超高壓技術在蛋白質改性和活性肽制備中的應用研究進展

陳夢婷，鄭昌亮，汪 蘭，孫智達，謝筆鈞，石 柳，丁安子，熊光權，喬 宇，李 新，吳文錦,*

（1.湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所，農業農村部農產品冷鏈物流技術重點實驗室，湖北 武漢 430064；2.華中農業大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070）

作為新型功能性食品的潛在來源，生物活性肽等生物活性化合物引起了眾多研究者的興趣。生物活性肽是一種對身體功能有積極影響并可能影響健康的特定氨基酸片段，是由幾個至十幾個氨基酸通過共價鍵（也稱為酰胺鍵或肽鍵）連接而成的有機物質，雖然不同分子片段的復雜程度有所差異，但生物活性肽的分子質量都在6 000 Da以下[1]。生物活性肽可以是天然來源的，也可以是蛋白質片段中的特定氨基酸序列，其在親本蛋白質的序列中是無活性的，但是通過不同技術釋放后可以呈現出不同的活性。生物活性肽和蛋白質在生物體的代謝功能中能展現出優異的類激素或藥物活性，從而在人體健康方面發揮積極作用。根據生物活性的差異生物活性肽可以分為抗高血壓肽、抗氧化肽、抗血栓肽、降膽固醇肽、降血壓肽、抗菌肽、免疫調節肽、細胞調節肽、礦物質結合肽等[2]。

從植物、動物等原料中獲得蛋白質是蛋白質工程的難點之一，加上蛋白質分子大多擁有復雜的三維結構[3]，這使得蛋白質在向生物活性肽的轉化過程中存在阻礙。為了解決這些難點，眾多研究者正致力于優化樣品制備的條件，如優化蛋白質酶消化的溫度、時間、pH值；聯合使用多種蛋白酶消化、添加有機溶劑等[4]。除此之外，研究者越來越關注使用新技術，如超高壓、超聲波、脈沖電場、微波輔助萃取和亞臨界水水解等[5]以輔助制備生物活性肽。

超高壓處理也被稱為高壓處理或高壓靜壓處理，是一種非熱加工技術[6]。近年來，超高壓技術在食品工業中得到更廣泛的應用（圖1），研究證明，將超高壓技術應用于蛋白質改性和生物活性肽制備，能有效解決蛋白質提取、活性肽制備及應用上的困難。本文重點綜述超高壓技術在肽和蛋白質的提取、消化、生成等方面的應用，還概述生物活性肽的類型、來源和生物活性，以期為深入應用超高壓技術輔助蛋白質改性和活性肽制備提供理論依據。

圖1 超高壓技術在食品加工領域的應用[5]Fig.1 Application of ultra-high pressure in food processing[5]

1 生物活性肽

食品中存在的大量營養素中，肽和蛋白質扮演著重要的角色，它們不僅可以作為能量來源和氨基酸來源，一些肽還表現出獨特的生物活性。

生物活性肽一般以植物、動物或海洋生物為原料，再通過一定的技術制備獲得。植物原料如谷物（小麥、大麥、大米、黑麥、燕麥、小米、高粱和玉米）、大豆、蘑菇、南瓜和莧菜等都是優質的生物活性肽來源。其中，小麥和大麥的谷物蛋白極具多樣性且具有最豐富的潛在生物活性[7]。牛乳、雞蛋和肉類等動物來源的原料也是制備活性肽的優質來源[8]，除此之外動物的副產品也常被作為制備活性肽的原料，牛乳奶酪和乳制品是生物活性肽的主要來源[9]。近年來，海洋生物資源成為了藥物研究和保健品應用中新型活性成分的重要來源。一方面，研究證實，海水魚蛋白水解物及其肽具有優越的生物活性；另一方面，由海洋生物（被囊動物、海綿、軟珊瑚、海兔、裸鰓類動物、苔蘚蟲、海蛞蝓、被囊類動物、海綿、軟體動物）制備的活性肽具有一系列生物活性（如酶抑制、免疫調節、抗菌、抗氧化、抗血栓、降膽固醇和抗高血壓等）[10]。多肽及其用途的變革如圖2所示。

