PACAP作用于神經膠質瘤的研究進展*

陳丹丹 綜述，劉娟娟，李 麗 審校

(山東中醫藥高等?？茖W校醫學系，山東 煙臺 264100)

垂體腺苷酸環化酶激活多肽(PACAP)是1989年由ARIMURA等從綿羊下丘腦中分離出的一種內源性神經肽，因其具有刺激大鼠垂體前葉細胞中環磷酸腺苷(cAMP)的合成而命名。PACAP包括含有38個氨基酸的PACAP-38和含有27個氨基酸的PACAP-27。PACAP-38羧基末端(C端)第27位點(Gly28-Lys29-Arg30)酰胺化后形成PACAP-27，二者在氨基末端(N端)保有相同的27位氨基酸序列，都具備激活腺苷酸環化酶(AC)的作用。其中，人類的PACAP-27與血管活性腸肽(VIP)有68%的氨基酸序列保守性，因此PACAP被認為是分泌素/胰高血糖素/生長激素釋放激素/VIP超家族新的成員。研究表明，VIP和PACAP都是體內廣泛分布的肽類激素，在許多不同的器官和組織中充當神經遞質，具有多種生物活性[1-2]。

1 PACAP與信號通路

1.1PACAP及其受體 PACAP和VIP通過在體內與細胞膜上的B家族G蛋白偶聯受體特異性結合而發揮作用。根據PACAP和VIP 2種結合位點的特點進行分類：Ⅰ型位點與PACAP高度結合，是VIP的1 000多倍；Ⅱ型位點與VIP及PACAP親和力相當。后者又被進一步細分為2類。隨后，克隆出2類3型：與PACAP高度結合而與VIP親和力低的命名為PAC1受體(PAC1R)；與PACAP/VIP親和力相當的命名為VPAC1受體(VPAC1R)和VPAC2受體(VPAC2R)。由于PAC1R第1個或第2個28氨基酸殘基組成的“hop”和“hip”盒不同，PAC1R又可以分為不同的亞型，其中Null、Hop1和Hop2亞型均參與AC和磷脂酶C(PLC)信號通路，而hip亞型僅誘導AC激活。VPACR是否存在亞型尚不清楚，主要參與AC信號通路。PACAP均可與上述受體亞型結合觸發不同的信號通路：PAC1R與G蛋白偶聯受體α亞單位激動型G蛋白(Gs)和PLC型G蛋白(Gq)結合，介導了AC/PLC/二酰基甘油(DAG)/肌醇1，4，5-三磷酸(IP3)信號級聯。

1.2PACAP的分布 PACAP及其受體在全身不同的器官中廣泛分布，包括神經系統、內分泌系統、生殖系統、消化系統等部位。在神經系統，PACAP作為神經遞質，神經調質或神經營養因子，在神經元發育、保護和再生中起重要作用，并且在病理生理條件下可能具有一定的神經保護作用。PACAP不僅直接影響神經元功能，還影響許多神經膠質細胞的功能，同時在神經退行性疾病、創傷性腦損傷、肌萎縮側索硬化、視網膜病變及神經系統腫瘤方面均參與疾病的發生發展，而且PACAP可以通過血腦屏障。在內分泌系統，PACAP可影響機體的體溫調節、晝夜節律和心臟興奮性等。在生殖系統，參與下丘腦-垂體-性腺軸的調節。PACAP在腫瘤作用方面具有爭議，一方面其在某些情況下促進了細胞增殖；另一方面其通過誘導細胞凋亡來抑制腫瘤細胞增殖。

1.3PACAP參與的信號通路

1.3.1PACAP參與cAMP/PKA/CREB信號通路的調節 活化的PAC1R與Gs結合，促使腺苷三磷酸(ATP)經AC催化后生成cAMP，cAMP作為第二信使進一步激活蛋白激酶A(PKA)，PKA是cAMP作用的底物，其由2個催化亞基和2個調節亞基組成，cAMP與調節亞基結合后釋放催化亞基，催化亞基釋放進入細胞核與環磷腺苷反應原件結合蛋白(CREB)結合且在絲氨酸133位點(Ser133)磷酸化，磷酸化后的CREB與細胞核內的cAMP反應元件(CRE)特異性結合形成復合物，激活靶基因的表達[3]。cAMP/PKA/CREB信號通路的調節與神經系統內神經元的再生、修復，膠質細胞的功能有關[4]。

