熒光納米探針在農藥殘留檢測中的研究進展

李紅霞，鄒睿琦，蘇長順，呂 婷，羅 林，孫春燕，徐振林，閆 旭*

（1.吉林大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130062；2.吉林大學電子科學與工程學院，吉林 長春 130012；3.廣東省食品質量安全重點實驗室，嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室，華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642）

在現代農業生產過程中，農藥在保障農作物產量方面發揮了重要作用，但由于其過度使用和違規濫用所引發的食品安全問題也愈發嚴峻，對人類健康造成了嚴重威脅[1-2]。因此，如何加強農藥殘留的高效檢測，是保證食品質量安全控制中至關重要的一環。目前，農藥殘留檢測的國標方法包括色譜法[3-4]和色譜-質譜聯用法[5-6]，上述方法具有高靈敏、定量準確和高分辨率等優勢，但也存在一定的局限性，如前處理復雜、成本高、需要大型精密儀器，限制了現場實際應用。因此，開發高效、便捷、靈敏、快速的農藥殘留傳感新策略成為迫切需求，對于保障食品安全和人類健康具有重要意義。近年來，農藥快速檢測技術如電化學生物傳感器[7]、光學生物傳感器[8-10]、表面增強拉曼光譜技術[11]、聚合酶鏈式反應法[12]、免疫傳感技術[13-14]等研究得到越來越多的關注。這些方法具有儀器可小型化、檢測成本低、準確性好、檢測速度快等優點，是對傳統方法的有效補充，有望實現現場即時檢測。

免疫傳感技術具有操作簡單、特異性強、靈敏度高等突出優點，作為一種農藥殘留快檢技術受到高度重視[15-16]。農藥分子不具有免疫原性，因此常構筑競爭型免疫分析模式檢測農藥。傳統的競爭型免疫傳感體系利用酶標抗體或酶標抗原作為識別元件，檢測靈敏度往往受到酶標記量和酶活力的制約。將熒光納米探針的信號放大策略巧妙地融合到免疫分析方法中，利用納米材料負載信號指示劑（如生物分子、金屬納米團簇和熒光染料），借助生化反應，能夠突破生物酶的限制，實現多重信號放大，是提升檢測靈敏度的有效策略。

本文主要針對近5 年免疫探針（即信號放大部分）在農藥殘留檢測中的發展現狀和應用研究進展進行綜述，重點關注酶基熒光免疫探針、熒光納米材料免疫探針、納米酶基免疫探針和納米支架型免疫探針的原理、特點及應用現狀等，并展望熒光免疫分析技術在農藥檢測中的應用前景，以期為農藥殘留的靈敏、快速檢測提供一定的理論支持和技術方法。

1 免疫傳感器概述

1.1 免疫傳感器的組成及基本原理

免疫傳感器基于抗原-抗體之間的特異性識別功能而構建，它由敏感識別元件（感受抗原-抗體的特異性反應）、換能器（感受由特異性結合引起的光學或電學等參數變化）和檢測元件（記錄光電信號用于檢測、分析）3 個部分組成。酶聯免疫傳感器通過固定化抗體（或抗原）與其相對應的抗原（或抗體）相互結合發生特異性吸附反應，形成免疫復合物。檢測過程中產生的反應信息被特定的換能器轉換成定量響應信號，借助信號放大裝置將識別信號進行放大處理即可檢測出待測物質的種類和濃度（圖1）。依據信號輸出方式可分為熒光免疫分析[17-18]、比色免疫分析[19]和電化學免疫分析[20]等。

圖1 免疫傳感器檢測原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of the principle of immunosensors

1.2 免疫傳感器的優點

在食物和環境等實際樣品中通常含有多種化學污染物，并可能含有一整類結構相似的化合物，給靶標物的檢測帶來巨大的干擾。免疫分析方法檢測選擇性好，可高特異性地識別單一分析物，得到更加準確的信息。此外，免疫傳感器還可提升檢測靈敏度、簡化實驗的分析過程、縮短實驗的分析時間、實現設備小型化和測量過程自動化等優點，特別適用于現場監測和大批量樣品篩查。

