腫瘤的免疫檢查點抑制劑治療及其標志物概述

杜艷蕓，趙紫艷，王晨輝

(1.四川省醫學科學院·四川省人民醫院 a.人類疾病基因研究四川省重點實驗室，b.中國醫學科學院院外創新單元“常見致盲眼病研究及防治創新單元”,四川 成都 610072；2.電子科技大學醫學院，四川 成都 611731)

1 免疫檢查點及其抑制劑的基礎與臨床研究

1.1 細胞毒性T淋巴細胞抗原 4(cytotoxic T-lymphocyte antigen 4, CTLA-4)分子及其抑制劑的臨床應用CTLA-4又稱CD152，是免疫球蛋白超家族的成員，主要表達在調節性T細胞(T regulatory cells, Treg)細胞或活化的T細胞上[1]。CTLA-4與CD28分子具有高度同源性。這兩個分子可與抗原遞呈細胞(antigen-presenting cells，APC)上的CD80(B7.1)或CD86(B7.2)結合[1]。但是CTLA-4在T細胞激活方面發揮著與CD28相反的作用：其通過多種途徑抑制T細胞的活化[1]。眾多研究表明，CTLA-4基因的多態性可增加如多發性硬化癥、類風濕性關節炎和炎癥性腸病等自身免疫性疾病的易感性[2]，說明CTLA-4在調節免疫系統的平衡和穩態方面發揮著至關重要的作用。

CTLA-4抗體抑制劑是首個被批準的免疫檢查點抑制劑，它也是首個不針對腫瘤本身，而是旨在恢復和增強患者抗腫瘤免疫防御，以殺傷和清除腫瘤的藥物，對于癌癥的治療具有重大的意義。百時美施貴寶公司的CTLA-4單抗伊匹單抗(Ipilimumab)是首個FDA獲批上市的免疫檢查點抑制劑藥物，用于治療晚期黑色素瘤[3]。在臨床上伊匹單抗常與其他藥物聯合使用，例如伊匹單抗與PD-1單克隆抗體抑制劑納武單抗(Nivolumab)聯合被用于治療晚期腎細胞癌、轉移性結直腸癌、非小細胞肺癌、惡性胸膜間皮瘤等[3]。然而，CTLA-4作為T細胞的負調控因子，抑制免疫應答，對于防止自身免疫性疾病的發生至關重要。利用伊匹單抗阻斷CTLA-4會造成多部位的免疫相關不良事件，這說明CTLA-4對于機體的免疫耐受十分重要。2022年，FDA批準CTLA-4單抗抑制劑替西木單抗(Tremelimumab)與PD-L1抗體抑制劑度伐利尤單抗(Durvalumab)聯合用于治療肝細胞癌。2022年，由我國康方生物公司自主研發的PD-1/CTLA-4雙特異性腫瘤免疫治療藥物——開坦尼被FDA批準上市，用于治療既往接受含鉑化療治療失敗的復發或轉移性宮頸癌。

1.2 程序性死亡蛋白1(Programmed cell death protein 1，PD-1)/程序性細胞死亡蛋白-1配體(programmed cell death protein-1 ligand，PD-L1)分子及其抑制劑PD-1又稱CD279，是免疫球蛋白超家族的成員，主要在免疫細胞上表達，如巨噬細胞、樹突狀細胞、自然殺傷細胞、T細胞和B細胞[4]。在腫瘤微環境中，活化的T細胞上調PD-1的表達，而PD-1與其配體PD-L1結合會降低IL-2、IFN-γ和TNF-α等細胞因子的分泌，抑制T細胞的增殖，激活T細胞程序性死亡因子的表達，促使T細胞凋亡，從而抑制免疫應答[4]。PD-L1又稱CD274，是B7家族的成員之一，廣泛表達在多種類型細胞上，包括腫瘤細胞[5]。PD-L1的上調能夠抑制免疫系統的過度激活，從而維持機體的自身免疫耐受。腫瘤細胞利用了PD-1/PD-L1抑制免疫系統，發生免疫逃逸。因此，阻斷PD-1和PD-L1的相互作用可以逆轉免疫抑制狀態，提高機體的免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷能力[5]。

