黑木耳黑色素對缺鐵性貧血小鼠生理指標及腸道菌群的影響

楚福英，王 淼，李元敬，諸 琳，雷 虹,*，馮 磊*

（1.黑龍江大學 農業微生物技術教育部工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150500，2.黑龍江大學生命科學學院，黑龍江省寒地生態修復與資源利用重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150080；3.華南師范大學材料與新能源學院，廣東 汕尾 516600；4.黑龍江省林業科學院科研處，黑龍江 哈爾濱 150081）

機體鐵元素攝入量不足或流失過多以及其他造血營養物質的代謝不平衡是導致缺鐵性貧血（irondeficiency anemia，IDA）的主要原因[1-2]。IDA是世界上最常見的營養缺乏癥，它會影響人體的多個器官臟器，如肝臟、脾臟、結腸等，損害人體生理功能，嚴重影響人們的健康[3-4]。口服補鐵藥物是目前治療IDA的主要方法[5-6]。然而，大多數口服補鐵藥物副作用大，可能造成腸道損傷，進而影響胃腸道鐵元素的吸收[1,7]。因此，尋找更加安全有效的IDA治療新方法至關重要。

黑木耳（Auricularia auricula）是我國分布廣泛且具有獨特的營養價值和保健功能的食用菌[8]。傳統中醫認為黑木耳具有養氣補血，治療氣血虧虛的功效，是優質的天然補血品，可以促進機體造血。黑木耳含有多種生物活性化合物，黑色素是其中的主要生物活性成分，其安全性高[9]，且具有防輻射、抗腫瘤、抗氧化、提高機體免疫力等作用[10-11]，在食品加工、化妝品開發、疾病的預防和治療等方面具有廣闊的應用前景[12]。Wang Furong[13]和Lei[14]等的研究表明魷魚墨黑色素鐵可作為有效的潛在補鐵劑來治療IDA。

腸道菌群及其產物對宿主的生長發育不可或缺，并且可以對腸道健康產生多方面的影響[15-16]，因為腸道菌群不僅能夠調節胃腸道中的宿主生理過程，還可調節腸道外器官，如肝臟、大腦和免疫系統[17-19]。研究表明，IDA會使腸道菌群發生紊亂，并且低鐵條件被認為是導致微生物組成的重大變化的原因[20]。因此，對IDA動物腸道菌群的深入研究可能是治療IDA的關鍵。

本研究通過構建IDA小鼠模型，對模型組小鼠進行黑木耳黑色素灌胃實驗，記錄各組小鼠的體質量變化，采用血細胞自動分析儀分析小鼠的血常規指標，通過高通量測序技術分析小鼠糞便微生物組成，探究黑木耳黑色素對IDA小鼠生理和腸道菌群的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

45 只SPF級24 日齡雄性昆明小鼠（體質量（14.0±1.7）g）購買自哈爾濱醫科大學實驗動物學部，實驗動物生產許可證號：SCXK（黑）2019-001，實驗動物使用許可證號為：SYXK（黑）2018-003。

黑木耳（菌種保藏編號為CCTCC-HDXZ-1） 東寧黑木耳產業基地；鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇、乙酸乙酯、氯仿（均為分析純） 天津市科密歐化學試劑有限公司；糞便基因組DNA提取試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

Biologiclp粉碎機 飛利浦（珠海）有限公司；W201數控恒溫水浴鍋 上海申勝生物科技有限公司；LD15-2A高速離心機 北京醫用離新機廠；AB104-N分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；101-3A電熱鼓風干燥箱 天津市通利信達儀器廠；1800i血細胞自動分析儀 日本Sysmex XT公司；N50 NanoDrop超微量分光光度計 廣州市康玨貿易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑木耳黑色素的制備

參考文獻[21]并稍作修改，從黑木耳中提取、純化黑色素。將烘干后的黑木耳經粉碎機粉碎，過80 目篩。取25 g黑木耳粉末樣品，加入500 mL 3 mol/L鹽酸和1 L蒸餾水，70 ℃下水浴浸提1.0～1.5 h，在浸提液中加入質量分數38.46% NaOH溶液直到有絮狀沉淀生成，充分溶解攪拌后，4 000 r/min離心10 min，取上清液，加入12 mol/L鹽酸至有黑色絮狀物出現，4 000 r/min離心20 min，取沉淀，重復離心（4 000 r/min、20 min）2～3 次得到黑色素粗品。將黑色素粗品純化[21]后進行冷凍干燥，得到黑木耳黑色素樣品。

