長(zhǎng)鏈非編碼RNA NONHSAT017458在結(jié)腸腫瘤中表達(dá)的研究

程諾 陳鳳媛 楚艷 沈云海 馮潔 潘勤聰△

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200240；2.上海市浦南醫(yī)院，上海 200125)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是世界上常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率占腫瘤中的第三位，也是第二大癌癥死亡原因[1]。在中國(guó)，結(jié)腸癌也是癌癥發(fā)病率及死亡率前五位的惡性腫瘤之一[2]。隨著我國(guó)人民生活水平和飲食習(xí)慣的提高，結(jié)直腸癌在我國(guó)的發(fā)病率也呈上升趨勢(shì)。從1990年到2016年，中國(guó)年齡標(biāo)準(zhǔn)化CRC的患病率估計(jì)從1990年的14.25/10萬(wàn)增加到2016年的25.27/10萬(wàn)[3]。它嚴(yán)重威脅著社會(huì)的發(fā)展以及人們的健康和生活。早期發(fā)現(xiàn)和治療可有效改善大腸癌患者的預(yù)后和長(zhǎng)期生存率。目前，結(jié)直腸癌除內(nèi)鏡檢查和病理檢查外，尚缺乏有效的早期診斷和干預(yù)治療。深入探討結(jié)直腸癌的分子機(jī)制，確定有效的治療靶點(diǎn)，對(duì)提高患者的生存率和生活質(zhì)量至關(guān)重要。近年來(lái)研究認(rèn)為長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long NON-Coding RNA，lncRNA)在結(jié)腸癌中起到重要作用。lncRNA被定義為不編碼蛋白質(zhì)的長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的RNA轉(zhuǎn)錄本，它們本身就是功能單位，因此它們的亞細(xì)胞定位對(duì)其功能至關(guān)重要[4]。根據(jù)功能不同，lncRNA分為3種類(lèi)型:(1)lncRNA是功能性生物分子并與細(xì)胞中的其他成分相互作用，例如DNA、蛋白質(zhì)或RNA；(2)基因調(diào)控元件嵌入在lncRNA基因的轉(zhuǎn)錄體中，并且其活性lncRNA基因指導(dǎo)調(diào)控元件的活性；(3)轉(zhuǎn)錄過(guò)程影響基因組，從而影響基因活性[5]。LncRNAs參與了廣泛的細(xì)胞機(jī)制，從基因表達(dá)的幾乎所有方面到蛋白質(zhì)翻譯和穩(wěn)定性。關(guān)于lncRNA作用的研究增加證明了這些轉(zhuǎn)錄物在表達(dá)調(diào)控中的關(guān)鍵作用。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多l(xiāng)ncRNA在結(jié)腸癌中具有顯著異常表達(dá)，其中包括MEG3、H19、SNHG6、BCYRN1、LINC01535等[6-10]。由于其癌癥特異性表達(dá)譜，lncRNAs的異常表達(dá)可作為結(jié)腸癌診斷和治療分層的可靠預(yù)后指標(biāo)。LncRNA生物學(xué)的許多方面還不清楚，可能為我們提供一個(gè)新的視角的復(fù)雜性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。因此，本研究旨在深入了解與結(jié)腸腺瘤和結(jié)腸癌相關(guān)的lncRNA。同時(shí)就其中表達(dá)顯著差異的lncRNA NONHSAT017458進(jìn)行組織學(xué)上驗(yàn)證及臨床相關(guān)性分析。報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1一般資料 收集2021年1月至2021年12月在上海市第五人民醫(yī)院消化內(nèi)科接受腸鏡檢查的結(jié)腸腺瘤及結(jié)腸癌患者(各10例，剔除2例結(jié)腸腺瘤組質(zhì)檢不合格)。分別留取其腫瘤組織及相鄰正常組織的樣本，取完立即放入RNA保存液中并放置于-80℃冰箱保存。所有患者在檢查前都沒(méi)有接受任何其他治療且未患有其他系統(tǒng)腫瘤及嚴(yán)重疾病。所有患者疾病診斷嚴(yán)格經(jīng)上海市第五人民醫(yī)院病理科的兩名病理學(xué)專(zhuān)家明確。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理審批號(hào)為(2020)倫審(010備)。所有患者均簽署知情同意書(shū)。見(jiàn)表2。

