顳下頜關節紊亂病動物模型構建進展

周文成 綜述 沈山 審校

暨南大學口腔醫學院，廣東 廣州 510635

動物模型與人類生理特點相似、疾病表征相近、解剖結構相符合的動物，通過實驗方法人為地改造或者利用某些動物的天然屬性，從而得到能夠外推到人類目標群體的真理。它是進入臨床實驗前不可或缺的的一部分，是基礎實驗步入臨床研究的關鍵步驟。實驗動物可以模擬人類疾病的發病過程、病理改變、臨床表現，從而成為目前究疾病病因、發病機制、治療方法的重要途徑。近年來，有關顳下頜關節紊亂病(temporomandibular disorders，TMD)研究的動物模型層出不窮。根據不同的病因和癥狀，可以采用不同的方式來誘導，主要分為以下四種方式：化學注射法、機械刺激法、手術誘導法、基因工程修飾法。根據TMD的不同病因，采取各種檢索方式和選擇標準，使用各種搜索詞的組合，如顳下頜關節紊亂病、動物模型、實驗動物、發病機制。對相關文獻、綜述、會議文章進行檢索、納入和綜述，以尋找TMD的動物模型建立方法。

1 不同化學誘導劑作用機理及評價

1.1 完全弗氏佐劑誘導完全弗氏佐劑(complete freund's adjuvant，CFA)是一種油鹽乳液，熱滅活的結核分支桿菌懸浮其中，能夠有效地誘導抗體生成。CFA活性來自于油滴中免疫抗原的持續釋放，并刺激局部免疫反應。Wang等[1]以7周齡雌性SD大鼠為實驗對象，在大鼠適應環境后的第1天和第14天分別向大鼠的顳下頜關節(temporomandibular joint，TMJ)上腔注射CFA。在首次注射后的第1天，實驗組相對于對照組，頭圍平均增加了5 mm，提示關節發生嚴重腫脹，且頭部抽離閾值(head withdraw threshold)明顯低于對照組，表明實驗組大鼠產生劇烈疼痛；實驗組大鼠HE染色結果顯示大鼠表現出慢性滑膜炎的特征：滑膜襯里細胞增生，伴有大量單核細胞浸潤，且關節盤出現增厚和變形；實時熒光定量qPCR(RT-qPCR)結果顯示iNOS(誘導型一氧化氮合成酶)、IL-1β(白介素-1β)表達量明顯高于對照組，這導致關節盤炎性增厚，濕重和凈重增加，膠原蛋白和蛋白聚集多糖含量升高。這些結果驗證了Wang等[1]的假設：持續炎癥是顳下頜關節退行性變的誘發因素。然而，值得注意的是關節炎大鼠的關節盤前帶和中間帶的單核細胞總數顯著高于對照組，但后帶的單核細胞總數在對照組和實驗組之間無統計學意義。Barbin等[2]將CFA與牛二型膠原蛋白(typeⅡbovine collagen，CⅡ)混懸液注射入大鼠尾部，5 d后在同一部位進行二次注射。實驗組的IL-1β、TNF-α分泌水平明顯高于對照組，表明組織處于急性炎癥期。而IL-10的表達量卻低于對照組。同時組織學分析發現CFA組TMJ髁突頂端區域纖維層、增生層厚度明顯低于對照組，同時實驗組所有動物均表現出髁突軟骨和軟骨下骨膠原纖維退化，膠原纖維數量減少。McIlwrath等[3]通過將CFA注射入TNF-α缺失小鼠顳下頜關節內并聯合結腸刺激構建了“雙重打擊”TMD炎癥模型。具體的構建過程如下：TNF-α受體缺失小鼠麻醉后于TMJ關節腔內注射CFA，稱為一次打擊。三周之后麻醉小鼠，將聚乙烯管插入結腸內，再通過注射器注入芥子油，稱為二次打擊。行為學反應測定結果表明CFA誘導的實驗動物單側頭部抽離閾值顯著降低，在注射后第一天降低幅度達到最大，提示動物可能對機械刺激更加敏感，在第五天恢復至基線水平。而熱平板實驗結果在野生型和突變型小鼠之間沒有差異。細胞因子檢測結果顯示促炎因子在CFA刺激后明顯增加，尤其是在誘導后的第14天，例如TNF-α、CCL5、CXCL9、CCL2、CXCL10等，提示組織可能處于急性炎癥期。CFA誘導的小鼠對福爾馬林注射入唇引起的急性炎癥反應程度更加劇烈，表明二者可能存在協同作用。筆者認為CFA是目前動物實驗常用的免疫誘導制劑，可以使抗原持續釋放，同時又能非特異性地誘導機體的免疫性應答，一般多用于誘導實驗動物的初次免疫。但注射CFA而導致的局部組織炎癥、肉芽腫性改變，是否會對實驗產生不良影響，目前仍需要驗證。且CFA誘導制劑起效快，失效也快，不適合進行短期暴露。同時利用CFA的大多數動物模型都集中在小型嚙齒動物上，因此在大型動物模型中將需要更多的研究，以確保結果的普適性。

1.2 卵蛋白誘導類風濕性關節炎(rheumatoid arthriti，RA)是一種自身免疫性疾病，可累及手足小關節和顳下頜關節，同時伴有全身的其他表現。血管生成是其發病機制的重要組成部分，血管生成可以促進局部炎癥細胞遷移和疼痛受體的增加。因此檢測血管翳生成情況是評估RA活動性及不同療法效果的重要內容。Liu等[4]創建了卵蛋白誘導兔關節炎模型(ovalbumin induced arthritis，OIA)，使用縱向能量多普勒血流顯權像(power doppler imaging，PDI)和對比增強超聲(contrast-enhanced ultrasound，CEUS)測量來評估疾病不同階段的血管生成情況，并分析測量值與血管生成的不同病理指標之間的相關性。具體模型建立方法如下：雄性新西蘭大白兔作為實驗組注射雞蛋清的白蛋白和CFA的混合液，對照組接受等量生理鹽水注射。16周后，使用超聲(ultrasoun，US)作為常規評估手段，超聲引導下對OIA兔膝關節滑膜進行活檢，免疫組化檢測CD31和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達。結果顯示：第6～12周，OIA兔的滑膜中CD31和VEGF表達增加，同時其表達量與能量多普勒圖像分級、CEUS分級和峰值強度呈顯著正相關。將功率多普勒圖像等級、CEUS等級和峰值強度，尤其是CD31表達量結合時，準確地表明了RA兔模型中滑膜血管化的程度。筆者認為新西蘭大白兔體型較大、體質結實、成熟早、生長快，由于其耳大、皮膚白色和血管清晰等特點，是一種用于研究RA疾病的理想動物。同時該動物模型成功模擬了人類RA的疾病進程，實驗兔在第6～8周出現早期疾病表現(炎癥)，在第8～12周出現中期疾病表現(血管翳形成)，在第12～16周出現晚期疾病表現(纖維化)，為學者了解RA的發病機制打下了深厚的實驗基礎，同時有利于學者更好地對RA病情進行評估。但目前由種屬差異、飼養環境不同帶來的實驗結果的差異仍然是一個急需解決的問題。