最早被FDA批準的PD-1抑制劑是百時美施貴寶公司的納武單抗(Nivolumab)和默沙東公司的派姆單抗(Pembrolizumab)，均為抗PD-1單克隆抗體抑制劑。納武單抗又稱Opdivo，在臨床上被用于治療黑色素瘤、腎細胞癌和非小細胞肺癌[6]。派姆單抗又稱Keytruda，用于多發性實體瘤、經典型霍奇金淋巴瘤和原發性縱隔大B細胞淋巴瘤的治療。已有研究表明，在III/IV期的黑色素瘤中，派姆單抗治療在無進展生存期、總生存率和安全性方面優于CTLA-4抑制劑伊匹單抗。除用作單一藥物外，派姆單抗還可與化療藥物聯用，延長晚期食道癌患者的總生存率[7]。派姆單抗與PARP抑制劑Neriparib聯合可用于治療對鉑類耐藥的卵巢癌和對一線治療耐藥的三陰性乳腺癌的治療。再生元公司研制的西米普利單抗(Cemiplimab,Libtayo)也獲得FDA的批準，用于治療轉移性/局部晚期皮膚鱗狀細胞癌。被FDA批準的PD-L1單抗包括：羅氏公司的阿特珠單抗(Atezolizumab)、阿斯利康公司的度伐利尤單抗(Durvalumab)和輝瑞公司的阿維單抗(Avelumab)，用于惡性黑色素瘤的治療。PD-L1抑制劑相比PD-1抑制劑副作用小，而療效與PD-1抑制劑相當。

1.3 淋巴細胞活化基因-3(lymphocyte activation gene-3，LAG-3)分子及其抑制劑LAG-3又稱CD223，主要在CD4+T細胞、CD8+T細胞、自然殺傷細胞和Treg細胞上表達[8]。LAG-3與主要組織相容性復合體II(MHC II)結合，其與MHC II親和力比CD4高。除此之外，LAG-3還有其他的配體，如半乳糖凝集素、肝竇內皮細胞凝集素和纖維蛋白原樣蛋白1。LAG3通過加速T細胞耗竭和抑制T細胞增殖，從而抑制抗腫瘤免疫的發生[8]。2022年，LAG-3單抗抑制劑Relatlimab與PD-1單抗納武單抗的混合試劑Opdualag獲得 FDA批準，用于治療難治復發型黑色素瘤。雖然目前只獲批了一款LAG-3抑制劑，但已有多款LAG-3抑制劑進入臨床研究，如MK-4280A、Tebotelimab、Chlorogenic acid、LAG-525等。

1.4 T淋巴細胞免疫球蛋白黏蛋白 3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3，TIM-3)分子及其抑制劑TIM-3是TIM家族的成員，屬于I 型跨膜糖蛋白，表達在終末分化的 CD4+T 細胞亞群(Th1、Th17、Treg)、CD8+T 細胞亞群(Tc1)、B細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、自然殺傷細胞、肥大細胞和單核細胞上[9]。據報道，TIM3與其配體半乳糖凝集素9結合，抑制Th1介導的免疫應答并誘導T細胞凋亡。另外，TIM-3還有其它的配體，如磷脂酰絲氨酸，癌胚抗原相關細胞黏附分子1和高遷移率組蛋白B1。TIM-3可作為T細胞耗竭的標志物。通過藥物靶向TIM-3能夠重新恢復T細胞的活力，從而促進T細胞對腫瘤的殺傷。TIM-3是目前研究最多的免疫治療的靶點之一，但國內外至今還沒有上市藥物。針對TIM-3的靶向藥物目前都處于臨床試驗階段。諾華公司的Sabatolimab(MBG453)、葛蘭素史克公司的Cobolimab (TSR-022)處于3期臨床階段。羅氏公司的RO7121661、阿斯利康公司的AZD7789等處于臨床II期試驗階段。