1.3.2 小鼠建模與分組

參照《保健食品檢驗與評價技術規范實施手冊》[22]中的方法，選取45 只24 日齡昆明種雄性小鼠，適應性飼喂1 周后，隨機分為2 組：對照組（15 只小鼠）、模型組（30 只小鼠）。模型組小鼠飼喂低鐵飼料、飲用超純水進行造模，造模2 周后小鼠尾部采血，采用血細胞自動分析儀測定小鼠血液中的血紅蛋白（hemoglobin，Hb）質量濃度、紅細胞（red blood cell，RBC）計數、紅細胞比容（hematocrit，HCT）、平均紅細胞體積（mean corpuscular volume，MCV），實驗小鼠Hb質量濃度不高于100 g/L即為造模成功。隨后將模型組小鼠隨機平均分為2 組：IDA組、IDA-M組（黑木耳黑色素治療組），每組15 只。IDA-M組灌胃200 mg/（kgmb·d）黑木耳黑色素，灌胃體積0.2 mL，IDA組灌胃0.2 mL超純水，兩組均采用低鐵飼料繼續喂養3 周，期間自由飲用超純水。造模和干預期間，對照組始終飼喂正常飼料并自由飲用去離子水。為避免外源鐵污染，實驗采用塑料籠體和非鐵質籠蓋。自實驗開始，每周稱量小鼠體質量。

1.3.3 樣本采集

最后1 次灌胃后，小鼠禁食不禁水24 h，收集0.5 g小鼠糞便立即裝入2 mL凍存管，-80 ℃保存，用于后續小鼠糞便微生物高通量測序分析。實驗結束時，采用眼球取血的方法收集小鼠血液，每只小鼠收集40 μL血液，加入360 μL肝素鈉生理鹽水溶液（50 μL肝素鈉注射液（2 mL 1.25萬單位）用生理鹽水定容至20 mL）用于血常規檢測。

1.3.4 血常規指標的測定

采用血細胞自動分析儀檢測各組小鼠的血常規指標（Hb質量濃度、RBC計數、白細胞（white blood cell，WBC）計數、血小板（platelet，PLT）計數、HCT、MCV）。

1.3.5 小鼠腸道菌群高通量測序

取0.2 g小鼠糞便樣本，使用小鼠糞便基因組DNA提取試劑盒提取總DNA，然后使用NanoDrop超微量分光光度計檢測DNA的濃度和純度，將合格的DNA樣本保存于凍存管，經液氮速凍后置于干冰中寄送上海美吉生物醫藥科技有限公司進行高通量測序。采用Illumina Miseq PE250 /PE300進行16S rDNA測序，比較分析各組糞便菌群門和屬水平的組成，對小鼠腸道菌群進行Alpha多樣性指數分析和主成分分析（principal component analysis，PCA）。

1.4 數據處理與分析

每組樣品重復測定3 次，結果以平均值±標準差表示。數據采用Excel軟件進行處理，采用Origin 2019軟件作圖，采用SPSS 23.0軟件進行t檢驗，比較組間顯著性差異，P＜0.05和P＜0.01分別代表差異顯著和差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 IDA小鼠模型的建立

飼喂2 周低鐵飼料進行IDA造模，造模結果如表1所示，血常規結果表明模型組小鼠的Hb質量濃度降低至（94.30±3.84）g/L。同時，與對照組相比，模型組的RBC計數、HCT分別極顯著下降了39.1%、33.8%（P＜0.01），MCV顯著下降了9.8%（P＜0.05）。參照《常用醫藥研究動物模型》[23]中規定的IDA判斷依據：Hb質量濃度不高于100 g/L、RBC計數下降和MCV減小，本研究模型組小鼠表現出了明顯的貧血癥狀，表明本實驗造模成功。