1.3 膠原酶、膠原抗體誘導骨關節炎(osteoarthritis，OA)的治療藥物選擇十分有限，需要替代治療。大量臨床數據表明，粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)可能是人類OA的治療靶點。Lee等[5]通過構建膠原酶誘導性骨關節炎模型(collagenase induced arthritis model，CIOA)，在大鼠關節腔內注射Ⅱ型膠原酶對照組注射生理鹽水，在CIOA誘導成功后，腹腔注射GM-CSF單克隆抗體，第23天出現了持續性疼痛，組織學檢測證明該組出現了明顯的軟骨損傷。半月板損傷是膝關節骨性關節炎發生和發展的危險因素之一，但聚焦在半月板損傷上的動物模型卻鮮有報道，在CIOA模型中，還沒有關于半月板退行性變的研究。在這種模型中，高純度的膠原酶被注入關節內，損傷了關節韌帶，導致關節不穩定。Utomo等[6]構建了這種CIOA模型，C57BL/6小鼠關節內注射膠原酶誘導膝關節骨關節炎。分別于1 d、3 d、7 d、14 d、28 d、56 d處死小鼠，取膝關節進行組織學分析。取16周齡未誘發骨性關節炎的小鼠膝關節作為對照。經硫胺染色切片評估半月板損傷、半月板脫出和關節軟骨損傷。結果表明半月板損傷與關節軟骨損傷發生在同一時間，半月板退行性變發展主要依靠對表面結構、細胞密度和基質染色的評估，從第14天開始，這三個參數與對照組相比都有隨時間增加的趨勢，CIOA組膝關節的半月板損傷和關節軟骨損傷呈中度相關。這些結果表明CIOA模型是研究半月板損傷與OA進展相關性的作用的重要模型，并可以為OA治療方法研究奠定基礎。Matsuo等[7]以C57/BL小鼠為實驗動物，通過皮下注射膠原單克隆抗體合劑構建的實驗鼠被稱為膠原抗體誘導的關節炎模型(collagen antibody induced arthritis model，CAIA)，然后進行Col1a2-GFP小鼠的骨髓移植。Col1a2-GFP轉基因小鼠在傷口愈合過程中及肝纖維化、肺纖維化和脂肪組織纖維化模型中出現的成纖維細胞，可以產生Ⅰ型膠原纖維并表達GFP，被稱為GFP陽性細胞。膠原抗體注射后(第0天)，GFP細胞數量在第5～8天達到頂峰，之后10 d內持續升高，然后逐漸下降。同時發現CAIA小鼠組織中出現大量的的GFP細胞。同時還發現所有的GFP陽性細胞均表達成纖維細胞所有的標志蛋白，因此認為小鼠體內的GFP細胞均為成纖維細胞。筆者認為CAIA、CIOA模型操作簡單、損傷可控和可重復性高,但至少四周后才能出現OA樣病變，耗時較長；Matsuo等[7]構建的CAIA動物模型對于RA的病理學研究上意義非凡，但對于RA(類風濕性關節炎)動物的行為學表現、細胞學以及免疫學水平的研究卻沒有涉獵。

1.4 血管內皮生長因子誘導Shen等[8]以48只10～12周齡的SD大鼠為實驗對象，分為VEGF注射組、生理鹽水注射組、空白對照組，每組各16只，分別在1、2、4、8周取材，每次取四只，HE染色觀察發現與其他兩組相比，VEGF注射組髁突軟骨肥大層厚度明顯變薄，且隨時間延長，厚度進一步降低；在第4周、第8周，髁突軟骨層出現空泡性變、變性等病理學改變；軟骨細胞多糖含量明顯降低，軟骨細胞排列逐漸變得紊亂；從第2周開始，VEGF組Mankin評分(學術界公認的對骨性關節炎軟骨退變程度進行評價的通用標準)明顯高于其他兩組，提示該組退行性病變更加明顯。此外Micro-CT顯示VEGF組出現了軟骨下骨的骨性病變、局部硬化，同時骨小梁數量和骨小梁排列明顯高于其他組。免疫組化分析顯示：VEGF組MMP-9、MMP-13明顯高于其他組，且Tunel陽性細胞數明顯多于其他組。實驗證實VEGF可能通過VEGF2受體上調軟骨細胞中基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)和MMP-13的表達，導致軟骨細胞凋亡，從而導致軟骨退變，該模型可以用來探討顳下頜關節骨關節炎(temporal mandibular joint osteoarthritis，TMJ-OA)的分子機制。筆者認為大鼠關節腔內注射VEGF的確可以使大鼠變現出OA的基本病理變化：軟骨退變、軟骨下骨吸收，為探討TMJ-OA發病的分子學機制建立了一個成功的動物模型。但誘導周期為56 d，相對較長。且在軟骨生長過程中，VEGF在滑膜細胞和軟骨細胞中表達，VEGF及其受體均在淺表軟骨細胞層中被檢測到，如何排除內源性VEGF的干擾也是該模型急需解決的問題。

1.5 木瓜蛋白酶/單碘酸鹽(monoiodate，MIA)Guzman等[9]以雄性Wistar大鼠為實驗對象，將單碘酸鹽注入大鼠關節腔內，分別在注射后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、28 d和56 d處死取樣。在MIA注射后第1天，組織學觀察發現脛骨平臺區域出現大范圍的軟骨細胞變性，并伴有輕度到中度的淋巴細胞、巨噬細胞和漿細胞浸潤；在第7天可觀察到破骨細胞數量增加，受損壞死的軟骨細胞和軟骨下骨連接在一起；在第14天梭形細胞取代了原有的軟骨下骨髓，并與正常的骨小梁，骨髓細胞之間界限清楚；在第28天，出現多灶性骨小梁塌陷和碎裂，碎裂骨被大量破骨細胞包圍，偶可見軟骨下硬化區域。Cledes等[10]以雄性新西蘭大白兔為實驗對象，關節下腔單碘乙酸鈉溶液，分別在10 d、20 d、30 d、40 d麻醉后處死取材。實驗結果如下：(1)髁突軟骨和軟骨下骨改變：在第10天，實驗組病變主要集中在關節的前部和中央區，損傷區軟骨細胞增厚，軟骨下骨出現薄薄的結膜凹陷，骨軟骨連接的完整性被破壞，髁突軟骨的4層典型結構消失；在第20天軟骨變薄，在關節內側被纖維組織替代，軟骨下骨出現吸收；而在30 d時，軟骨完全被纖維組織替代；40 d時，關節腔內有一大片無軟骨的損傷區，軟骨下骨外露，其肥厚層(下層纖維軟骨層)顯露出來。觀察可以發現軟骨細胞形成一條粗大的連續線，清楚地將小的骨缺損與軟骨下骨分開。40 d時，關節間盤發生穿孔，并在雙板區層顯示骨化過程。(2)滑膜變化：MIA注射組兔的關節滑膜均出現纖維化、增生，前、后隱窩絨毛發育一系列病理變化。Molinet等[11]向雄性新西蘭大白兔分別注射MIA、木瓜蛋白酶作為實驗組，在實驗開始的第15天、第30天、第45天麻醉后處死取材。實驗結果如下：(1)MIA誘導組：髁突表面發生變形，軟骨細胞稀少，髁突形態和軟骨細胞細胞膜消失，甚至出現空斑。在45 d時，MIA組所有變量的平均值的增加比對照組更明顯。(2)木瓜蛋白酶誘導組：髁突關節面不規則，細胞外基質明顯增多，中層軟骨細胞排列紊亂，深層軟骨細胞增生。關節囊變薄，中層軟骨細胞呈孤立排列，髁突和關節盤之間的關節間隙明顯縮小。(3)關節盤改變：30 d時仍有周邊撕裂，軟骨細胞數量較少，外緣不規則，但關節盤形態仍可保持但中部出現穿孔，邊緣軟骨細胞稀少。在木瓜蛋白酶誘導的TMJ-OA中觀察到關節盤有撕裂的跡象，但其中仍可見軟骨細胞。筆者認為Guzman等[9]在關節內注射MIA可以誘導關節軟骨的丟失，并導致類似OA的軟骨下骨病變的進展。提供了一種快速和微創的方法，在嚙齒類動物中復制OA樣病變，結果可靠、造模方便。Cledes等[10]選擇雄性動物作為實驗對象，有效地規避了雌激素對于骨、軟骨代謝的影響，且MIA注射僅在關節下腔進行，以獲得退變過程的平穩進展，并符合人類臨床上主要涉及髁突軟骨的病理發展。MIA在第30天便可誘導動物出現關節炎晚期表現，這與其他造模方法相比，誘導速度更快，這可能與MIA對軟骨細胞的直接作用有關，比機械應力單獨引起的代謝變化更快。此外用化學誘導觀察到的變化不僅與退變過程一致，而且與軟骨損傷修復過程相吻合的。因此，所有關節的缺損周圍都有肥大的軟骨反應，與骨關節炎的初始和修復階段一致(軟骨細胞增殖，新陳代謝增強，軟骨增厚)。但對于OA樣表現動物的觀察方法過于局限，基于現代免疫學發展基礎上的免疫組化染色以及Micro-CT觀察或可以得到更為翔實的實驗結果。