圖2 多肽及其用途的變革[11]Fig.2 Changes in peptides and their purposes[11]

生物活性肽的制備方法主要有化學提取法、微生物發酵法、生物合成法和酶解法[11]，4 種提取方法的優缺點如圖3所示。

圖3 生物活性肽制備方法的優缺點[11]Fig.3 Advantages and disadvantages of bioactive peptide preparation methods[11]

2 超高壓技術的作用原理

食品原料打包后置于盛滿水的壓力作用腔內，利用水作為傳壓介質，樣品在高壓作用腔內受到100～1 000 MPa壓力[12]。如圖4所示，食品原料在超高壓技術處理工程中，某些性質發生改變主要歸因于2 個機制——帕斯卡原理和勒夏特列原理[13]。帕斯卡原理指相同的壓力會立即且均等地施加給食品物料，與傳統的熱處理工藝相比，超高壓技術能保證食品的質地、形狀、色澤，還能保證食品的風味和營養特性；勒夏特列原理指在超高壓處理過程中，食品物料會隨著壓力的方向發生移動，其體積減小，食品體系的平衡和體積變化速率、分子構象都發生一定程度的改變。

圖4 超高壓技術的作用原理Fig.4 Working principle of ultra-high pressure

3 超高壓技術的應用

超高壓處理是一個瞬時過程，通過水這個壓力傳遞介質，影響蛋白質的二、三、四級結構，快速破壞蛋白質的共價鍵，蛋白質肽鏈折疊改變，分子結構發生變化，從而達到不同的應用目的[14]。不同壓力對蛋白質結構有不同程度的影響，研究表明，在不超過150 MPa的壓力條件下使低聚蛋白質結構解離，分子體積減小，有時蛋白質體積變化很大；當壓力超過150 MPa時，會促使蛋白質伸展，并能使解離的低聚體亞基再發生聚合[15]。近年來，眾多學者致力于研究超高壓等新技術制備活性肽及其下游產品（合成肽）。超高壓技術在蛋白質和活性肽領域的應用如圖5所示。值得注意的是，眾多研究表明，較長處理時間的過高壓力處理會產生高溫和高壓條件，使蛋白質或肽的一級序列發生改變，其狀態將不利于后續工作。因此，后期研究應重點關注超高壓處理條件的優化。

圖5 超高壓技術在蛋白質改性、消化和活性肽分離提取領域的應用Fig.5 Application of ultra-high pressure in modification and digestion of proteins as well as separation and extraction of peptides

3.1 超高壓技術在蛋白質改性中的應用

蛋白質改性是蛋白質工程中重要的一個環節，超高壓可以解離非共價鍵、離子鍵、疏水鍵和氫鍵，從而改變蛋白質的結構，壓力的變化會引起蛋白質的局部或整體變化，并最終通過改變穩定天然蛋白質折疊構象的相互作用而導致蛋白質發生變性（圖6），從而達到蛋白質改性的目的[16]。超高壓處理對蛋白質改性作用主要體現在對蛋白質結構、水合性質（溶解性、持水性）、表面性質（乳化性、起泡性）、流體動力學性質（凝膠性）的影響。

圖6 壓力誘導蛋白質變性的機理示意圖Fig.6 Schematic diagram of the mechanism of pressure-induced protein denaturation