1.5 T細胞免疫球蛋白和 ITIM 結構域(T cell immunoglobulin and ITIM domain，TIGIT)TIGIT分子及其抑制劑TIGIT是免疫球蛋白超家族的成員，主要在自然殺傷細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞和Treg細胞上表達[10]，并且在多種惡性腫瘤的腫瘤浸潤淋巴細胞中表達上調，如黑色素瘤、急性髓系白血病和非小細胞肺癌等。CD155 (PVR)、 CD112 (PVRL2)和CD113 (PVRL3)是TIGIT的三個配體。TIGIT通過與CD226(T細胞激活受體)競爭結合配體，抑制T細胞的應答。有研究表明[11]，與野生型小鼠相比，TIGIT-/-小鼠接種的B16F10和MC38皮下腫瘤的生長顯著減小，在VK*MYC骨髓瘤模型中，TIGIT-/-小鼠存活率增加，并且用TIGIT單抗阻斷可延長小鼠存活期。此外，TIGIT單抗可以增強多發性骨髓瘤患者CD8+T細胞的殺腫瘤能力[12]。TIGIT是新型的免疫檢查點，但目前尚無針對TIGIT的抑制劑獲批上市，針對TIGIT的靶向藥物都處于臨床試驗階段。百濟神州公司的TIGIT抑制劑Ociperlimab已進入Ⅲ期臨床試驗，擬用于治療轉移性非小細胞肺癌。此外，康方生物公司的AK-127、復宏漢霖公司的HLX-301、阿斯利康公司的AZD-2936、默克公司的M-6223等TIGIT抑制劑正在開展Ⅱ期臨床試驗。

1.6 其他在研的免疫檢查點分子及其抑制劑除了上述提到的免疫檢查點分子及研發的相應抑制劑藥物，還存在一些其它的潛在檢查點分子，如B7-H3、B7-H4、BTNL2等，也被腫瘤細胞利用來逃避免疫系統的識別和殺傷[13，14]。其中針對B7-H3和B7-H4的抑制劑Enoblituzumab和FPA150也已經進入臨床試驗階段，并取得了令人鼓舞的初步結果。針對BTNL2分子的臨床前研究也表明，這是一個有前景的免疫檢查點靶標。期待未來更多的免疫檢查點抑制劑可以真正應用到臨床，造福患者。

2 免疫檢查點抑制劑相關生物標志物

2.1 PD-L1的表達水平PD-L1是PD-1的配體，通過免疫組織化學(immunohistochemistry, IHC)檢測腫瘤組織以及腫瘤中浸潤的免疫細胞上PD-L1的表達水平作為預測免疫檢查點抑制劑治療的療效已得到廣泛認可。多個臨床試驗結果顯示，PD-L1表達水平與PD-1抗體抑制劑治療患者總生存期(OS)和無進展生存期(PFS)顯著相關[15]。其中，在派姆單抗(Pembrolizumab)用于非小細胞肺癌治療的臨床試驗結果顯示，無論之前是否接受過其它治療，對于腫瘤組織中PD-L1膜表達的腫瘤細胞占比大于50%的腫瘤患者，其OS、PFS和客觀緩解率(ORR)相對于PD-L1陰性表達的患者均顯著增高和延長。在度伐利尤單抗(Durvalumab)用于晚期尿路上皮膀胱癌患者治療的臨床試驗中發現，將腫瘤活檢樣本中PD-L1膜表達(包括腫瘤細胞和腫瘤浸潤的免疫細胞)大于25%定義為PD-L1陽性時，PD-L1陽性組的ORR為46.4%，而PD-L1陰性組ORR為0%。鑒于已有的臨床試驗結果，美國食品藥物監督管理局已經批準了幾種與PD-L1配套的IHC檢測試劑，包括用于派姆單抗療效評判PD-L1的IHC 22C3 PharmDx；用于納武單抗(Nivolumab)療效評判PD-L1的 IHC 28-8 PharmDx；用于阿特朱單抗(Atezolizumab)療效評判的Ventana PD-L1(SP142)和用于度伐利尤單抗療效評判的Ventana PD-L1(SP263)。雖然PD-L1的表達已經成為一些免疫檢查點抑制劑使用的評判標準，但是PD-L1仍然是一個不完善的生物標志物。研究發現不少呈PD-L1陰性腫瘤組織的癌癥病例對 PD-1/PD-L1 抑制劑治療也有響應[16]。例如，對4174名不同腫瘤類型的隨機試驗患者進行分析發現，與傳統療法相比，免疫檢查點抑制劑治療顯著降低了死亡風險。其中PD-L1陽性表達患者的死亡風險降低了34%，而PD-L1陰性表達患者的死亡風險也降低了20%[17]。造成這種現象的原因較為復雜，一方面是由于PD-L1免疫組化檢測的獲批試劑對應藥物各有不同，并且PD-L1 表達的評估標準也不一致；另一方面是由于腫瘤組織中PD-L1的表達存在空間和時間的異質性。因此，未來需要通過進一步研究來優化以PD-L1表達水平作為免疫檢查點抑制劑治療腫瘤療效的生物標志物的標準。