1.3 提高免疫傳感器靈敏度的方法

近年來，關于如何提升免疫分析技術的靈敏度、開發出更優異的農藥檢測技術一直是免疫分析領域的研究熱點，增強抗體的識別功能或改善方法的信號轉換功能是兩個行之有效的方法。針對識別抗體，學者們開發了一系列高識別功能的抗體，如多克隆抗體、單克隆抗體和納米抗體等[21]，以提升對靶標農藥的識別能力，增強檢測靈敏度。針對信號轉換能力，納米材料顯示出傳統材料所沒有的獨特性質，如光吸收、熒光發射和光色散特性等，能夠將識別信息轉換成可檢測的光學信號。特別是熒光納米材料（如半導體量子點、碳量子點、上轉換納米材料等），不僅展現出優異的信號轉換能力，而且合成簡單、易于修飾且生物相容性好。將熒光納米材料應用于構建免疫傳感探針，已經成為提升免疫分析技術檢測靈敏度的主流方法之一。

1.4 應用于農藥殘留檢測的免疫傳感器

隨著高靈敏度農藥殘留檢測技術的迫切需求和免疫傳感器研究的逐步深入，越來越多的學者將免疫傳感器應用于農藥殘留檢測（表1）。

表1 免疫傳感器在農藥殘留檢測中的應用Table 1 Applications of immunosensors in the detection of pesticide residues

2 熒光免疫探針

為了滿足農藥殘留快速、精確檢測需求，熒光材料作為光學免疫探針以多種方式應用于構筑免疫傳感器[28-29]。目前，常見的傳感探針主要包括酶基熒光免疫探針、熒光納米材料免疫探針、納米酶基免疫探針、納米支架型免疫探針等。本節重點分類與討論免疫探針在熒光免疫傳感器中的應用，并針對其在農藥檢測中的應用效果進行對比分析。

2.1 酶基熒光免疫探針

傳統的熒光酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法以辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）分子作為信號放大元件，在檢測復雜食品基質中的低豐度分析物時靈敏度較低，其應用受到一定程度的限制。為了解決這一問題，通過標記酶觸發熒光探針的水解、聚合或氧化等化學反應，引起探針的原始結構改變，進而實現對待測信號的放大作用，使其可以通過熒光增強或減弱的方式定量檢測目標抗原（圖2）。該方法融合了酶促反應的高效性和熒光探針的敏感性，協同提升了農藥檢測的靈敏度。

圖2 基于酶基熒光免疫探針的檢測原理示意圖Fig.2 Schematic diagram of the principle of enzyme-based fluorescent immunoprobes

近年來，學者設計了多種酶基熒光免疫傳感器，如Chen Zijian等[30]在檢測西維因農藥的過程中引入了ALP催化體系，結合MnO2對熒光復合探針的猝滅作用和ALP催化產物抗壞血酸（ascorbic acid，AA）對MnO2的分解作用，通過測定熒光強度實現對西維因的定量檢測，檢出限低至0.01 ng/mL，相較于傳統的ELISA靈敏度提升了約100 倍。本課題組聯合利用藍光發射的二氧化硅納米點（silica nanoparticles，SiNPs）和黃光發射的染料構建了一種比率熒光免疫分析方法檢測紅酒中的氨基甲酸乙酯，檢測靈敏度比傳統ELISA提高約33 倍，而且檢測結果與標準液相色譜-質譜聯用技術進行對比，具有良好的準確性[31]。本課題組的另一項研究報道了一種基于金納米團簇/羥基氧化鈷（AuNCs@CoOOH）熒光納米復合材料的免疫分析方法，基于抗原-抗體的特異識別作用，引入ALP催化反應的產物AA來觸發CoOOH納米片的分解，調控體系熒光強度變化，從而根據熒光強度的變化實現吡蟲啉的高靈敏檢測，半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為1.3 ng/mL，比常規ELISA（86.4 ng/mL）的靈敏度提升了60 倍[32]。Chen He等[33]利用上轉換納米粒子（upconversion nanoparticles，UCNPs）作為能量供體和單克隆抗體（mAb）標記的金納米花（gold nanoflowers，AuNFs）作為能量受體組建供受體對，建立了一種新型免疫分析方法。應用UCNPs近紅外光激發、信噪比高的優勢，有效屏蔽基質背景干擾，成功應用于土壤、玉米、水稻和黃瓜等樣品中苯噻菌酯的檢測，為小分子的納米監測提供了一個新的平臺。Zhang Xiuyuan等[34]利用金納米顆粒（gold nanoparticles，AuNPs）和生物條形碼擴增策略，將大量的ssDNA和單克隆抗體集成于AuNPs表面構筑復合材料，應用核糖核酸酶H剪切ssDNA進行信號二級放大，通過熒光強度變化實現食品中三唑磷殘留的定量檢測。