1.6 雌二醇誘導瞬時受體電位香草酸亞型1(transient receptor potential vanilloid-1，TRPVl)是一種非選擇性的陽離子通道，最初被鑒定為辣椒素受體，主要表達于外周神經系統，不僅在滑膜內分布的神經和血管中表達，而且在大鼠和人顳下頜關節的滑膜襯里細胞中也有表達，在辣椒素、酸、熱、內源性配體等疼痛性刺激的檢測中發揮關鍵作用[12]。TRPV1的表達和致敏受神經生長因子(nerve growth factor，NGF)的調控。在感覺神經元中，TRPV1的激活會誘導炎癥神經肽的釋放，從而引起神經源性炎癥和疼痛[13]。Wu等[14]以SD大鼠為實驗對象，將大鼠隨機分為5組，假手術組以及4組卵巢切除鼠(ovariectomize，OVX)，分別接受劑量為0、20 mg、80 mg或200 mg的雌二醇(estradiol，E2)，連續注射12 d，去卵巢大鼠接受上述劑量的雌二醇后，血漿可產生不同水平的雌二醇，假手術大鼠皮下注射等量的玉米油，并最后取顳下頜關節作為標本。Western blot結果顯示：與假手術組相比，卵巢切除鼠雌二醇以劑量依賴性模式上調TRVP1的表達。之后體外提取原代滑膜細胞，使用雌二醇和LPS(脂多糖)處理滑膜細胞。結果表明雌二醇和LPS均能上調滑膜細胞TRPV1轉錄，單獨應用NGF的誘導作用更顯著，抗NGF血清預處理可以完全阻斷了雌二醇和LPS聯合治療產生的TRPV1的誘導。同時進行的TRVP1激動劑處理滑膜細胞實驗表明：TRVP1可以上調COX-2 mRNA(cyclooxygenase，COX，環氧化物酶)水平。以上結果表明：雌二醇很可能是通過痛覺相關基因(TRVP1)來參與TMJ炎癥或疼痛的形成機制，這有利于頜面外科醫生理解TMD患者疼痛發生的性別差異。Jie等[15]采用與Wu等[14]相同的造模方式，然后使用谷氨酸構建咬肌疼痛模型。結果表明：與對照組相比，谷氨酸可以顯著降低頭部撤離閾值，且降低程度與濃度呈正相關，且雌二醇劑量依賴性加重了谷氨酸誘導的頭部撤離閾值的降低，增強谷氨酸誘導的咬肌傷害性反應。筆者認為過量激素使用會對大鼠短時間造成不可逆的損害，具體的雌二醇劑量如何把控，目前仍需詳加研究。且大鼠飲食的是否含有豆類等可能會使內源性膽固醇升高的食物，實驗中并未詳細說明。Jie等[15]在實驗過程中，為確定動物咬肌注射谷氨酸的適宜濃度，根據谷氨酸濃度效應數據計算半最大效應濃度(concentration for 50%of maximal effect，EC50)，這樣可以確定最適宜的濃度，以便在保證最佳實驗結果的前提下，盡量減少對動物的損害，符合愛護實驗動物的基本原則。

1.7 卡拉膠誘導P2X受體是由細胞外ATP激活的配體門控離子通道家族，在傷害感受中起作用。功能性P2X受體在大鼠的一些感覺傳入神經上表達，在炎癥介質存在下，P2X受體介導的傷害性反應也會增強[16]。為了探討內源性三磷酸腺苷在顳下頜關節痛性致敏中的作用，Oliveira等[17]構建了卡拉膠誘導的關節炎模型，分別給予P2X受體激動劑、P2X受體拮抗劑，觀察其對卡拉膠誘導的顳下頜關節炎性痛敏的影響。實驗結果表明與對照組相比，卡拉膠預處理后，5-羥色胺可以顯著增強誘導產生的傷害反應，而在應用P2X受體拮抗劑后，該誘導作用顯著降低，P2受體拮抗劑與卡拉膠合用可劑量依賴性地降低卡拉膠引起的TMJ痛敏反應。顳下頜關節紊亂病受到生物介質、社會心理、機械運動、外周和中樞的痛覺信號、關節的使用頻率和強度的影響，但對于這些因素之間的相互作用卻知之甚少。而TMD的誘發因素包括兒茶酚-O-甲基轉移酶(catechol-O-methyltransferase，COMT)基因多態性及其報道與疼痛耐受性相關的改變、中樞神經系統功能的改變。當其中一個因素與頜骨負荷過載等觸發因素結合時，就會產生持久性或長期的TM系統敏化[18]。因此為了研究始發因素和各種誘導因素對TMD的致病作用及它們之間的相互作用，Phero等[19]研發了一種咬合功能相關疼痛測試儀，適用于卡拉膠誘導的咬合功能障礙大鼠，使其分別在感染、無感染、COMT抑制劑處理條件下，評估大張口對于咀嚼功能的影響。測試結果表明：卡拉膠注射后動物長咀嚼時間小幅度增加，而在經地塞米松處理后，該誘導作用被削弱了，此外由卡拉膠引起的強烈炎癥可以增強大張口對咀嚼功能的影響，從而導致顳下頜關節功能障礙，這表明局部炎癥與大張口運動對于誘發TMD存在協同作用。據報道，沒有TMD病史的受試者很快便能適應實驗咬合干擾，而有TMD病史的受試者(尤其是有口腔頜面部疼痛史的受試者)臨床癥狀則明顯增加[20]。為了探究先前的疼痛經歷是否會加劇咬合干擾引起的咀嚼肌痛覺過敏。Ding等[21]開發了一種兩次交叉注射卡拉膠建立炎癥性痛覺記憶模型，使用金屬絲抬高咬合，觀察大鼠痛覺過敏相關行為。結果表明：第一次注射卡拉膠后第5天，右咬肌(注射側)的頭部撤離閾值明顯降低，在咬合抬高0.4 mm后，頭部撤離閾值降低程度更為明顯，而注射生理鹽水組在抬高咬合后，頭部撤離閾值無明顯變化，結果表明疼痛記憶可以增強咬合干擾引起的咬肌痛覺過敏。且在拆除頜面金屬絲、恢復咬合后，卡拉膠注射組較生理鹽水注射組頭部撤離閾值恢復至正常水平時間明顯延長，根據以上結果，初步認為炎性疼痛記憶促進了咬合干擾誘發的咬肌疼痛。筆者認為：(1)卡拉膠注射為探討炎癥介質釋放的時程及抗炎藥物對炎癥介質釋放的調控提供了一種重復性好、結果可靠的方法，但Phero等[19]進行的實驗，研究的誘發因素較多，如何設置好各相關因素之間的對照實驗，以及如何設計聯合多因素干預實驗，從而獲得可信的結果仍是一個不小的挑戰。(2)Ding等[21]以SD大鼠為基礎建立的實驗動物模型存在一些缺點，大鼠口腔小，操作困難，且嚙齒類動物均存在夜磨牙習慣，因此難以建立相對穩定的創傷咬合關系。豬、猴、犬等體積相對較大的動物，操作起來更為方便，且咀嚼習慣、食性、TMJ解剖關系、組織結構等與人體更為相似，更加適合作為咬合紊亂的動物模型，但相對來說，上述動物更加難以獲取，價格較為昂貴。

1.8 福爾馬林誘導福爾馬林作為一種傷害性刺激，最早應用于疼痛相關研究的動物實驗。最早在1987年有學者曾以福爾馬林為誘導劑，注射入大鼠爪內，大鼠產生了雙向傷害性反應，嗎啡、哌替啶可以緩解實驗所帶來的痛苦[22]；之后，Shibata等[23]又使用福爾馬林作為誘導劑，廣泛應用于動物電生理實驗，從而使實驗動物再現損傷后疼痛的基本特征。Roveroni等[24]將不同濃度的福爾馬林注入大鼠TMJ區域以創建TMJ實驗性疼痛模型。結果發現，濃度高于1.5%以上的福爾馬林誘導45 min后，其導致大鼠產生的行為反應(包括頭部回縮和口面部摩擦)更加劇烈，類似于卡拉膠誘導的行為反應。在該模型中，通過測量行為傷害性反應來評估TMJ痛敏反應的劇烈程度，例如摩擦口頜面部區域并甩頭。15d-PGJ2中文名稱為環戊烯同類前列腺素，是一種過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)配體，一旦其被激活，可引發一系列連鎖反應，增強免疫調劑作用以及神經保護作用，Abdalla等[25]已經通過相關實驗：將15d-PGJ2(利用納米技術封裝15d-PGJ2，從而降低其有效劑量并提高其利用度而制成的膠束系統)直接注射入TMJ，可以刺激PPAR-γ，從而發揮潛在的抗炎作用。為了評估了PL-15dPGJ2膠束系統在福爾馬林誘導的大鼠顳下頜關節急性疼痛模型中的治療效能，Abdalla等[25]將PL-15dPGJ2注射入大鼠關節腔內，再使用福爾馬林誘導，觀察大鼠的行為學反應，并在誘導后的第1、2、3、7、10、14天處死大鼠，取顳下頜關節組織行相關檢查。結果表明PL-15dPGJ2預處理可以顯著降低福爾馬林誘導所產生的大鼠傷害性行為反應，且PL-15dPGJ2預處理后可以降低血液外滲和白細胞遷移，維持效果長達7 d，與此同時，PL-15dPGJ2改善了促炎細胞因子和趨化因子的蛋白質表達水平。這些結果提示PL-15d-PGJ2制劑具有確切的抗傷害感受和抗炎作用，是治療顳下頜關節或其他關節疾病的炎癥性疾病的潛在選擇。筆者認為福爾馬林誘導大鼠作為急性疼痛模型，存在誘導時間短、誘導效果好，且可重復性高，行為學反應可量化的優點。但在福爾馬林誘導的動物學反應中觀察發現，動物若表現出強烈的摩擦活動行為，而畏縮行為出現頻率就會降低，反之亦然。福爾馬林誘導的摩擦和退縮反應僅在濃度高于0.5%時出現，且在濃度為1.5%及其以上時，所誘導產生的下頜骨運動反應并未增加，表明福爾馬林可能存在一個最適宜的誘導濃度。