1.3.2PACAP參與PLC/PIP2/DAG/IP3/PKC信號通路 PAC1R與Gq蛋白結合，激活PLC，PLC將細胞膜上的脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)分解為DAG和IP3。IP3動員細胞內鈣庫釋放鈣離子(Ca2+)到細胞質中與鈣調蛋白結合，隨后參與靶蛋白磷酸化等一系列反應,DAG在Ca2+的協同下激活蛋白激酶C(PKC)，然后通過PKC引起靶基因轉錄等一系列級聯反應，進行細胞的應答[5]。

1.3.3PACAP參與磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶(PI3K/Akt)信號通路 PI3Ks蛋白家族參與細胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉運等多種細胞功能的調節。PI3K活性的增加常與多種癌癥相關[6]。實驗證實，PACAP可能通過PI3K/Akt信號通路參與施萬細胞髓鞘形成過程[7]。PAC1R與Gq蛋白結合激活PI3K，后者將質膜上的PIP2磷酸化，生成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(PIP3)，PIP3作為第二信使與細胞內含有PH結構域的信號蛋白Akt結合，將胞漿中的Akt募集到質膜上，3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1(PDK1)和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物2(mTOR2)激活Akt，促使Akt蛋白Thr308位點和Ser473位點磷酸化而致Akt活化[8]?；罨腁kt通過磷酸化作用激活特異性底物，如p27、抗凋亡蛋白Bcl-2等，通過調控此類底物在胞漿和胞核的定位影響細胞的增殖周期和腫瘤進展[9-10]，或抑制如caspase-9、caspase-3等，抑制了腫瘤細胞的凋亡。

張力蛋白同源磷酸酶(PTEN)可以通過將膜上的Akt去磷酸化逆轉形成PIP2，進而抑制PI3K/Akt信號通路，起到抑制膠質瘤進展[11]和血管新生的作用。另外，PACAP還通過PAC1受體參與絲裂原活化蛋白激酶/細胞外調節蛋白激酶(MAPK/ERK)信號通路的激活來調節神經元興奮性[12]。

2 PACAP對神經膠質瘤的影響

神經膠質瘤是原發性顱內腫瘤中最常見的一種。而成人中最常見的神經膠質瘤是彌漫性膠質瘤。彌漫性膠質瘤根據其細胞類型的不同分為星形膠質細胞瘤、少突膠質細胞瘤、少突-星形膠質細胞腫瘤等。星形細胞瘤是起源于星形細胞的原發性腫瘤，也是最常見的原發性中樞神經系統腫瘤。其中，膠質母細胞瘤(GBM)是成人最常見、最具侵襲性的原發性腦腫瘤。GBM具有細胞異質性高，呈彌漫性浸潤、高度侵入性、異常血管生成等特點[13]。盡管采用包括手術治療、放療和替莫唑胺在內的多模式治療方法，但GBM患者的預后不良，患者的中位生存期僅為14～17個月,繼發性GBM患者的總體5年生存率只有5%[14]。大規模的基因組研究根據癌癥基因組圖譜推斷出了GBM多種突變亞型，包括TP53、PTEN、神經纖維蛋白-1和表皮生長因子受體(EGFR)等。PACAP及其相關受體在人腦膠質瘤中的普遍表達。學者們通過幾種膠質瘤細胞體外模型研究了PACAP的功能作用。

