現代食品工藝在肽制備生產中的應用

◎舒思凱

（金華市食品藥品檢驗檢測研究院，浙江 金華 321000）

肽是一個氨基酸的氨基與另一個氨基酸的羧基經脫水形成的化合物，是生物體內多種細胞維持功能所需的活性物質。自1920 年肽被發現以來，肽對人體健康的影響，如抗衰、降血脂、降血糖、抗癌、抗炎和提高免疫力等多種功能活性被許多科學家證實，多位科學家因對肽的研究獲得了諾貝爾獎。肽也因此在食品、醫藥、化妝品等領域倍受關注，逐漸成為近年的研究熱點。而如何高效制備生物活性肽，對整個肽行業的發展具有至關重要的作用。

因肽結構與其活性具有高度相關性，這對制活性肽的工藝提出了考驗，不同工藝制備得到的肽結構及性能會有相應變化。為更經濟有效地制備生產活性肽，大量科研人員對肽制備方法及生產工藝進行了研究改進。目前，常用的肽制備手段有化學水解法、酶解法、微生物發酵法和人工合成等方法，本文擬對以上方法進行總結。

1 化學水解法

食源蛋白質的化學水解通過酸堿催化分解肽鍵制備生物活性肽，是提高蛋白功能特性的一種方法，有助于研究和開發食源性蛋白在食品和生物醫學領域的應用?；瘜W水解分為三類，包括酸水解、堿水解和化學試劑工藝，經常用于從大豆、玉米醇溶蛋白等常見的植物蛋白中制備功能性水解產物[1]。酸水解通常在110～120 ℃使用質子酸進行，而堿水解則在高溫（130～180 ℃）下使用強堿（氫氧化鈉或氫氧化鉀）在水中進行。

由于化學水解具有反應過程困難、氨基酸容易變性、副產物較多且環境不友好等缺點，易使多肽的分子量分布和氨基酸組成不穩定，功能活性低。而化學水解反應過程的精確控制需要更高的技術要求，這無疑會大大增加生產成本。此外，酸堿水解中和后，剩余的酸堿復合物會產生許多無機鹽，脫鹽使生產過程更加復雜，這些特性限制了化學水解在生物活性肽制備中的應用。

2 酶解法

酶解法制肽是指蛋白質中的肽鍵在蛋白酶水解的作用下斷裂，但氨基酸的結構和構型保持不變，在此過程中不會產生有毒有害物質。酶水解是一種公認的高安全性水解方法，整個酶解過程條件溫和、易控制、所用設備簡單且生產成本低。此外，酶水解在一定程度上可改善蛋白質的功能性質，如蛋白質的溶解度和乳化性，降低蛋白致敏性，更易被人體消化和吸收，并增強生物活性[2]。

多種因素如酶特異性、水解時間、水解程度、酶/底物比率和氨基酸序列均會影響所得到活性肽的組成和功能活性?；钚噪纳a中常用的蛋白酶可分為兩大類：內源酶和外源酶。一般情況下，食源性蛋白中內源酶含量較低，生產中多采用包括堿性蛋白酶、酸性蛋白酶、黃素酶、中性酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶等外源酶進行活性肽制備[3]。研究表明，在不同種類的外源蛋白酶中，堿性蛋白酶對小麥胚芽蛋白具有較高程度的酶解作用。另外，堿性蛋白酶和胰蛋白酶聯合酶水解產生的水解產物，比堿性蛋白酶單酶水解產物具有更好的抗氧化活性。

定向酶解是指在受控條件下，使用食品級蛋白酶進行酶水解制備食源性生物活性肽得到目的活性肽[4]。研究顯示，食源性蛋白質中存在多種蛋白酶的切割位點。如堿性蛋白酶可以在疏水殘基的C 端裂解蛋白質，胰凝乳蛋白酶在芳香和疏水殘基C 端裂解蛋白質，而蛋白肽A 的裂解位點在Phe、Leu 或Glu，胰蛋白酶在堿性Lys 或Arg。因此，根據所需肽段結構特征選取相應蛋白酶，在生物活性肽的生產中顯得尤為重要。