1.9 TNF-α誘導TNF-α是炎癥通路中的一種重要的細胞因子，存在于RA患者的滑膜、滑液及血清中。TNF-α通過與多種組織因子和基質蛋白相互作用促進RA的炎癥反應、滑膜細胞異常增殖和凋亡、血管翳生成及軟骨與骨的破壞，推動RA炎癥反應持續性進展[26]。Ruscitto等[27]選用8周齡C57BL/6小鼠作為實驗鼠，顳下頜關節腔內注射重組TNF-α，對照組注射等量生理鹽水，處死后進行相關檢測。結果表明：TNF-α誘導組大鼠出現了急性炎癥，Adamts5(血小板反應蛋白解整合素金屬肽酶-5)、IL1-β表達量上調及細胞外基質轉換增加。實驗結果表明：TNF-α是RA發生發展的重要推動和維持因素，因而進一步研究TNF-TNFRs在RA中作用機制和特點以及尋求針對TNF-TNFRs更加有效的治療方法和藥物是十分必要的。筆者認為RA患者血清中存在較高水平的TNF-α及其可溶性受體，且有研究證實TNF-α與類風濕因子滴度、C-反應蛋白呈正相關關系。因此筆者認為TNF-α不僅可誘導大鼠產生TMJ-RA(temporomandibular joint rheumatoidarthritis，TMJ-RA)，而且其本身也是RA的重要檢測指標之一，因此如何排除內源性TNF-α對誘導實驗的干擾是必須需要考慮的。

1.10 白蛋白誘導環氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acid，EETs)是一種內源性抗炎化合物，可以減輕炎癥，并具有鎮痛、抗纖維化和降壓作用。而可溶性環氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolas，sEH)的活性作為EETs生物利用度的主要決定因素之一，可將EETs迅速轉化為活性較低的形式，從而降低生物效應。抑制sEH酶已被用作降低傷害感受和炎癥的一種策略[28]。Quinteiro等[29]在Wistar大鼠背部皮下注射含有CFA的甲基化的牛血清蛋白(methylated bovine serum albumin，MBSA)乳劑，從而誘導產生一種以MBSA為抗原的遲發型超敏反應(delayed type hypersensitivity，DTH)的實驗模型。白蛋白誘導的大鼠顳下頜關節關節炎引起了高度傷害性反應，白細胞聚集，促炎細胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6、CINC-1(中性粒細胞趨化因子)、IL-17、IL-23和IFN-γ的表達上調。TPPU(一種sEH酶抑制劑)外周預處理可抑制關節炎誘導的顳下頜關節傷害性反應和白細胞遷移。此外，TPPU可降低TMJ組織中促炎細胞因子的局部濃度，上調抗炎細胞因子IL-10的表達。TPPU可顯著降低誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，INOS)的蛋白表達，但不改變甘露糖C樣受體1(monoclonal antibody to mannose receptor C type 1，MRC1)的表達。該研究證實TPPU外周給藥可減輕顳下頜關節實驗性關節炎的過敏性痛覺和炎癥，表明抑制sEH酶可能成為減輕關節炎疼痛和炎癥病理效應的新靶點和新策略[30]。Kato等[31]在DBA大鼠尾部注射牛Ⅱ型血清白蛋白(含有乙酸-完全弗氏佐劑)，并在21 d后進行加強免疫，同時對動物進行關節炎癥評分[32]。結果發現與對照組相比，實驗組TRAP(tartrate resistant acid phosphatase,抗酒石酸酸性磷酸酶)陽性細胞多核細胞、ALP(alkaline phosphatase，堿性磷酸酶)陽性細胞數量明顯增高，表面破骨細胞分化活躍同時堿性磷酸酶活性顯著提高；采用熒光定量PCR技術分析發現骨形態發生蛋白相關基因如Runx2、Alph、Bglap i3表達水平均顯著降低，關節炎癥評分也從第21天到第30天持續走高；關節炎癥指標基質金屬蛋白酶-13(matrix metalloproteinase，MMPS)表達上調、脾脹重量也普遍增大。而在進行OP3-4[一種類似骨保護素(OPG)的肽，OPG上有3個RANKL結合位點]注射治療后，在OP3-4劑量較高時，會降低關節炎評分。結果表明OP3-4顯著降低了CIA誘導的血清CTX(Ⅰ型膠原羧基端肽序列，反映機體骨代謝的重要標記物)的水平。OP3-4可以防止骨質流失，抑制骨吸收，促進骨骼形成。筆者認為白蛋白注射誘導同樣時間長，且往往只能模擬TMD誘發因素的某一項，且主要聚焦在嚙齒類動物，針對其他動物的實驗研究仍需努力。

1.11 IL-1β誘導有研究發現顳下頜關節疼痛患者關節滑液中的IL-1β、IL-1RⅡ明顯高于正常值[33]，I-1β(白介素1-β)可誘導TMD患者中異常分子的增加，主要包括：IL-6、IL-8、RANKL(單核細胞系破骨細胞前體上表達的與RANK作用的一種跨膜蛋白)、MMP3、MMP13等[34]。IL-1β通過促進滑膜細胞和軟骨細胞的合成并釋放前列腺素E(prostaglandin E，PGE)、膠原酶和過量的MMPs，并誘導其釋放磷酸酶A，從而抑制蛋白多糖的合成，間接參與TMD的病因機制。Chu等[35]為了探究細胞周圍基質(pericellular matrix，PCM)分子在顳下頜關節軟骨細胞和關節盤細胞的合成代謝和分解代謝反應中的作用，在促炎分子IL-1β誘導前先用PCM分子預處理細胞以刺激骨關節炎發生。結果表明IL-1β處理后，與基質降解相關的基因如：MMP-3、MMP-9、MMP-13、iNOS均表達上調，而軟骨基質基因如：ACAN、COL-1、COMP均表達下調。這些結果表明IL-1β的確可以誘導TMJ-OA模型產生。筆者認為TMJ-OA炎癥反應過程中，IL-1β是主要的促炎細胞因子，它可以刺激軟骨細胞釋放炎癥介質，導致組織損傷并促進MMPs的產生。IL-1β可能是顳下頜關節關節盤病變過程的主要促炎細胞因子，其可能在TMJ低度炎癥反應環境中促進炎癥反應，并誘導關節盤細胞產生MMPs降解細胞外基質(extracellular matrix，ECM)。因此筆者認為IL-1β具有誘導效能高、誘導時間短等優點。但IL-1β與IL-1α之間還存在交互作用，具體在誘導過程中兩者之間是否互為干擾，目前尚未可知。針對于細胞實驗，IL-1β已經有了確切的濃度和誘導效能、但使用IL-β誘導動物產生TMJ-OA的實驗目前比較少，聚焦于實驗動物的誘導效果，IL-β的表現值得期待。

2 不同機械刺激誘導方法及其評價

2.1 單側夾板固定誘導支持下頜運動是顳下頜關節的主要作用之一，而小型動物顳下頜關節的機械特性難以確定，為了確定兔的解剖結構和生理特性、行為學特征是否可作為TMD實驗動物，Henderson等[36]以新西蘭大白兔為實驗對象，通過牙科酸蝕劑加光固化樹脂將1 mm厚的金屬夾板固定在右側上下頜磨牙上，6周后處死取材。C-Fos免疫組織化學(IHC)檢測Fos陽性神經元數量(Fos-LI，以下簡稱Fos陽性神經元)可作為傷害性活動的一種量度。番素-O固綠染色觀察纖維軟骨細胞的分布和形狀，結果顯示夾板組兔子(以下簡稱夾板兔)行為學反應程度弱于對照組，夾板兔組中觀察到了更多的Fos陽性神經元，夾板兔組組織學觀察發現沿著髁突前后徑長軸，糖胺多糖(glycosaminoglycan，GAGs)的分布中斷，不能覆蓋整個前后徑長度。TMJ上組織的機械探測的敏感性增加、三叉神經尾亞核中Fos陽性神經元的增加以及TMJ傳入神經的興奮性增加。機械超敏反應表現中觀察到的變化可能是兔模型的一個重要特征，增加了其與臨床表現的相關性。筆者認為本實驗采用兔為實驗動物，是因為兔顳下頜關節具有與人類相似的側向和前后向運動，而且經實驗誘導產生的病理改變與人類TMD的病理改變相似，該動物模型是研究人類TMD的理想實驗動物模型。本實驗用金屬夾板加光固化樹脂的方法，造成兔局部咬合抬高的咬合紊亂動物模型，克服了磨耗等因素造成干擾減弱對實驗結果帶來的影響。