2.1PACAP抑制神經膠質瘤增殖、遷移

2.1.1普通條件下PACAP對神經膠質瘤的影響 VERTONGEN等[15]率先報道，PACAP顯著降低了T98G人腦膠質瘤細胞的增殖。通過PACAP作用于2種人類GBM細胞系(M059K和M59J細胞)，證明PACAP通過PI3K/Akt信號通路抑制了瘤細胞侵襲、遷移，但是對細胞增殖沒有影響[16]。PACAP還可通過阻斷PI3K/Akt和Sonic Hedgehog-GLI1(Shh/GLI1)通路抑制GBM的侵襲[17]。PACAP通過VPAC受體系統影響PI3K/Akt信號通路，降低M059K、M059J和U87MG的侵襲、遷移[16]。

2.1.2乏氧微環境下PACAP對神經膠質瘤的影響 GBM由浸潤細胞、基質、血管、細胞因子和周圍基質組成的異質性腫塊，腫瘤快速增長造成的乏氧微環境是包括GBM在內的各種實體瘤的共同特征。GBM和其他實體瘤一樣，含有與組織壞死和異常新生血管形成相關的廣泛缺氧區域。乏氧微環境還驅動膠質瘤干細胞中低氧誘導因子(HIF)的轉錄，HIF是由HIF-1α和HIF-1β構成的異二聚體。正常情況下，HIF-1α可在脯氨酸和E3泛素-蛋白連接酶的作用下降解。但是，在氧缺乏的環境下，HIF-1α的降解被抑制，導致其與HIF-1β形成異二聚體，后者通過與多種基因啟動子上的缺氧反應元件(HREs)結合，促進靶基因如血管內皮源性生長因子(VEGF)的轉錄和表達[18]。VEGF一直被認為是促進腫瘤血管生成最重要的生長因子,介導了新生血管的形成。HIF-1α與VEGF協同促進腫瘤血管的新生[19]。mTOR是PI3K/Akt信號通路的下游底物之一，PI3K/Akt/mTOR通路通過調控單核巨噬細胞的活動介導血管新生，mTOR也可以促進VEGF的分泌表達[19-20]。因此，膠質瘤中形成的乏氧微環境導致HIF-1α、VEGF、mTOR的增加，三者相互作用促進了膠質瘤中血管的新生和增加，也與腫瘤細胞遷移和生長侵襲密切相關。PI3K/Akt可負性調節血管生成素2(Ang2)，促進血管生成[21]。乏氧微環境和HIF的激活誘導實體瘤核心區EGFR過度表達。

表皮生長因子(EGF)是1962年COHEN發現的可以與EGFR結合并激活后者。EGFR是跨膜受體酪氨酸激酶ERBB家族的一員，其由3部分組成，包括位于胞外的配體結合域、膜上的跨膜域和胞內酪氨酸激酶域。EGFR通過與細胞外配體結合被激活，隨后出現細胞內酪氨酸激酶結構域的磷酸化。EGF/EGFR信號通路在細胞增殖、分化和遷移中發揮重要的調控作用[22-23]，與PACAP及膠質瘤密切相關的，如EGFR/PI3K/Akt信號通路和EGFR/Ras/Raf/MAPK信號通路。有報道指出，GBM中經常觀察到EGFR擴增，導致腫瘤的發生和發展，研究發現在數個GBM樣本中由于EGFR的高表達，導致PI3K/Akt信號通路的異常激活而影響細胞功能，包括增殖、侵襲、血管生成和抗凋亡。在神經膠質瘤中，Akt的激活被證實可以促進膠質瘤細胞的侵襲、血管生成和遷移[24]。因此，EGF與EGFR表達水平的異常被認為與GBM發展過程密切相關。腫瘤乏氧微環境的作用不僅促進血管生成，同時還促進腫瘤上皮細胞向更惡性的間充質表型轉變即上皮-間充質轉化(EMT)[25]。EMT是腫瘤轉移的關鍵過程。研究發現，在乏氧環境中，PACAP可以通過抑制PI3Ks-Akt和MAPK/ERK信號通路降低Ser473位點的磷酸化，降低乏氧環境中U87MG細胞中HIF-1α、HIF-2α和EGFR的表達來對抗缺氧介導的GBM細胞遷移[26]。