表1 缺鐵飲食造模結束時各組小鼠外周血液指標結果Table 1 Routine peripheral blood indices of mice fed normal or lowiron diet for two weeks

2.2 黑木耳黑色素對IDA小鼠體質量的影響

給小鼠飼喂低鐵飼料，飲用超純水2 周后，小鼠開始出現萎蔫不振、運動量減少、生長減緩等現象，灌胃黑木耳黑色素可顯著改善這一現象。如圖1所示，造模結束時模型組小鼠體質量顯著低于對照組（P＜0.05）；黑色素干預結束時，IDA-M組的體質量極顯著高于IDA組（P＜0.01），而與對照組無顯著差異（P＞0.05）。以上結果表明，黑木耳黑色素可以使IDA小鼠體質量恢復正常水平，推測黑木耳色素干預改善了小鼠的消化功能。

圖1 黑木耳黑色素對IDA小鼠體質量的影響Fig.1 Effect of A.auricula melanin on body mass of IDA mice

2.3 黑木耳黑色素對IDA小鼠血液指標的影響

IDA可以通過機體血象指標的改變確定，其中主要以Hb質量濃度、RBC計數最能反映機體是否處于IDA及其所處程度[24-25]；另外，MCV和HCT也是診斷貧血的重要指標[26]；WBC計數可以反映機體的免疫功能[27]；PLT可以反映機體的凝血能力[28]，以上指標均具有較高的臨床診斷評估價值。各組小鼠的血常規結果如圖2所示。灌胃黑木耳黑色素3 周后，IDA-M組小鼠的Hb質量濃度、RBC計數、HCT、MCV相對于IDA組分別極顯著或顯著升高了93.06%（P＜0.01）、72.28%（P＜0.01）、65.39%（P＜0.01）、18.52%（P＜0.05），與對照組相應指標的水平相近，說明黑木耳黑色素可使IDA小鼠貧血指標恢復正常，從而改善IDA；IDA-M組小鼠的WBC計數相對于IDA組顯著升高了68.83%（P＜0.01），說明黑木耳黑色素可使IDA小鼠WBC數目恢復至正常水平，提高IDA小鼠的免疫力，降低結腸炎癥發生的概率；IDA-M組小鼠的PLT計數相對于IDA組顯著降低了32.16%（P＜0.05），說明黑木耳黑色素可有效減少IDA小鼠PLT數目，從而降低血液凝固帶來的風險。

圖2 黑木耳黑色素對IDA小鼠血液指標的影響Fig.2 Effect of A.auricula melanin on blood indices of IDA mice

2.4 黑木耳黑色素對IDA小鼠腸道菌群多樣性的影響

宿主與腸道微生物之間存在動態平衡，結腸組織損傷所引起的屏障功能喪失往往伴隨著腸道菌群結構的改變，課題組前期研究表明IDA小鼠存在腸道損傷[29]，而IDA對腸道菌群的影響鮮有研究。為進一步揭示腸道菌群與IDA的關系，本研究通過高通量測序分析腸道菌群多樣性的變化。如圖3所示，IDA組小鼠的Shannon、Chao1和Ace指數均極顯著低于對照組和IDA-M組（P＜0.01）；IDA-M組小鼠的上述指數均恢復至正常水平；此外，低鐵飲食可導致Simpson指數極顯著升高（P＜0.01），補充黑木耳黑色素極顯著緩解了IDA小鼠腸道菌群Simpson指數變化（P＜0.01）。表明IDA會導致小鼠腸道菌群多樣性降低，補充黑木耳黑色素可顯著改善并恢復IDA小鼠腸道菌群多樣性。

圖3 黑木耳黑色素對IDA小鼠腸道菌群Alpha多樣性指數的影響Fig.3 Effect of A.auricula melanin on alpha-diversity indices of intestinal flora in IDA mice