2.2 頜面金屬絲抬高咬合誘導El-Hakim等[37]發現糖基化終末產物受體(receptor for advanced glycation endproducts，RAGE)是免疫球蛋白超家族的細胞表面受體，在多種細胞類型中表達。研究已經將RAGE定義為一種模式識別受體，其結合內源性S100/鈣粒蛋白，淀粉樣蛋白β肽和HMGB-1(或兩性霉素)，通過激活的信號轉導途徑影響特定的基因表達。具體而言，許多促炎反應，例如由蛋白激酸磷酸酶(mitogen activited protein kinase，MAPK)、核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)、活性氧和TNF、IL-1、TGF-β(transforming growth factor-β，轉化生長因子-β)等其他促炎介質協調的炎癥反應是由RAGE-配體相互作用引起的。為了研究非侵入性方法構建的TMJ-OA動物模型是否有效，以及RAGE在TMJ-OA發生發展中的作用。Matias等[38]以C57BL小鼠為實驗對象，使用牙科樹脂加黏結劑將1.2 mm厚、2.5 mm長的“U”形金屬絲固定在第一臼齒上，U形開口朝向遠中，確認金屬絲無移位后，在第2、4、6、8周處死小鼠取材。組織學檢測發現：咬合抬高組小鼠(以下簡稱實驗鼠)軟骨顯示出表面顫動，實驗鼠Mankin評分遠高于對照組，差距具有統計學意義，免疫組化染色結果顯示：實驗鼠MMP13、TGF-β1、絲氨酸肽酶1(htra serine peptidase 1，HtrA1)遠高于對照組。筆者認為由于錯合模型的機械發病機制類似于人類OA的發病過程，所以這種模型是探討TMJ-OA的發病機制和治療方法的理想選擇。此外該模型還具有造價低、高度可重復、非侵入性等優點。盡管咬合抬高可以誘導動物發展為早期顳下頜關節OA，但這并不能模仿人類疾病的自然發作和進展，若能創建一種錯頜畸形小鼠模型，以更自然的方式誘導發生TMJ-OA，以更好地模擬人類疾病的進展，這將是一個全新選擇。

2.3 錯合障礙實驗模型Jiao等[39]通過正畸方法設計了錯頜畸形，稱為錯合障礙實驗模型(experimentally created disordered occlusion，ECDO)。以SD大鼠為實驗對象，將直徑約1 mm的彈性橡皮筋插入左上頜第一和第二磨牙之間以及右下頜第一和第二磨牙之間。這樣，第一磨牙在橡皮筋的彈力作用下向內側移動。一周后，將橡皮筋更換為自固化樹脂以保持間隙直到實驗結束。初次操作后4周，咬合紊亂程度進一步加重，使用相同的方法向遠中推動左上第三磨牙和右下第三磨牙。在此手術后的第8周和第12周，可以觀察到明顯的骨髓性骨質損失伴隨著髁突軟骨降解，隨后軟骨細胞的凋亡增加，并發現其與性別有關并隨時間進行性發展，并且伴隨著OA樣病變。此外，在發生降解的關節軟骨中發現了具有增強的吞噬活性的CD163+(清除劑受體半胱氨酸的超家族的富含超家族成員)軟骨細胞數量增加，這提供了一種治療TMJ-OA的新策略。筆者認為該模型較好地復刻了人類TMJ-OA進程中軟骨改變、促炎因子分泌增加、組織學表現，因此可作為研究TMJ-OA的合適模型。然而，Jiao等[39]的實驗結果表明：OA的發生發展可能與性別相關，但并沒有給出具體的理由，且該種造模時間最長達12周，同時由于大鼠和人類之間的咬合障礙類型和TMJ結構的明顯差異，這種OA樣病變不能完全與人類TMJ-OA相等。

2.4 單側前牙反合模型Wang等[40]以SD大鼠為實驗對象，將一根金屬管(長約2.5 mm，直徑3 mm)黏結在大鼠上前牙上，另一金屬管(長約4.5 mm，寬約3.5 mm)黏結在下前牙上，用力彎曲使金屬管唇傾135°，使用水門汀固定，構建了單側前牙反模型(unilateral anterior crossbite，UAC)。在第3天、1周、2周后處死取材，對實驗組和對照組大鼠均進行組織學觀察、免疫組化染色、軟骨厚度測量和圖像分析、熒光定量RT-PCR。實驗組中誘導了髁突軟骨中細胞和局部無細胞區域的不規則排列。觀察到軟骨細胞的數量和大小減少，軟骨肥厚層厚度減小；增殖細胞核抗原抗體(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、COLⅡ(typeⅡcollagen，Ⅱ型膠原蛋白)、AGG(aggrecan,蛋白聚集多糖)和TIMP-1(tissue inhibitors of metalloproteinase 1，基質金屬蛋白酶抑制因子-1)的mRNA表達水平也有所下降；在不同時間點，MMP3、MMP9和MMP13的mRNA表達水平也有所增加。實驗結果表明UAC模型可誘導大鼠顳下頜關節軟骨退化。咬合調整對于實現最佳的牙齒咬合和咀嚼功能是必要的[41]，實驗性錯合模型對于誘導咀嚼肌變化的分子學機制研究，至今鮮有報道。Zhang等[42]以與Wang等[40]相同的造模方法，不同的是，Zhang等[42]主要研究UAC對于提下頜肌-咬肌、降下頜肌-翼外肌的影響。在同樣的時間節點處死動物后取材，測量咬肌、比目魚肌、翼外肌、趾長屈肌的重量指數，結果發現在3 d～2周內，UAC組大鼠與對照組相比，各肌肉的重量均無差異。與對照組相比：(1)UAC組αB-crystallin(αB-晶狀體蛋白，一種熱休克蛋白，可阻止應激條件下蛋白質聚集，小鼠比目魚肌再加載損傷可促進其表達)由于UAC裝置的存在其表達下調，在拆除UAC裝置后，表達轉而上調，差異具有統計學意義；(2)UAC組Desmin(結蛋白，一種中間絲蛋白，在受傷的骨骼肌纖維中含量增加，受損的肌肉組織被炎癥細胞去除，表明肌肉受傷后正在迅速修復)表達量差異無統計學意義，在拆除誘導裝置后也無明顯變化。炎癥反應表現為UAC組炎癥細胞的浸潤和TNF-αmRNA表達的增加及纖維化反應，表現為Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的mRNA表達增加。這些反應因拆除誘導裝置而部分恢復。Liu等[43]為了驗證UAC誘導的焦慮和相關行為，神經生理學和生化變化并探究咬合異常和焦慮之間的神經傳導通路，采取了與Wang等[40]一樣的UAC造模方式。造模后UAC組分別進行迷宮測試、開放場測試，使用電流和電壓鉗夾技術記UAC組和對照組LHb神經生理特性；檢測外側韁核(lateral habenular nucleus，LHb)中囊泡型谷氨酸轉運蛋白2(vesicular glutamate transporter 2，VGLUT2)的表達變化，來研究UAC誘導對焦慮的潛在反應；使用Western blot(蛋白印跡實驗)檢測三叉神經中腦核(mesencephalic nucleus of trigeminal nerve，Vme)中VGLUT2蛋白水平；使用生物素標記的葡聚糖胺作為示蹤劑進行神經元束示蹤，共聚焦激光掃描顯微鏡觀察。結果表明LHb神經元活性升高，LHb神經元中VGLUT2 mRNA上調，咬合異常和焦慮之間的神經傳導通路與LHb到Vme的神經元有關。該實驗證實了UAC可激活LHb神經元以及牙周本體感受通路，為Vme提供興奮性輸入并使大鼠產生焦慮。這些發現為抑制LHb的活性以減弱TMD的生理和心理影響提供了依據。為了研究ERK(extracellular signal-regulated kinase，ERK)1/2和p38在口面部痛覺過敏中三叉神經亞核(Vc)中的作用以及Vc內不同細胞中p-ERK1/2和p-p38(磷酸化-絲裂原活化蛋白激酶p38抗體)之間的關系，Jing等[44]采用了Wang等[40]一樣的UAC模型，不同的是在建模前將p-p38抑制劑和ERK1/2抑制劑注射入大鼠體內，后在不同時間段測定壓力疼痛閾值(pressure pain threshold，PPT)。并通過免疫熒光、Western blot檢測ERK1/2和p38的表達。結果顯示：從第1天到第7天，UAC模型誘發了頜面部痛覺過敏，PPT值在第3天達到峰值。在此期間，ERK1/2在同側Vc中被激活，表達量在第1天達到峰值。p-p38也在同側被激活，表達量在第3天上達到峰值。ERK1/2在神經元中的表達最多，在小膠質細胞中也觀察到表達，但表達量較少，而p-p38在神經元和小膠質細胞中的表達幾乎相等。U0126(ERK1/2抑制劑)預處理抑制了ERK1/2和p-p38的表達，并抑制了UAC誘導的痛覺過敏。p-p38抑制劑在范圍和時間方面產生了類似的效果。綜合起來，這些數據表明UAC通過在Vc中的神經元和小膠質細胞激活ERK1/2和p-p38來誘導中樞致敏，從而引起口面部痛覺過敏，從而潛在地影響ERK1/2在p-p38激活期間的作用。為了觀察和分析在TMJ-OA的發生發展過程中上機械壓力(mechanical pressure，MS)與性激素之間的相互作用，同時利用分子生物學分析發現TMJ-OA病易感基因，闡明TMJ-OA發病的部分機制。Ootake等[45]以C57BL/6J小鼠為實驗對象，通過性腺切除加金屬板導致前牙反合的方法誘導TMJ-OA。小鼠切除性腺(OX組)后，通過復合樹脂將金屬板黏接在前牙舌側，使小鼠前牙咬合錯亂(MS組)，4周后處死大鼠。與對照組相比，所有實驗組的破骨細胞數量顯著增加；番紅固綠染色結果顯示：ORX(orchidectomy，睪丸切除)+MS和OVX(oophorectomy，卵巢切除)+MS組中從表面到成熟軟骨層的軟骨細胞數量減少，軟骨細胞表面不均勻；MMP-13在軟骨細胞中表達量顯著上調，與骨形成相關的Collal、Spp1和Bglap的mRNA水平顯著降低。筆者認為盡管臨床上很少出現單側前牙反合情況，但UAC模型卻提供了證據表明前牙反合在TMJ-OA的發展中有很大作用，并為TMD治療的研究提供了實驗基礎，同時Ootake等[45]創建的動物模型可以評估MS、性激素在TMJ-OA發生發展中的作用，還可以研究MS對于性激素在TMD-OA進程中發揮作用的影響。機械方法誘導的錯合動物畸形模型效果好、可重復性高、花費少，但它們的病理狀態并不能完全等同于人類。當前研究出人類和動物有關于TMD本質上到底有多大區別仍然十分重要，這同時需要花費大量的時間研究。

