧化應激的作用[18]。為了驗證前人研究，本研究首先對HCT116、SW480、SW620 及DLD-1 結腸癌細胞株中hsa_circ_103809表達進行檢測，結果表明，上述結腸癌細胞株較正常結腸上皮NCM460 細胞hsa_circ_103809 表達明顯降低，與前人研究結果相吻合。為了進一步深入探討hsa_circ_103809 基因在結腸癌腫瘤組織中的表達及臨床意義，本研究對80 例結腸癌腫瘤組織及其癌旁組織hsa_circ_103809 表達情況進行檢測，與癌旁組織相比，腫瘤組織hsa_circ_103809 表達明顯降低，與細胞實驗結果趨勢相同，且hsa_circ_103809 在腫瘤組織中的表達與結腸癌患者性別、年齡、病理分期無關，與腫瘤分化類型、腫瘤類型、CEA 水平有關，說明hsa_circ_103809 可能與性別、年齡因素及結腸癌轉移浸潤能力無關，而與腫瘤惡性程度有關，且有潛力成為與結腸癌臨床病理特征相獨立的臨床檢測指標。

ROC 曲線結果顯示，hsa_circ_103809 表達量在0.726 以下時可能導致結腸癌的發生。為了分析hsa_circ_103809 是否對結腸癌患者預后具有一定的評估價值，筆者對入組患者進行3 年隨訪，記錄患者復發情況及死亡情況，采用Cox 風險回歸模型對復發患者腫瘤化類型、腫瘤類型、CEA 水平及hsa_circ_103809 表達進行單因素及多因素回歸分析，結果表明，腫瘤分化程度低、黏液腺癌、CEA≥5ng/ml 及hsa_circ_103809 低表達均是結腸癌復發的危險因素，其中腫瘤分化程度低及hsa_circ_103809 低表達均是結腸癌患者復發的獨立危險因素。對隨訪期內死亡的患者進行Kaplan-Meier 生存曲線及Log rank檢驗，hsa_circ_103809 低表達患者生存周期明顯短于高表達患者，說明腫瘤組織hsa_circ_103809 對患者預后具有一定的評估價值，其機制可能與hsa_circ_103809 調控miR-532-3p/FOXO4 軸，促進腫瘤細胞增殖有關[6]。

綜上所述，hsa_circ_103809 低表達可能對結腸癌的診斷具有一定的參考價值，且是患者預后復發的獨立危險因素，對患者術后3 年內死亡具有一定的參考價值。