為進一步確認黑木耳黑色素改善IDA小鼠腸道菌群失衡的現象，利用PCA和Venn圖分析黑木耳黑色素對IDA小鼠腸道菌群的修復作用。如圖4A所示，PCA結果表明對照組和IDA-M組位置相近，與IDA組顯著分開，說明對照組和IDA-M組的腸道菌群結構相似度較高，且均與IDA組的菌群結構存在明顯差異，表明黑木耳黑色素對IDA小鼠腸道菌群結構具有改善作用。Venn圖可以用來統計樣本中共有和獨有的分類操作單元（operational taxonomic unit，OTU）的數目，直觀展現出不同環境樣品中OTU數目組成相似性及重疊情況[30]。由圖4B可知，3 組樣本的共有OTU數目有130 種，IDA組獨有OTU數目最少，僅174 種，灌胃黑木耳黑色素后獨有OTU數目提升至233 種。由此可見，黑木耳黑色素可以增加IDA小鼠腸道菌群的獨有OTU數目，增加腸道菌群多樣性。

圖4 各組小鼠腸道菌群PCA圖（A）和Venn圖（B）Fig.4 Principal component analysis (PCA) plot (A) and Venn diagram (B)of gut microbiome in mice from three groups

2.5 黑木耳黑色素對IDA小鼠腸道菌群群落組成的影響

IDA是常見的鐵營養缺乏性疾病，是世界范圍內主要的公共衛生問題之一。研究表明，嬰幼兒IDA與腸道菌群有關[20]，而且腸道菌群可通過代謝產物增加鐵蛋白的表達，以抑制宿主的腸道鐵吸收[31]，表明腸道菌群或可作為鐵失調的治療靶點。因此IDA的防治需要更加重視腸道菌群的作用。黑木耳黑色素對IDA小鼠腸道菌群組成的影響如圖5、6所示。小鼠腸道菌群中門水平的優勢菌門分別是擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和變形菌門（Proteobacteria），占小鼠腸道菌群的99%以上（圖5A）。當補充黑木耳黑色素后，IDA-M組的Firmicutes和Verrucomicrobia相對豐度相對于IDA組分別明顯增加了29.72%和2 794.12%，Bacteroidetes和Proteobacteria分別明顯降低了20.80%和13.03%，與對照組相比已無明顯差異。Pereira等[32]研究也表明，Bacteroidetes、Firmicutes、Proteobacteria是補充納米鐵（III）或硫酸亞鐵前后IDA小鼠糞便微生物群中的主要菌群。Muleviciene等[20]發現IDA患者會腸道中Bacteroidetes和Proteobacteria富集，Verrucomicrobia相對豐度降低，與本研究結果一致。說明黑木耳黑色素可以緩解由IDA引起的主要優勢菌門的變化，并使之恢復至正常水平。

圖5 各組小鼠糞便樣本中主要門和屬水平菌群組成Fig.5 Composition of intestinal flora in three groups of mice at the phyla and genus levels

屬水平上相對豐度前10 位菌屬為小鼠腸道微生物優勢菌屬（圖5B）。由圖6可知，與對照組相比，IDA組小鼠腸道中的Akkermansia、Alistipes、未分類的屬、Falsiporphyromonas、Coprobacter相對豐度分別極顯著或高度顯著降低了97.43%（P＜0.001）、54.01%（P＜0.01）、59.13%（P＜0.01）、91.32%（P＜0.001）、98.26%（P＜0.01）；條件致病菌Parabacteroides相對豐度極顯著增加了433.12%（P＜0.01）。補充黑木耳黑色素后，與IDA組相比，IDA-M組小鼠腸道中的Akkermansia、Alistipes、未分類的屬、Falsiporphyromonas、Coprobacter相對豐度分別顯著增加了3 080.88%（P＜0.001）、216.61%（P＜0.001）、104.36%（P＜0.05）、521.21%（P＜0.05）、6 520.00%（P＜0.01）；Parabacteroides相對豐度極顯著降低了89.57%（P＜0.01）。最新的研究表明乳桿菌屬可感知腸道中的鐵水平，并抑制宿主的鐵吸收；而鐵失衡會導致腸道菌群的改變，進而改變微生物多樣性，增加病原體相對豐度并誘導腸道炎癥的發生發展[31]。

圖6 黑木耳黑色素對IDA小鼠腸道屬水平差異微生物相對豐度的影響Fig.6 Effect of A.auricula melanin on relative abundance of differential intestinal microorganisms in IDA mice at the genus level