2.5 結扎絲誘導咬合紊亂模型有研究表明TGF-β1可能在顳下頜關節關節炎的病因學中起關鍵作用。在Zheng等[46]研究中，使用三種不同的嚙齒動物模型TMD大鼠、CED(Camurati-Engelmann，Camurati-Engelmann，卡-恩二氏病)小鼠、老年小鼠，研究TGF-β1信號傳導在TMJ-OA進展中的作用，進一步分析以闡明TGF-β1活性的抑制是否會減弱TMJ-OA進展。具體實驗方法如下：在第一、二磨牙之間插入直徑0.25 mm的正畸結扎絲，在上頜第一磨牙上形成結扎絲結，使TMJ承受異常的機械載荷。該模型早期誘導大鼠產生類OA樣改病變如纖維軟骨層明顯減少，鈣化軟骨層變薄，軟骨退化，伴有蛋白多糖的廣泛丟失和軟骨細胞總數的減少。在顳下頜關節成分中也檢測到與年齡相關的變化，這些都是TMJ-OA患者常見的病理表現。TMD大鼠軟骨下骨組織中TRAP陽性細胞數明顯增加，Osterix陽性骨祖細胞數(Osterix，特殊蛋白轉錄家族成員，具有鋅指結構，是成骨細胞特異性轉錄因子，在所有發育骨的成骨細胞和骨細胞中表達，是成骨細胞分化和骨形成過程中所必需的關鍵物質)明顯減少，同時伴有部分軟骨下骨丟失。μCT圖像顯示CED小鼠顳下頜關節軟骨下骨量分布不均，提示骨形成障礙。TMD大鼠腹腔注射TGF-β受體抑制劑(TβRI)后，軟骨和軟骨下骨髓中磷酸化Smad2/3陽性細胞數顯著減少，表明TGF-β信號被有效地抑制；值得注意的是，藏紅素O染色Mankin評分和OARSI(國際骨關節炎研究協會)評分判定，注射TβRI的TMD大鼠軟骨變性得到緩解。此外，注射TβRI后，軟骨下骨髓中TRAP陽性細胞百分率明顯降低，而Osterix陽性細胞百分率明顯增加，骨體積顯著增加，提示抑制TGF-β1信號可以減輕TMJ-OA早期的軟骨退化和骨吸收。筆者認為Zheng等[46]所進行的科學研究思路清晰，嚴格遵守科研實驗設計的對照原則，使其實驗結果更加有說服力，且整個實驗嚴謹、客觀、設計合理，可成為有關于TMD-OA相關科研實驗的典范。但仍有一些瑕疵，TGF-β1在正常TMJ-OA進程中也會產生，如何排除內源性TGF-β1的干擾，仍需要考慮。

3 不同手術誘導方法及其評價

3.1 關節盤前移位模型內質網應激的軟骨細胞凋亡和ECM降解增加，導致軟骨完整性喪失。此外，有學者報道，在TMJ-OA的大鼠模型中，ER應激誘導髁突軟骨變薄[47]。這些間接證據表明，內質網應激途徑與軟骨細胞凋亡過程有關，并會誘發OA的進展。然而，目前缺乏直接證據表明ER應激與TMD進展相關。為了研究髁突軟骨中內質網應激相關蛋白的表達及其在TMD發展中的潛在作用，Xu等[48]使用外科方法建立成年兔的關節盤前移位模型(anterior disc displacement，ADD)，具體方法如下：兔被麻醉后，沿右側顴弓制備3 cm切口，暴露顴骨-顳骨鱗部傷口。之后分離出整個顴骨，在顴弓最上緣鉆孔，然后用彈性橡膠帶將關節盤前部向前拉并固定在孔上。外科模型制備后，可以觀察到軟骨細胞凋亡數增多，細胞密度下降。ADD組大鼠在手術后1或2周表現出軟骨退化的變化，伴有蛋白聚糖的丟失，軟骨細胞密度的降低和軟骨厚度的減少。種種證據表明ADD的確可作為誘導TMJ-OA的可靠方法。屬于HMGB蛋白家族的高遷移率組框2(HMGB2)已被確定為維持人類關節軟骨淺表區(SZ)軟骨細胞存活的重要轉錄調節因子。據報道，HMGB2基因的缺失將導致OA樣軟骨變化，同時HMGB2缺失的小鼠也表現出更嚴重的早發性OA[49]。因此為了驗證HMGB2可以調整軟骨細胞的存活率從而參與TMD進程中軟骨內壓力的刺激傳導，Zhou等[50]使用靜水壓法(hydrostatic method，HP)及ADD法構建SD大鼠髁突軟骨細胞的體外模型，HP處理細胞后，β-連環蛋白(一種轉錄共激活劑，可調節參與細胞增殖和分化的主要基因，在OA軟骨細胞中發現總β-連環蛋白水平顯著增加，則提示Wnt/β-連環蛋白途徑的活化)的mRNA表達降低，而β-連環蛋白的蛋白表達顯著增加。HMGB2基因的表達上調，其表達調節了軟骨發育相關因子Col-Ⅱ、MMP13和β-連環蛋白的表達。在兔模型中的結果還發現，ADD處理后，HMGB2和β-連環蛋白的表達增加。Col-Ⅱ的表達隨著靜水壓的增加而增加。且在實驗期間，術后所有動物體質量沒有明顯變化。ADD組實驗兔中，1～2周時可以觀察到組織學TMJ髁突軟骨變薄和細胞排列紊亂，組織學評分中部分軟骨表面結構缺失。一些髁突軟骨在4周時恢復其厚度。所有ADD組的兔子的髁突軟骨細胞逐漸重新排列，并且在8周時厚度增加到正常水平，表明軟骨形成加速。筆者認為ADD手術法要在顴骨上方切開一個切口，并需要顳骨鱗部顴骨連接處造成骨折，手術方法本身就對結果產生影響，這是該模型的局限性。而HP處理軟骨細胞后可能會影響β-連環蛋白的核易位，從而導致mRNA和蛋白質表達水平之間的差異，如何提高HP誘導的穩定性仍是需要改進的地方。