3.1.1 蛋白質結構

超高壓主要會對蛋白質的二、三、四級結構產生不同程度的影響，對蛋白質的一級結構影響不顯著[17]。蛋白質的一級結構是指構成蛋白質肽鏈的氨基酸殘基的線形排列順序，有時也稱為殘基的序列。氨基酸序列決定了蛋白質的一級結構，由于酰胺鍵是共價鍵，因此壓力對其影響小。蛋白質的二級結構是指多肽鏈上主鏈骨架中各個肽段所形成的規則或無規則構象，包括α-螺旋、β-折疊、β-轉角、無規卷曲，其間靠羰基和氨基之間形成的氫鍵來穩定，氫鍵是非共價鍵，壓力很容易對其產生影響。鞏雪等[18]研究100、200、300 MPa壓力對扇貝肌結構影響，結果表明，與常壓處理組相比，隨著壓力的增加，肌蛋白的二級結構發生了比較明顯的變化：α-螺旋結構含量下降，β-折疊、β-轉角和無規卷曲結構的含量逐漸增加；林素麗[19]在100～500 MPa的壓力下處理米糠蛋白10 min，圓二色光譜分析結果表明，處理后的米糠蛋白中α-螺旋結構含量增多。二者研究結果的差異可能緣于蛋白質來源不同，可以明確的是超高壓對蛋白質的二級結構有明顯的影響，而壓力對不同來源蛋白質二級結構的影響存在差異。蛋白質的三級結構是指二級結構的蛋白質其線性多肽鏈進一步折疊成為緊密結構時的三維空間排列，當具有三級結構的蛋白質亞基之間通過非共價鍵締合后就形成蛋白質的四級結構。內源熒光強度、表面疏水性、活性巰基含量能反映蛋白質三級結構的變化，研究表明，隨著超高壓處理壓力的增大，表面疏水性、活性巰基含量升高，相對內源熒光強度也發生變化，這表明蛋白質的三級結構在壓力作用下發生改變。蛋白質的四級結構主要通過疏水相互作用來穩定，疏水相互作用對壓力十分敏感，100～200 MPa的壓力能分解蛋白質低聚物，同時使蛋白質的體積變小，即超高壓處理會導致蛋白質解聚，并破壞連接的多肽鏈之間的疏水鍵，導致多肽鏈分離。

3.1.2 水合性質

蛋白質的水合性質指的是蛋白質分子中極性基團或肽鍵與水分子相互結合的性質，其通過蛋白質的肽鍵（偶極-偶極或氫鍵）或氨基酸側鏈（離子的極性甚至非極性基團）同水分子之間的相互作用來實現[20]。研究證明，超高壓處理會破壞蛋白質中非共價鍵的平衡并暴露二硫鍵、疏水基團和其他官能團，這些官能團可以拉伸蛋白質分子并影響蛋白質的水合性質。隨處理壓力的增加，一般而言，當超高壓的作用壓力在0～600 MPa時，隨處理壓力的增加，蛋白質溶解性呈現先下降后上升的趨勢[21]，但蛋白種類的差異和蛋白所處的環境會影響其溶解性，黃薇[22]研究發現，利用200、400、600 MPa壓力處理小麥蛋白時，隨著作用壓力的上升，面筋蛋白和麥醇溶蛋白的溶解性下降，但麥谷蛋白的溶解性則升高；戴彩霞等[23]研究結果表明，200、400、600 MPa的壓力處理菜籽蛋白時，pH 9下菜籽蛋白的溶解性（71.23%）最好。Cao Baiying等[24]利用高靜水壓處理從松子中提取的蛋白質，結果表明當壓力在400 MPa時，球蛋白的持水能力從2.33 g/g增加到3.43 g/g。值得注意的是，蛋白質分子結構和組成的差異會使壓力對蛋白質分子的持水能力的影響存在差異，黃薇[22]研究發現，與未處理的樣品相比，200 MPa壓力處理面筋蛋白的持水性下降，但是分別使用400、600 MPa壓力處理后，面筋蛋白的持水性無顯著性變化；麥醇溶蛋白的持水性隨壓力的增加而上升，麥谷蛋白經200、400 MPa高壓處理后持水性下降，但當作用壓力提升到600 MPa時，麥谷蛋白的持水性增加。

3.1.3 表面性質

蛋白質是兩親分子，它能自發地遷移到空氣-水界面或油-水界面，這便是蛋白質的表面性質，乳化性和起泡性是典型的表面性質[25]。蛋白質乳化作用最重要的特征是其能夠向油-水界面擴散和在界面的吸附能力。起泡性通常是氣泡在連續的液相或含可溶性表面活性劑的半固相中形成的分散體系。周一鳴等[26]研究結果表明：與未處理的樣品相比，當利用500 MPa壓力作用于蕎麥蛋白30 min時，乳化性（67.3 m2/g）、起泡性（91.5%）分別提高了33.0%、16.1%。吳溪[27]發現當壓力作用于大豆分離蛋白時，大豆分離蛋白發生聚集，使蛋白的黏度和表面張力提升，大豆分離蛋白的起泡性得以提升，另一方面，壓力使疏水基團暴露，蛋白質分子的表面柔順性增強，分子間的聚集速率加快，蛋白的起泡能力也增強；乳化能力的提高則歸因于超高壓破壞蛋白質分子內部疏水相互作用，使得蛋白質的空間結構改變。有研究發現超高壓處理時間對蛋白質的表面性質影響不顯著，但蛋白質所處的溶液pH值會明顯影響其表面性質[28]，在堿性環境中進行壓力處理能增強蛋白質的起泡性，在酸性環境中壓力處理能增強泡沫穩定性。