哺乳動物腸道中的Akkermansia屬微生物均為嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila），這是一種潛在益生菌[33-34]，其相對豐度與炎癥水平呈負相關[35-36]；課題組前期的研究也表明IDA可引起小鼠結腸炎癥損傷[29]，由此推測，與對照組小鼠相比，IDA小鼠Akkermansia muciniphila相對豐度顯著降低，而補充黑木耳黑色素后顯著提高了小鼠腸道Akkermansia muciniphila的相對豐度，表明Akkermansia muciniphila在黑木耳黑色素改善IDA過程中可能發揮重要作用，而這種作用可能與炎癥修復有關。

Alistipes是擬桿菌門的一種革蘭氏陰性細菌，主要存在于健康人的腸道中，可代謝產生琥珀酸、乙酸、丙酸等短鏈脂肪酸，Dostal等[37]研究表明鐵缺乏會導致有益菌Alistipes相對豐度減少，與本實驗結果相似。先前的研究表明短鏈脂肪酸具有抗炎作用，由此推測Alistipes相對豐度降低會促使短鏈脂肪酸含量減少，這也可能是鐵缺乏加劇腸道損傷的原因。相反補充黑木耳黑色素顯著增加了Alistipes相對豐度，表明其在黑木耳黑色素改善IDA過程中同樣具有重要作用。Alistipes是一種從臨床樣本中分離出來的相對較新的細菌屬，盡管Alistipes在健康表型中發揮作用，但需要注意的是，Alistipe可能引起焦慮、抑郁癥等疾病[38]。因此，需要進一步有針對性地研究該屬在疾病和健康中的作用。

本實驗結果表明IDA小鼠Falsiporphyromonas相對豐度高度顯著降低（P＜0.001），補充黑木耳黑色素改善貧血狀況后Falsiporphyromonas相對豐度顯著增加（P＜0.05）。目前關于Falsiporphyromonas的報道較少，有研究表明其與卟啉單胞菌屬基因序列相似度較高[39]，且均為紫單胞菌科微生物。卟啉單胞菌是一種絕對需鐵菌[40]，推測Falsiporphyromonas也具有相似的性質，可以通過Falsiporphyromonas相對豐度水平推測宿主的貧血狀況。

Coprobacter菌屬可以降解膳食纖維，產生丙酸、丁酸等有益的短鏈脂肪酸[41]，本實驗結果表明補充黑木耳黑色素極顯著提高了Coprobacter的相對豐度。Parabacteroides是人體核心菌群之一，Noble等[42]研究表明高糖飲食會導致Parabacteroides水平升高，而Parabacteroides水平越高，記憶缺陷則越明顯。本實驗結果表明缺鐵會導致Parabacteroides水平升高，補充黑色素則會顯著逆轉Parabacteroides的相對豐度，表明該菌在黑色素改善IDA的過程中起到與黑色素相反的作用。然而，Wang Kai等[43]的研究揭示了腸道共生菌Parabacteroides distasonis在調節糖脂代謝方面是一種潛在的新型抗代謝綜合征益生菌。因此,需要根據特定條件來判定Parabacteroides是否為致病菌。以上結果表明，補充黑木耳黑色素顯著提高有益菌的相對豐度，降低有害菌的相對豐度，表明腸道菌群在參與黑木耳黑色素改善貧血過程中具有重要作用，但其具體作用機制還有待進一步研究。

3 結 論

本實驗結果表明黑木耳黑色素可增加IDA小鼠體質量，改善和恢復IDA小鼠貧血癥狀指標Hb質量濃度、RBC計數、HCT、MCV、WBC計數、PLT計數，增加有益菌Akkermansia、Alistipes等菌屬相對豐度，降低條件致病菌Proteobacteria的相對豐度。總之，黑木耳黑色素干預能夠恢復和改善IDA癥狀，腸道菌群可能在其中發揮重要作用，未來研究可以采用菌群剔除、糞菌移植并結合代謝組學技術，進一步分析腸道菌群在黑木耳黑色素治療IDA中發揮作用的機制。