3.2 關節盤切除及穿孔模型IL-37是一種新型抗炎細胞因子，是IL-1家族中新發現的成員，可抑制炎癥及免疫反應[51]。盡管學者們對IL-37進行了孜孜不倦的研究，但對于IL-37及其變異體在軟骨細胞中的分布卻鮮有報道，關于IL-37對炎癥信號通路的影響更是知之甚少。Luo等[52]為了研究IL-37及其變異體在軟骨細胞中的表達以及IL-37在炎癥期間如何影響軟骨細胞。以SD大鼠為研究對象，通過手術方法制造TMJ-OA模型：沿顴弓做一斜形切口。然后，暴露顳下頜關節上間隙，從關節盤的后外側拉出關節盤，并使用直徑1.5 mm的鉆頭造成穿孔模型。結果示：手術組中，Safranin O顯色觀察到蛋白聚糖損失，軟骨著色大大減少，髁突軟骨變薄，形狀扁平，發生侵蝕和硬化；免疫組化結果表明Ⅰ型膠原(COLI)和Ⅱ型膠原(COLII)表達下調；MMP1、MMP9和MMP13表達顯著上調。關節盤穿孔術結果顯示大鼠產生了TMJ-OA樣變化。TOLL樣受體(TLR-4)是模式識別受體的一種，其主要位于細胞膜上，可參與先天性免疫反應[53]。軟骨細胞、滑膜細胞等可以在應激狀態下激活TLR-4，從而誘導炎癥介質產生。在關節軟骨病變和膝關節OA滑膜中檢測到TLR2和TLR4表達上調，與正常軟骨相比，OA患者軟骨中TLR2、TLR3、TLR4和TLR5的高表達均得到證實，驗證了Toll樣受體(TLRs)在OA進展過程中先天免疫反應中的作用[54]。為了研究在關節盤切除術后實驗兔促炎和分解代謝介質表達的改變，以及使用TLR-4抑制劑后，TLR-4在TMJ-OA發生發展中的作用。Liu等[55]以C57BL/6J小鼠為實驗對象，使用了Lan等[56]的方法：在實驗兔的右側TMJ上做一個“T”形切口，隨后通過鈍性分離暴露關節，取出整個關節盤，構建了關節盤切除模型，部分實驗動物在造模前，提前注射TAK-242(TLR-4抑制劑)。在造模后的第2周、第4周、第6周分別取材送檢。關節盤切除組與對照組相比，髁突中軟骨變薄，未礦化骨區域增大，軟骨細胞減少；TLR4表達量逐漸升高，還發現軟骨中表達TLR-4的細胞比率與OA評分呈正相關；Micro-CT顯示：TAK-242注射顯著改善了顳下頜關節關節盤切除術誘導的軟骨蛋白聚糖的減少；免疫組化結果顯示：在手術6周后，軟骨中促炎介質(IL-1β、TNF-α)和分解代謝介質(ADAMTS5，MP13)的表達均上調。學者們進行的實驗研究已經發現了軟骨內骨化的核心機制，遺傳學研究提供了顳下頜軟骨內形成期間以及長骨生長板和骨折愈合過程中軟骨細胞直接分化為成骨細胞和骨細胞的證據。然而，軟骨細胞向成骨細胞/成骨細胞轉化的具體機制尚不清楚[57]。為了研究這些問題，有學者在尤卡坦小型豬中使用關節盤穿孔模型通過手術誘導TMJ-OA，具體步驟如下：在顴突上方形成斜形切口，使組織抬高并回縮進入顳下頜關節上間隙，關節盤向后牽引，使用打孔器在顳下頜關節關節盤的后外側部分形成5.0 mm的穿孔，對照組為假手術組[58]。術后4周處死動物進行組織學評估，在實驗組和假手術組中均測量Ⅱ型膠原陽性成熟區(MZ)與Ⅰ型膠原淺表區(SZ)的厚度。兩組動物關節盤COLlal和Acan表達均為陽性，進一步證明，與假手術對照組相比，實驗組模型中髁突軟骨厚度和細胞成熟區結構發生改變。組織形態計量學分析顯示，實驗組SZ區域較假手術組明顯增厚，提示髁突軟組織擴張。HE染色顯示實驗組小豬髁突還伴有軟骨細胞外基質的大量喪失，這些數據與其他研究表明：軟骨細胞標志物和成骨細胞/骨細胞標志物在頜骨生長和骨折愈合的軟骨向骨轉化過程中存在共定位現象，并為小型豬顳下頜關節損傷模型中軟骨向骨轉化提供了證據。關節盤穿孔的小型豬TMJ髁突軟骨內CD31+內皮細胞數量的增加表明血管生成在TMJ-OA病理學機制或修復中起著關鍵作用。此外，與假手術組相比，關節盤穿孔組髁突淺表區中的脈管束的數量也更豐富。筆者認為雖然手術方法可很好地保存關節囊和關節附屬結構，在某種程度上保留了關節機構的完整性，但仍然與人TMD的發生、發展有相當大差別。大多數外科方法都可用于大型動物上，并不能廣泛地應用于小型動物，同時手術對于關節結構的破壞有可能會干擾TMD的自然進程。

4 不同基因工程動物及其評價

4.1 Prg4(蛋白聚集多糖)基因缺失小鼠蛋白聚糖4(Prg4)基因編碼潤滑素是一種黏蛋白樣分子[59]，Prg4與透明質酸相互作用，并將其集中在關節表面，使關節具有較低的摩擦系數，保護關節軟骨免受摩擦引起的損傷[60]。除此之外，Prg4作為一種黏液糖蛋白，還可以抑制軟骨細胞凋亡，對軟骨細胞起到保護作用，是一種維持關節穩態所必需的細胞外基質分子。Bechtold等[61]使用了Matthew Warman博士提供的轉基因小鼠，報道了Prg4缺失的小鼠顳下頜關節組成結構中異位軟骨數量更多，Prg4基因缺失小鼠在第3個月時，TMJ顯示出明顯的OA變化，包括關節窩頂部和關節盤厚度增加，與年齡匹配的對照組相比，髁突頭略有擴大，骨贅樣軟骨從關節窩的關節面中央部分開始生長，并生長到上關節腔。同時，關節盤有異位軟骨發生，這些多余的組織似乎與相對的骨贅相連。12個月后，OA樣改變加重。矢狀面、鳥瞰圖和正視圖顯示，與對照組髁突相比，沿近側方和前后方向的髁突均增大，顯示出OA樣變化，包括多孔骨表面、骨贅及骨面扁平和凹陷。在Prg4基因缺乏小鼠關節盤的內側和外側也檢測到鈣化組織，并與髁突周圍骨贅的發展密切相關。對3～12個月齡Prg4基因缺失型小鼠進行的顳下頜關節骨贅/異位軟骨發育的組織形態計量學觀察表明，異位軟骨和骨性改變首先發生在關節窩和髁突，隨后在關節盤中形成異位軟骨。筆者認為Prg4基因缺乏小鼠能夠較完美地再現TMJ-OA的相關表現，有利于從病因學、病理生理學機制、臨床表現等方面去更加深入地理解TMD，Prg4基因缺失小鼠的出現為研究TMJ-OA的早期發病機制和關節功能障礙提供了一個獨特而有價值的模型，可為日后研究TMD治療相關藥物打下堅實的基礎，但Prg4基因缺乏小鼠為什么會有OA樣表現，其潛在的重要致病轉化背后的分子機制尚不完全清楚，且小鼠和人的關節軟骨的結構不盡相同，動物實驗結果能否外推到人類身上，仍存在爭議。