基于酶基免疫探針的熒光免疫傳感器相較于傳統ELISA法能夠有效地放大識別信號、降低檢出限，進而達到靈敏快速檢測目標農藥的目的。但該類方法因反應體系中酶活力易受檢測環境的影響，仍保留較大的探索空間。

2.2 熒光納米材料免疫探針

納米材料和信號增強策略已被廣泛應用于免疫檢測方法的建立[35-36]，利用納米材料的熒光特性，構筑熒光納米材料免疫探針，將識別信號直接轉化成熒光信號，從而進行信號放大輸出，提升檢測靈敏度（圖3）。目前常使用的熒光免疫探針主要包括碳量子點、半導體量子點、金屬納團簇等。

圖3 基于熒光納米材料免疫探針的檢測原理示意圖Fig.3 Schematic diagram of the principle of nanomaterial-based fluorescent immunoprobes

Wang Shuangjie等[37]制備了量子產率高、光穩定性好的半導體量子點作為免疫探針，建立了一種快速、靈敏、便攜的熒光側向免疫層析試紙條（lateral flow immunochromatographic strip，LFICS），該方法應用寬譜特異性抗體實現了茶葉樣品中3 種煙堿類農藥（吡蟲啉、氯噻啉和噻蟲胺）的檢測，其IC50分別為0.104、0.170 ng/mL和0.330 ng/mL。Lan Meijing等[38]開發了一種集成、快速、敏感的多重比色免疫芯片，該芯片由7 個包覆在硝化纖維素膜上的抗原作為捕獲探針，以納米金標記的二抗作為示蹤劑，通過優化納米金增強劑實現了視覺信號的放大，能夠同時檢測7 種農藥（三唑磷、甲基對硫磷、甲氰菊酯、克百威、噻蟲啉、百菌清和多菌靈），為農藥多殘留檢測提供了一種通用性方法。Guo Yirong等[39]構建了一種基于UCNPs和氧化石墨烯熒光共振能量轉移作用的免疫分析方法，將抗原修飾到氧化石墨烯表面，通過與農藥競爭連接抗體修飾的UCNPs，可在短時間內實現食品和環境樣品中吡蟲啉的檢測。Tang Xiaoqian等[40]以Eu（III）標記的抗體作為熒光免疫探針，開發了快速、定量的側流層析免疫平臺，并成功應用于谷物食品中西維因和克百威的檢測。Zhou Lina等[41]以高亮度的聚合物點為熒光探針，通過增強量子發光效率提升檢測信噪比，進而改善檢測靈敏度，該方法能夠有效消除過量探針的熒光背景干擾，為亞胺硫磷殘留檢測提供一種可靠、靈敏的方法。Sheng Wei等[42]以包被抗原修飾的聚苯乙烯磁性微球為捕獲探針，以抗體修飾的UCNPs為信號探針，建立了一種高靈敏度的熒光免疫檢測方法。融合磁性分離和UCNPs的光學本征特性，可有效消除復雜環境基質干擾，成功實現了谷物、甘蔗汁和水樣中阿特拉津除草劑的特異檢測。