研究證明，PACAP可以調控低氧環境中的神經母細胞瘤細胞中VEGF及其受體的表達[27]。PACAP也可通過PI3K/Akt和MAPK/ERK途徑抑制來降低乏氧環境中U87MG細胞中VEGF的表達和分泌，進而減少新血管的形成。同時，降低了EMT標志物的表達：波形蛋白、基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)和MMP-9，恢復了閉鎖小帶蛋白1(ZO-1)的表達水平，抑制了腫瘤細胞的EMT過程[28]，降低了GBM侵襲性。

2.1.3能量缺乏(CR)微環境中PACAP對膠質瘤的影響 不僅乏氧微環境的改變會影響腫瘤細胞的生物活性，與營養不良無關的CR也可以廣泛有效地預防癌癥[29]。血清剝奪實驗證實，CR能降低細胞增殖，增強細胞自噬和DNA修復過程，還可以降低細胞微環境中激素的合成代謝、生長因子和活性氧等多種致癌物質的水平，通過干擾腫瘤細胞之間的相互作用，降低細胞增殖、侵襲和遷移[30]。

神經膠質源性中樞神經系統腫瘤轉化的細胞中高表達的巢蛋白(nestin)。GMB中的nestin表達通常高于侵襲性較小的膠質瘤，表明nestin的表達與腫瘤惡性度之間存在相關性。因此，可以通過檢測nestin在中樞神經系統中表達水平的增加來判斷腫瘤的預后。另一方面，GFAP表達的降低與膠質瘤的生長和惡性程度成反比，此現象在高級別膠質瘤中比在低級別膠質瘤中更為突出。血清剝奪實驗研究證實，CR通過顯著降低細胞周期蛋白D1和Bcl-2的水平，增加p53和裂解的caspase-3的表達而抑制細胞增殖，而給予PACAP可以通過激活PAC1/VPACR介導的過程，進一步降低CR環境中nestin的表達，增加細胞的凋亡和GFAP的表達，實現降低腫瘤細胞的惡性程度，降低腫瘤細胞增殖的作用[31]。

2.2PACAP促進膠質瘤細胞的增殖 研究證明，在小鼠C6膠質瘤細胞體外培養過程中，PACAP通過PAC1R，提高了瘤細胞內cAMP的濃度，具有促進腫瘤細胞增殖的能力[32]。PACAP-27在1 pmol/L至10 nmol/L濃度范圍內對小鼠C6膠質瘤細胞具有顯著促增殖能力，且伴劑量依賴性[33]。PACAP-38顯著上調人多形性惡性膠質瘤細胞T98G中腦源性神經營養因子(BDNF)mRNA的表達，使得CREB磷酸化轉錄機制的激活及隨后新的BDNF-轉錄物產生，于PACAP-38處理72 h后，觀察到T98G細胞釋放BDNF[34]，BDNF作為細胞因子，具有促進腫瘤細胞增殖的作用。出現相反的結果可能是由于細胞系的來源，PACAP作用的時間、濃度及腫瘤微環境之間的相互影響所致。

3 小 結

PACAP是在體內分布廣泛的一種內源性神經肽，具有調控包括神經系統在內的多個系統生理功能的特點。PACAP可以通過包括cAMP/PKA/CREB、PI3K/Akt等多個信號通路調控膠質瘤細胞的增殖、侵襲、遷移。膠質瘤組織的腫瘤細胞來源不明確，細胞組成復雜，加之各種細胞分泌的可溶性細胞因子及細胞外基質及細胞之間的信息交流共同構成膠質瘤微環境。PACAP在不同的腫瘤微環境中發揮的作用各不相同。在乏氧和CR的微環境中具有抑制細胞增殖遷徙的作用，這一發現有望成為抑制膠質瘤惡性增殖、侵襲遷移和血管新生的潛在靶點。但是，這一發現還停留在體外細胞實驗階段，未來有望通過體內試驗驗證PACAP的作用，以更好地評估其對膠質瘤的作用效果。總之，從分子信號通路出發，通過體內、體外研究深入探索PACAP在腫瘤微環境的相關分子機制，為治療膠質瘤提供新的方向，為人類腫瘤的治療提供新的曙光。