4.2 MRAS基因無效突變動物模型MRAS基因(肌RAS癌基因同源基因)已被證明在細胞發揮功能過程中起著許多作用，例如分化、細胞骨架重塑和細胞遷移，該基因編碼屬于RAS家族的小型單體GTP酶，控制多種信號通路，如MAPK和PI3K-AKT級聯等[62]。Smith等[63]將MRAS基因無效突變鼠分為純合型、雜合型，分別在模型小鼠上使用校準的von Frey尼龍單絲，采用Dixon升降法評估戒斷閾值。將細絲貼在后爪足底表面3 s，記錄反應。每只小鼠注射20 mL CFA，在基線前(注射CFA前1 d)和注射后3 d、7 d、10 d、14 d和21 d，使用von Frey纖維對小鼠進行機械敏感性測試量化機械性痛覺異常。比較了純合型、雜合子和野生型小鼠后爪注射CFA引起的機械超敏反應，所有組在第3天都表現出對Von Frey纖維刺激的戒斷閾值降低，到第21天就消失了[63]。CFA注射前的基線機械閾值和注射3 d后觀察到的最大機械痛覺超敏的基因型差異均無統計學意義。在炎癥性疼痛模型中，攜帶MRAs(肌肉RAS癌基因同源)無效突變的雄性小鼠表現出持續性機械性超敏反應。遺傳學和行為學研究表明，即基因決定的MRAS的表達有利于減輕TMD疼痛反應，這種效應是雄性特有的，這可能是導致男性顳下頜關節紊亂病綜合征患者疼痛發生率較低的原因之一。

4.3 TNF-α受體基因缺失小鼠動物模型TNF-α受體基因具有多態性，反應性關節炎和類風濕性關節炎患者通常具有遺傳和微環境因素的綜合病因。Mcllwrath等[3]通CFA+結腸激惹雙重誘導TNF-α受體(R1/R2)基因缺失小鼠，來分析判斷不同野生型、突變型小鼠在同樣刺激下的炎癥表現。結果表明在缺乏TNF-α信號的情況下。功能性TNFR1/R2的缺乏誘導促炎細胞因子的增加和抗炎細胞因子的減少從而產生異常的炎癥信號。筆者認為Mcllwrath等[3]進行的實驗有利于發現TMD發病過程中TNF-α受體所發揮的作用，以及由其所介導的表達增加的致炎細胞因子種類，從而將這些胞因子可以作為血液生物標志物并可以預測疾病的進展，并可將針對TNF-α受體相關藥物作為治療TMD的新目標。但與此同時，該實驗仍具有缺點：福爾馬林誘導僅在雄性大鼠身上進行，無法排除性激素對該實驗的影響，用于測量大鼠離斷機械閾值的方法會導致測量在結果在雄性動物和雌性動物之間存在不同，從而掩蓋了超敏反應本身所存在的性別差異。

4.4 K/BxN類風濕性關節炎小鼠類風濕性關節炎(RA)是一種自身免疫性疾病，以慢性關節炎癥(關節腫脹、僵硬和疼痛)為特征，常伴有關節外其他表現。全世界約有1%的人口罹患此病，類風濕性關節炎患者常常伴有其他合并癥(如心血管疾病)[64]。盡管學者對RA動物模型進行了大量的科學研究，但仍然缺乏青少年期的小鼠RA動物模型。在1996年，有學者報道了KRN轉基因動物與非肥胖型糖尿病小鼠(non-obese diabetic mice，NOD)雜交從而得到K/BxN小鼠，它們會出現嚴重的膝關節炎和骨骼破壞表型。這種動物模型是通過將K/BxN小鼠的血清(含有高水平的自身抗體)轉移至在正常的野生型小鼠體內，從而誘發進展迅速的、表型一致的關節炎癥[65]。IL-6和TNF-α既是治療類風濕性關節炎患者中參考的藥物靶點，同時也在K/BxN小鼠的關節中過表達。實驗結果顯示針對于Col-1、Col-2和蛋白多糖的組織學檢測和免疫熒光檢測表明K/BxN動物的顳下頜關節出現軟骨損傷，MicroCT結果也證實了這一點。Micro-MRI觀察表明上關節腔體積增加。同時分離于TMJ小鼠的成纖維細胞樣滑膜細胞可分泌炎性細胞因子(IL-6和IL-1β)，并表達MMPs等降解介質。筆者認為K/BxN動物模型與人類類風濕性關節炎具有臨床相關性，整個致病過程是自發的和漸進的，逐漸演變為慢性炎癥，并呈現對稱分布和聯合破壞的特點，是探索和研究TMJ自發性損害的一個重要模型。

4.5 Fas基因缺陷的MRL/LPR小鼠模型MRL/LPR小鼠是由LG、AKR、C3H和C57BL/6幾種不同品系小鼠經過一系列雜交至12代所得，在第13代時，篩選出淋巴增生反應陽性和陰性的亞系，它們有89%的基因組是相同的。突變基因Faslpr位于19號染色體上，將突變基因導入到其他品系中，即可產生具有不同免疫缺陷疾病表現的新品系，如MRL/MPJ-Faslpr、B6.MRL-Faslpr/j等[66]。而顳下頜關節關節軟骨易受到自身免疫性疾病、骨關節炎和類風濕性關節炎的侵襲，其中比較常見的就是類風濕性關節炎，其一大特點是軟骨下松質骨轉換增強，它是骨吸收和骨形成活動失衡的結果。迄今為止，類風濕性關節炎中破骨細胞形成和分子活化機制仍不清楚，為了研究介導骨吸收的破骨細胞的形成和激活過程，Hutami等[67]研究出了一種Fas基因缺陷的MRL/LPR小鼠模型，該模型自發性地發展成自身免疫性關節炎，特征是炎性細胞浸潤、骨質疏松表型以及骨和軟骨組織的破壞。NF-κB信號是許多慢性疾病發生的信號中心，包括關節炎、動脈粥樣硬化、糖尿病和炎癥性腸病。同時，多肽SN50已被證明可以穿過細胞膜并阻斷NF-κB復合體的核轉位的小肽從而阻止NF-κB的激活，與NF-κB復合物競爭核轉位，阻斷NF-κB信號通路[68]。1-磷酸鞘氨醇受體1(S1P1)是破骨細胞前體從循環中排出進入骨組織所必需的，在S1P1誘導破骨細胞前體細胞遷移和通過rac1向下游傳遞信號過程中發揮著無可替代的作用。MRL/LPR小鼠髁突組織體外培養可發現破骨細胞活性增強，且下頜骨髁突由于骨吸收嚴重導致軟骨下骨丟失。實時熒光定量PCR結果顯示破骨細胞標記物如TRAP、組織蛋白酶K、RANKL、VEGF和MMP-9的表達均上調[69]。人工合成的NF-κB抑制肽SN50應用于MRL/LPR小鼠時，軟骨下骨小梁丟失減少，破骨細胞生成標志物的產生和鞘氨醇激酶(Sphk)1/S1P1信號轉導均減少。結果表明，激活破骨細胞前體細胞中的Fas/S1P1信號是顳下頜關節類風濕性關節炎發病機制中的一個關鍵因素,靶向NF-κB的p50或p65亞單位可能是抑制破骨細胞活性治療顳下頜關節類風濕關節炎的有效途徑。筆者認為Fas基因缺陷的MRL/LPR小鼠提供了一種自發表現與人類RA特征相似的疾病動物模型。然而，介導MRL/LPR小鼠RA發展和骨吸收的機制尚不清楚。同時由于人類TMD發病的多因性和復雜性,單獨應用MRL/LPR小鼠模型不能完全揭示人類TMD發病原因和病理機制，常常需要聯合其他動物模型才能更好地揭示TMD的病理表現和發病機制。同時Hutami等[69]僅僅在細胞層次對MRL/LPR小鼠進行研究，如后續實驗能增加其動物學表現及病理學研究，將使實驗結果更加具有科學性和說服力。

5 展望

隨著人類社會的不斷發展進步，無論是生物學、藥學、醫學、還是毒理學的需要，任何服務于人類科學研究的實驗都不可避免地要開發、研究和驗證動物模型。怎樣選擇合適的實驗動物來模擬人類疾病的發病過程、病理改變、臨床表現是重中之重。如果缺乏一個穩定的、適合的、便利的實驗動物模型，那么可以說想得到可靠的、能信服于人的實驗結果簡直是天方夜譚。同樣將結果外推到人類身上更加難以實現。顳下頜關節紊亂病相關動物實驗研究滯后于臨床研究，如何設計出可靠的、穩定的實驗動物模型也是每位學者都應著重解決的問題。構建顳下頜關節紊亂病動物模型的方法各式各樣，可供選擇的動物種類繁多，如何選擇正確的TMD動物模型，在未來的TMD相關研究中一定會被解決，隨著相關實驗的進展深入和相關文章的陸續發表，未來的TMD學科研究、動物研究、治療方法研究必將會更上一層樓，成為口腔醫學領域和動物實驗學研究的熱點，從而為TMD的病因學研究、病理機制研究、臨床表現、治療和預防提供堅實的實驗基礎，以有利于發現治療TMD的有效方法，為廣大TMD患者解除病痛。