以熒光納米材料免疫探針為基礎構建的免疫傳感策略在農藥殘留檢測中應用廣泛，利用熒光納米材料的本征熒光特性，通過肉眼對顏色分辨即可實現靶標農藥的定性分析，測定熒光信號強度達到精準定量檢測的目的。但是，上述小尺寸的發光材料在固態下易發生熒光猝滅現象，即聚集熒光猝滅作用，而一般摻雜方法制成的材料又容易出現聚集結晶現象，影響檢測性能。此外，熒光納米材料通過共價方式與抗體/抗原偶聯，合成過程易導致熒光強度下降。如何提升熒光納米材料的穩定性仍是熒光免疫探針研究的重要方向。

2.3 納米酶基免疫探針

隨著無機納米結構在生物傳感、成像、治療和環境保護等領域的應用日益廣泛，學者們致力于找尋生物酶的替代物，開發具有高生物活性的納米酶，以提升檢測穩定性[43-45]。納米酶是一類具有類似天然酶催化活性的納米材料，與天然酶相比，具有穩定性好、易于貯存和易于大批量生產等獨特優勢[46-49]。目前常用的納米酶模擬催化活性可達到或接近于天然酶活力。其中，催化效率作為酶促反應的關鍵參數，在很大程度上決定了納米酶在許多應用中的獨特性能。因此，利用無機納米材料合成的納米酶作為免疫傳感器中的熒光免疫探針能夠大大提升檢測穩定性和改善酶催化反應活性，增強反應信號強度，從而達到增強檢測效果的目的，為熒光免疫傳感方法提供了新思路。

Chen Ge等[50]合成了一種具有模擬過氧化物酶活力的Au@Pt復合納米材料作為免疫探針，可直接催化Amplexred探針生成熒光試鹵靈，并利用該熒光探針構建熒光免疫傳感器，實現了農產品中對硫磷、三唑磷和毒死蜱的微量殘留檢測。Zhao Yuting等[51]利用鉑鈀（PtPd）納米顆粒開發了一種同時檢測丁酰膽堿酯酶（butyrylcholinesterase，BChE）和對氧磷的側流層析試紙條，實現了農藥中毒評估，該方法在0.05～6.40 nmol/L和0.1～6.4 nmol/L范圍內對BChE總量和活性BChE有良好的線性響應。在應用納米酶基免疫探針的基礎上，Cheng Nan等[52]構建了一種基于智能手機的側向流動免疫層析裝置，用于乙草胺和甲氰菊酯殘留檢測，在該方法中使用了傳統的3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）和H2O2反應體系，以Pt-Ni(OH)2納米片作為過氧化物酶，利用其具有高類酶活力和低遷移速度的優點作為增強信號標記，設計了雙向側流層析試紙條，消除兩個靶點之間的交叉反應，利用智能手機開發了具有數據分析通用性優勢的便攜式讀出裝置，成功實現了對乙草胺和甲氰菊酯的同時檢測，檢出限分別為0.63 ng/mL和0.24 ng/mL。

納米酶能夠在廣泛的溫度和pH值范圍內具有催化活性和穩定性，制造成本低，并且能夠模擬一系列生物酶的活性[53]，易于化學修飾和連接生物識別分子，在傳感器系統中逐步取代天然酶驅動重要的催化反應，而且所構建傳感器的整體穩定性高，特別是在溫度等環境參數無法控制的情況下，具有廣闊的應用前景。

2.4 納米支架型免疫探針

伴隨著一些具有優良架構特性納米材料的出現，研究人員通過靜電力和自組裝技術構建熒光免疫探針，利用納米支架的活性位點多、空間利用率高、表面積和空腔面積大等特性，負載更多的識別單元和信號放大單元，構建了顯著提升靈敏度的熒光免疫傳感器（圖4），為食品中農藥殘留檢測提供了新思路。

圖4 基于納米支架型免疫探針的檢測原理示意圖Fig.4 Schematic diagram of the principle of nano-scaffold type immunoprobes