2.2 錯配修復缺陷和微衛星不穩定(microsatellite instability，MSI)MSI 是指與正常組織相比，腫瘤中的微衛星位點由于重復單元的插入或缺失而出現新的微衛星等位基因的現象。MSI的發生是由于腫瘤組織的DNA錯配修復功能出現缺陷所導致，通常認為DNA錯配修復缺陷(Mismatch repair deficiency，dMMR)與高度微衛星不穩定(MSI-H)在生物學上具有一致性。2017年美國食品和藥物管理局(FDA)批準派姆單抗用于治療MSI-H/dMMR實體瘤患者，這是第一種僅基于生物標志物而不考慮腫瘤發生部位獲準的藥物。FDA批準的依據是基于5項相互獨立的臨床試驗(KEYNOTE016、KEYNOTE164、KEYNOTE012、KEYNOTE228和KEYNOTE158)中記錄的149例MSI-H/dMMR癌癥患者接受PD-1抑制劑治療的數據[18]。這149例不同腫瘤類型患者的ORR為39.6%，完全緩解率為7%。反應持續時間為1.6～22.7個月，并且78%的反應持續時間大于6個月。其中2015年進行的KEYNOTE016臨床試驗評估了派姆單抗在dMMR和錯配修復功能完整(pMMR)的結直腸癌患者以及dMMR的非結直腸癌患者中療效。結果顯示，在20周時，dMMR結直腸癌患者和其他dMMR非結直腸癌患者的ORR分別為40% (4/10)和71% (5/7)，無進展生存率分別為78%和67%；而pMMR的結直腸癌患者ORR為0%，無進展生存率僅為11%[18]。另外，也有臨床研究評估了納武單抗在MSI-H/ dMMR腫瘤患者中的療效。在一項II期臨床試驗中發現，74例轉移性的MSI-H/dMMR 結直腸癌患者對納武單抗的ORR為31.1%，12個月的無進展生存率和總生存率分別為50.4%和73.4%[19]。同一研究組還進行了納武單抗和伊普利單抗聯合治療119例之前接受過治療的MSI-H/dMMR 結直腸癌患者的研究。結果發現，患者的ORR為55%，12個月的PFS和OS率分別為71%和85%[19]。根據這些研究數據，FDA批準了納武單抗用于治療成人和兒童(年齡≥12歲)使用氟嘧啶、奧沙利鉑和伊立替康治療后出現進展的MSI-H/dMMR結直腸癌患者。雖然MSI-H是預測腫瘤患者是否能受益于免疫檢查點抑制劑治療的一個較為準確的生物標志物，但是具有較高MSI-H發生率的腫瘤類型比較少，因此能夠通過該標志物預測獲益的患者也相對較少。