3 微生物發酵法

近年來，微生物發酵也被發現是制備生物活性肽的一種很有前景的方法，尤其是從廢棄的蛋白質源中制備肽。微生物發酵是利用發酵菌株產生的酶進行蛋白質水解的過程[5]。如在小麥胚芽的發酵過程中，枯草芽孢桿菌、乳酸菌（LAB）和真菌可以釋放許多不同的肽，包括二肽、三肽和其他生物活性肽[6]，其發酵的小麥胚芽提取物可以抑制結直腸癌細胞系HT-29、HCT-8 和DLD-1 的生長[7]，并顯著提高粗蛋白、總磷、小肽和游離氨基酸的水平，使中性洗滌劑纖維、半纖維素和植酸酶P 的水平下降[8]。最重要的是，水解過程中沒有產生苦味的游離氨基酸。

為了解決從天然產物中提取特定肽段得率較低的問題，科學家們利用重組DNA 技術，通過基因編輯微生物定向發酵制備特定生物活性肽已成為研究熱點。如 重 組OSW（Gln-Thr-Phe-Gln-Tyr-Ser-Gly-Trp-Thr-Asn）肽的抗氧化活性比化學合成制備的OSW 肽高了約100 倍[9]。重組DNA 合成耗時、昂貴，且只能合成大分子肽和蛋白質，目前的研究還不成熟，仍處于發展階段。未來一旦重組DNA 技術體系完善，活性肽可以使用廉價的原材料大量生產，將為活性肽的發展帶來巨大的推動作用。

4 人工合成

人工合成肽技術發展共經歷了三個階段：經典溶液肽合成（CSPS）、固相肽合成（SPPS）和液相肽合成（LPPS）[10]。CSPS是用于人工合成制備肽最早的方法，該方法制備中使用的肽以及大規模制備中長肽是冗長且非常耗時的。在CSPS 中，肽合成過程中其氨基酸側鏈通常不受保護，因此在實際序列的組裝過程中可能發生被動修飾，故此后的工藝優化著重于對氨基酸側鏈的保護上[11]。諾貝爾獎得主布魯斯·梅里菲爾德（Bruce Merrifeld）開創性的引入了異相合成，稱為固相肽合成（SPPS）[12]。該方法極大地簡化了肽合成操作，消除了純化中間體的需要，將制備指定肽的時間縮短到了幾個小時內。此外，SPPS 易于擴大規模，平均每天產量可達數公斤。由于SPPS 過程中會產生大量過量的試劑和每個合成步驟所需的大量溶劑，不符合綠色化學的理念。因此，克服以上挑戰，開發能夠減少有毒試劑和溶劑、減少縮合劑、減少異構化和其他副產物的技術迫在眉睫。

近年來，對肽合成第三階段合成路線的關注日益增加，該路線結合了SPPS 和CSPS 的最佳特性，稱之為液相肽合成（LPPS）[13]。LPPS 結合了CSPS 和SPPS，使肽鏈延伸在溶液中進行，此方法生產的肽自帶可溶性標簽，LPPS 技術在大規模生產肽的過程中可減少過量試劑的使用，符合綠色化學的原則。此外，LPPS 技術合成的肽必須不同于反應過程中產生的副產物的性質，以便通過簡單的沉淀、過濾或提取等手段去除。因SPPS 合成過程中的肽由較大的固體聚合物支撐，而LPPS 主要由小分子或可溶性聚合物支撐，故LPPS 所需的溶劑量遠少于SPPS。LPPS 可以千克或噸為單位進行生產，可以自動化，生產過程中的能量輸入低，并且節省合成材料，消耗成本低。近年來，LPPS 合成過程所用到的標簽發生了巨大變化，從多分散聚乙二醇（PEG）到單分散PEG、全氟烷基、離子液體、疏水聚合物和含磷標簽。

5 結語

目前，市場上越來越多的肽類健康食品上市，已有近100 種肽類藥物被批準，另有400～600 種在臨床前開發中，這反映了人們對活性肽的關注日益增長。然而，目前對肽的研究還不夠深入，不同技術方法的制備過程還存在一些問題，如酶利用率低、肽產率低、產物不穩定、純度低和成本高等。如何綠色、經濟的合成活性肽，目前仍是全世界科學家面臨的主要挑戰。在酶水解的基礎上，結合酶固定化和膜分離技術，輔以超聲、微波和超高壓技術，實現高效、大規模生產生物活性肽已成為研究熱點。在生物活性肽的高速發展背景下，應從經濟和可持續性角度開發新的肽生產工藝，為肽行業的高速健康發展提供技術支撐。