Zhang Chan等[54]利用AuNPs作為材料支架承載熒光標記寡核苷酸和抗體進行信號放大，建立了一種可針對多分析物進行高靈敏檢測的熒光免疫分析方法，成功檢測了水稻、小麥、黃瓜、卷心菜和蘋果中3 種有機磷農藥殘留（三唑磷、對硫磷和毒死蜱），3 種農藥的線性范圍分別為0.01～20.00、0.05～50.00 ng/mL和0.5～1 000.0 ng/mL，檢出限分別為0.007、0.009 ng/mL和0.087 ng/mL。Pan Yi等[55]通過在AuNPs表面搭載大量的信號探針（納米簇）和識別基元（抗體），構建了雙模型比色熒光免疫試劑，熒光信號的放大作用顯著提高了檢測的靈敏度，三氯殺螨醇的檢出限為0.62 ng/mL，在1.36～19.92 ng/mL范圍內呈良好的線性關系。Zha Yonghong等[56]同樣將熒光信號分子和識別抗體融合，提出了一種雙功能化AuNPs探針檢測方法，AuNPs的大比表面積能夠攜帶更多信號分子（FAM-dsDNA）和IgG識別單抗，增加信號強度和識別功能，顯著提升檢測靈敏度。該方法成功應用于玉米樣品中微量除草劑（乙草胺、異丙甲草胺、異丙草胺）的檢測，3 種除草劑及其混合物的檢出限分別為0.03、0.10、0.14 ng/mL和0.08 ng/mL。本課題組前期將信號放大元件（生物酶）和識別單元（農藥抗體）共組裝制備了多功能蛋白質體囊泡結構，將大量酶分子裝載在蛋白體上，增強了酶的穩定性并保持了抗體的識別能力[57]。更重要的是，應用蛋白質體首次構建了一種靈敏度顯著提高的免疫分析策略，該方法的吡蟲啉檢測靈敏度比傳統的ELISA方法提升了150 倍。Ji Hanxu等[58]利用介孔硅納米微球（mesoporous silica nanoparticles，MSN）開發了一種操作簡單、靈敏度高、重現性好的酶-抗體偶聯法。介孔硅材料具有較大的比表面積，可使酶與抗體的承載量最大化，賦予該方法優異的載酶效率和較高的酶-抗體比，大大提高了ELISA檢測食品中氯霉素、阿維菌素、四環素和鏈霉素殘留的靈敏度。

基于納米支架型免疫探針構建的熒光免疫傳感器，利用熒光納米材料的大比表面積和高空間利用率，增加標記物結合位點數量，從而承載更多的信號探針，進而達到對熒光信號放大的作用，顯著提升檢測靈敏度、降低檢出限，是具有廣闊發展前景的熒光免疫傳感技術。

3 結 語

近年來，農藥殘留問題使食品安全和生態環境均面臨嚴峻挑戰，成為人類密切關注的焦點。熒光免疫分析技術在農藥殘留現場快速檢測中發揮重要作用，目前正向著高選擇性、高通量和便攜化的方向發展[59]。然而農藥殘留檢測在實際發展過程中仍面臨諸多挑戰：1）熒光免疫分析技術的靈敏度有待進一步提高以適應復雜基質中痕量靶標農藥的檢測；2）面向實際應用，熒光納米探針對環境因素較為敏感，未來研發新的熒光納米材料、多功能復合材料以及改良現有納米材料的制備方法以提升檢測穩定性，搭建抗干擾型免疫傳感器，依然是免疫分析技術的重要發展趨勢；3）與已有的農藥種類相比，能夠高度特異靈敏地識別它們的抗體數量遠遠不能滿足實際檢測需要，所以篩選更多、更高效的農藥抗體也是免疫分析技術在農藥殘留檢測方面深入應用的重要途徑；4）面向大批量、痕量農藥殘留篩查，需要集成度更高的高通量、便攜化免疫傳感器進行現場篩查；5）部分方法因受到成本高昂、制備過程復雜等因素限制，僅適用于實驗室研究，未來仍需要做出更多的努力將其應用于實際農藥殘留檢測。