3.1.4 流體動力學性質

流體動力學性質包括彈性、黏度、黏附性、內聚性、咀嚼性、凝膠性等，這些性質通常與蛋白質的大小、形狀和柔順性有關。此處著重介紹超高壓對蛋白質凝膠特性的影響。變性的蛋白質分子聚集并形成有序的蛋白質網絡的過程成為凝膠作用，凝膠是一種介于固體和液體之間的中間相，實質上是非穩態流體的一種稀釋體系。凝膠通常與疏水相互作用的吸引和靜電排斥作用之間的平衡有關，這兩種力決定了蛋白質-蛋白質相互作用和蛋白質-溶劑相互作用[29]。王炳智[30]研究100～400 MPa壓力對小麥面筋蛋白的凝膠特性的影響，實驗結果表明利用300 MPa高壓處理小麥面筋蛋白時，凝膠強度達到最大值（（93.80±1.93）g），這是因為超高壓處理使蛋白質分子結構展開，分子間疏水相互作用增強，形成三維網絡結構，凝膠強度增加；當作用壓力增加至400 MPa時，蛋白質分子發生部分聚集，蛋白質分子間的相互作用降低，凝膠強度下降。此外，超高壓處理還可以暴露蛋白質分子內的巰基，從而促進二硫鍵的形成，疏水基團和二硫鍵的存在可以加強分子間網絡結構，促進不可逆凝膠的形成[31]。Lu Wangwei等[32]在0～400 MPa 壓力處理15 min的條件下制備羅非魚魚糜凝膠，發現超高壓處理的魚糜凝膠致密而柔韌，拉曼光譜實驗結果證實了二硫鍵在羅非魚魚糜凝膠的形成中起重要作用。

3.2 超高壓技術在蛋白質消化中的應用

一般來說，蛋白質消化是使用蛋白水解酶或酸水解蛋白質，食品中常見的水解蛋白酶有胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶[33]，蛋白質消化是利用蛋白質制備生物活性肽的重要步驟。但是，利用蛋白酶或酸水解蛋白質前需要消耗較長的時間來對樣品進行前處理，除此之外，由于蛋白質的基質異質性，消化過程很難重復統一，因此蛋白質的消化是多肽制備過程中的主要瓶頸之一。在蛋白質消化前對其進行處理能提高消化效率，超高壓是常見前處理方式之一，此外亞臨界水水解、微波、超聲波也是現階段研究常用的新興前處理方式[34]。超高壓對蛋白質的消化起促進作用歸因于：壓力使蛋白質分子間和分子內二硫鍵和疏水鍵的重排；壓力誘導裂解位點暴露，蛋白質去折疊的程度增加，天然蛋白質有著復雜的空間結構，經超高壓處理后，酶與蛋白質分子接觸位點數量增加，蛋白質消化率得以提高。Franck等[34]使用不同超高壓（100、300 MPa）分別預處理亞麻籽蛋白5、10 min后，利用胰蛋白酶對亞麻籽蛋白進行水解，結果表明：300 MPa壓力下處理會導致亞麻籽蛋白結構不穩定程度提高，超高壓處理均能增加500～1 500 Da肽的相對豐度，在300 MPa下處理5 min和10 min，亞麻籽蛋白水解物的抗氧化活性分別提高了39%和55%。然而，也有研究表明，當施加的壓力高達400～500 MPa時，蛋白質會因聚集而導致后續消化得到的活性肽含量降低。Chao Dongfang等[35]研究發現利用200 MPa預處理豌豆分離蛋白時，蛋白質去折疊層度和疏水基團的暴露量增多，對血管緊張素轉化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制肽的釋放有促進作用，但是當壓力提升到400、600 MPa時，高壓預處理對ACE抑制肽的釋放產生了相反的效果。此外，超高壓處理后蛋白質消化性的增強也歸因于壓力作用下蛋白質對酶或對底物-酶相互作用效果增強，相互接觸更緊密[36]。