2.3 腫瘤突變負荷(tumor mutational burden，TMB)TMB是衡量癌癥中基因突變數量的指標。TMB越高，產生腫瘤新抗原的數量也就越多，進而被免疫系統識別的可能性就越大。自從TMB首次被認為是黑色素瘤免疫檢查點抑制劑療效的潛在生物標志物以來，越來越多的研究報道較高的TMB與免疫檢查點療效之間存在密切的關系[20]，說明TMB是一個有潛力的腫瘤免疫治療療效預測生物標志物。臨床數據分析顯示TMB與免疫檢查點抑制劑的ORR之間存在顯著相關性。在使用免疫檢查點抑制劑治療的151例晚期實體瘤患者中，TMB較低患者的ORR為5%(<5個突變/Mb)，TMB居中患者的ORR為25%(6～19個突變/Mb)，TMB較高患者的ORR為45%(>20～49個突變/Mb)，TMB非常高患者(>50突變/Mb)的患者ORR為65%[20]。目前TMB檢測方法主要是基于高通量測序平臺的全外顯子測序和靶向Panel測序。但檢測方法和TMB的評分標準缺乏統一標準。盡管FDA已經批準了派姆單抗在TMB >10突變/Mb的實體瘤中的應用，并且在進一步開發測量血液循環腫瘤DNA的TMB。但作為臨床生物標記物，由于測序費用昂貴并且缺乏通用的評分標準，使得TMB的進一步開發和在臨床中的廣泛應用仍然面臨諸多挑戰。

2.4 腫瘤浸潤淋巴細胞腫瘤浸潤淋巴細胞指浸潤在腫瘤微環境中的淋巴細胞，是機體參與抗腫瘤免疫應答的重要組成部分。腫瘤組織中浸潤的淋巴細胞豐度與免疫檢查點抑制劑的療效具有顯著相關性。通常認為，腫瘤中浸潤淋巴細胞越多，免疫治療效果越好[21，22]。在一項對46例轉移性黑色素瘤患者使用派姆單抗治療的臨床試驗中[23]，研究人員獲取了患者經派姆單抗治療前和治療后的腫瘤樣本。通過定量免疫組織化學和定量多重免疫熒光分析發現，對抗體治療有響應的患者腫瘤內CD8+T細胞表現出明顯的增殖，并且應答患者在抗體治療前樣本的腫瘤侵襲邊緣和腫瘤內部的CD8+T、PD-1+和PD-L1+T細胞顯著高于無應答患者。研究者在對接受派姆單抗/納武單抗治療的黑色素瘤患者中的研究也得到了類似的結果，即應答者抗體治療后的活檢樣本與治療前的樣本相比，腫瘤內CD8+T淋巴細胞和CD68+巨噬細胞數量顯著增加[23]。另一研究團隊也發現轉移性黑色素瘤患者腫瘤中浸潤的PD-1hiCTLA-4hiCD8+T細胞比例的增加與抗體治療應答以及無進展生存期密切相關[24]。因此，腫瘤浸潤淋巴細胞也是篩選腫瘤免疫治療有效人群的一個較為準確的生物標志物。

3 小結

腫瘤免疫治療的出現，引領了癌癥治療的重大變革，是晚期腫瘤患者重要的治療選擇之一。除了免疫檢查點單藥的使用，越來越多的臨床研究聚焦于免疫聯合治療，包括不同免疫檢查點抑制劑的聯合，免疫檢查點抑制劑于放療、化療、靶向治療的聯合治療等。但是，目前用于預測腫瘤免疫治療療效的生物標志物，如PD-L1的表達水平、TMB、MSI-H對于免疫檢查點抑制劑的療效預測均有限，無法完全準確的預測治療效果。因此，未來還需要發現新的更為準確的免疫檢查點抑制劑療效預測的生物標志物。或者對多種生物標志物探索聯合應用，從而提高預測的準確率。另外，已有的生物標志物在免疫單藥使用中具有一定的預測療效作用，但在聯合治療中的預測價值還存在爭議。未來還需要通過大量的基礎和臨床研究來探索并驗證多種組合型生物標志物對免疫檢查點抑制劑療效的預測，特別是對聯合治療療效的預測，從而真正實現精準的腫瘤免疫治療。