3.3 超高壓技術在肽的分離/提取中的應用

目前超高壓技術已被應用于不同來源蛋白質生物活性肽的分離提?。ū?），這些蛋白質基質包括亞麻籽蛋白[34]、卵清蛋白[37]、扁豆蛋白[6]、大豆分離蛋白[38]、甘薯蛋白[39-40]、蘑菇腳蛋白[41]、β-乳球蛋白[42]、黑豆蛋白[43]、酪蛋白[44]、羅非魚蛋白[45]等。Boukil等[46]利用400～600 MPa的壓力處理β-乳球蛋白，處理后β-乳球蛋白的構象發生變化，疏水基團暴露，游離巰基的反應活性增加，胰蛋白酶水解提高了生物活性肽的產量；Al-Ruwaih等[47]發現高壓處理（300～600 MPa、15 min）菜豆蛋白有助于其被堿性蛋白酶水解，水解產物的抗氧化活性顯著提高。因此，超高壓處理對肽的分離、提取有積極促進作用。

表1 超高壓處理在生物活性肽分離提取中的應用Table 1 Applications of ultra-high pressure in separation and extraction of bioactive peptides

3.4 超高壓技術在抗氧化肽制備中的應用

過量的自由基會產生氧化應激效應，這可能會降低高脂食物的品質，縮短食物的保質期，同時氧化損傷可能引起多種慢性疾病，如糖尿病、阿爾茨海默病、關節炎、心臟病和癌癥等?？寡趸牡臐撛谧饔脵C制主要包括清除氧自由基、螯合金屬離子、抑制脂質過氧化反應、激活機體的抗氧化防御系統[11]?？寡趸牡膩碓窗椬於筟48]、乳清蛋白[49]、小麥面筋蛋白[50]、亞麻籽蛋白[34]、扁豆蛋白[6]、甘薯蛋白[39]、β-乳球蛋白[42]、酪蛋白[44]等。一般來說，這些多肽可以通過原料蛋白酶解制備，常用酶的來源包括微生物源（堿性蛋白酶、中性蛋白酶和風味酶）、動物源（胃蛋白酶和胰蛋白酶）和植物源（菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶）。龐佳坤[49]使用超高壓預處理來提高乳清蛋白蛋白的分解，以產生抗氧化肽，400 MPa超高壓處理處理30 min對乳清蛋白二級、三級結構的影響最顯著，得到抗氧化肽的2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)陽離子自由基清除率達到65.18%。盛小波[51]研究了超高壓處理對乳清蛋白水解抗氧化活性的影響，結果表明300 MPa超高壓處理30 min時，乳清蛋白的水解度達30.33%，所得乳清蛋白肽中分子質量低于3 kDa的組分III抗氧化活性較強。李艷紅[48]研究發現超高壓處理壓力顯著影響抗氧化肽的釋放，100～200 MPa壓力處理對鷹嘴豆蛋白水解程度無顯著影響，當壓力上升到300 MPa時可提高酶解速率，但當壓力增加至400～600 MPa時酶解速率降低。以上研究表明，一定的超高壓處理壓力和作用時間對抗氧化肽的制備具有積極影響，但具體的制備工藝需要優化。

4 結 語

蛋白質和生物活性多肽具有豐富的功能性質以及與人體健康相關的多種生物活性，已受到廣泛的關注，然而，生物活性多肽的商業化開發仍然具有挑戰性。最近的研究表明，一方面，超高壓可以對蛋白質進行改性，以改善蛋白質的結構和功能性質；另一方面，超高壓可以促進生物活性多肽的產生，超高壓處理后的蛋白質能夠更高效地轉化成生物活性多肽。綜上所述，超高壓技術是一種蛋白質改性和制備生物活性多肽的可行技術。未來還需要更多的研究，以促進超高壓技術在蛋白質和多肽領域的應用。