表1 結(jié)腸腺瘤患者基本信息

表2 結(jié)腸癌患者基本信息

1.2方法

1.2.1高通量測(cè)序技術(shù) 本研究中高通量測(cè)序技術(shù)由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成。運(yùn)用TRIZOL的方法對(duì)樣本進(jìn)行total RNA的提取，純化總RNA，抽取全部帶多聚A尾的RNA，進(jìn)行g(shù)enes的分離或者對(duì)rRNA進(jìn)行去除及片段化、應(yīng)用隨機(jī)引物和逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，隨后進(jìn)行3’末端加A、連接接頭以及末端修復(fù)等一系列測(cè)序?qū)嶒?yàn)步驟，從而完成測(cè)序樣本的文庫(kù)構(gòu)建。選用paired-end程序，進(jìn)行雙端測(cè)序，將帶有簇的flow cell上機(jī)并按照HiSeq 2 500提供的指南進(jìn)行測(cè)序試劑的準(zhǔn)備工作。由數(shù)據(jù)搜集軟件來(lái)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析以及控制測(cè)序的過(guò)程。

1.2.2LncRNA NONHSAT017458與mRNA共表達(dá)分析 將樣本的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行包含數(shù)據(jù)預(yù)處理、基因組比對(duì)、基因表達(dá)定量及表達(dá)分析、并對(duì)其進(jìn)行GO/KEGG富集分析。GO/KEGG富集分析顯著性可用P值表示，當(dāng)P≤0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。P值越小，功能富集越顯著。此外，運(yùn)用超幾何累積分布函數(shù)計(jì)算共表達(dá)mRNA注釋中的功能性術(shù)語(yǔ)的富集，并通過(guò)方法計(jì)算假發(fā)現(xiàn)率(false discoveryrate，F(xiàn)DR)。當(dāng)P<0.05且FDR<0.05時(shí)被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.3定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)驗(yàn)證分析 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)lncRNA NONHSAT017458在大腸癌樣本中的表達(dá)。根據(jù)制造商的規(guī)格，使用TransScript All-in-One第一鏈cDNA合成SuperMIX從我們的樣品中提取總RNA用于qPCR試劑盒。使用NanoDrop 2000光譜儀(Thermo Scientific，USA)測(cè)定RNA的產(chǎn)量，并使用用凝膠電泳染色的瓊脂糖溴化乙錠評(píng)估完整性。使用2-ΔCt方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平。PCR在384孔光學(xué)板(羅氏，瑞士)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)在94℃下30秒，然后進(jìn)行45個(gè)在94℃下5秒及60℃30秒的循環(huán)。使用的引物包括：

表3 qRT-PCR的引物序列

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0(IBM SPSS Statistics，USA)進(jìn)行分析。使用 Pearson’s chisquare檢驗(yàn)來(lái)評(píng)估lncRNA NONHSAT017458表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間關(guān)聯(lián)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)用于評(píng)估lncRNA NONHSAT017458的表達(dá)水平，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1lncRNA NONHSAT017458高通量測(cè)序篩選及l(fā)ncRNA-mRNA共表達(dá)分析 在結(jié)腸癌組織與正常對(duì)照組中，利用高通量測(cè)序篩選出表達(dá)差異lncRNA NONHSAT017458(FC>50，P<0.05)。將差異表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)制作成熱圖(圖1A)。我們對(duì)lncRNA-mRNA進(jìn)行共表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)其中與lncRNA NONHSAT017458相關(guān)的前20位基因分別列舉如下(圖1B)：H19、THBS2、POMP、C6orf223、MMP11、CTHRC1、AP000349.1、SULF1、COL4A1、AQP1、IL-8、MZT1、SMCO2、SPON2、FSTL1、SPARC、GTF2F2、IGFBP7、COL4A2、EXOSC8。其中IL-8呈現(xiàn)表達(dá)差異最明顯。

注：圖A：lncRNA差異表達(dá)熱圖；紅色代表高表達(dá)，藍(lán)色代表低表達(dá)；圖B：lncRNA NONHSAT017458共表達(dá)基因圖。圖1 結(jié)腸癌組織中差異lncRNA表達(dá)譜及l(fā)ncRNA NONHSAT017458共表達(dá)基因

2.2lncRNA NONHSAT017458的功能分析 為了探索介導(dǎo)結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)過(guò)程，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行了分子功能分析。其揭示了多種生物過(guò)程，細(xì)胞組分和分子功能的參與。使用基因本體(GO)分析，我們通過(guò)P值確定lncRNA NONHSAT017458每個(gè)結(jié)構(gòu)域中10個(gè)最顯著富集的術(shù)語(yǔ)。在結(jié)腸癌中，這些結(jié)構(gòu)域分為生物過(guò)程、細(xì)胞組成及分子功能三部分(圖2)。其中細(xì)胞成分的重要術(shù)語(yǔ)包括含膠原蛋白的細(xì)胞外間質(zhì)、細(xì)胞外空隙、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、基膜和胞外區(qū)等成分。對(duì)于分子功能，重要術(shù)語(yǔ)包括鈣整合素結(jié)合蛋白、蛋白質(zhì)綁定、細(xì)胞外間質(zhì)裝訂及血小板衍生生長(zhǎng)因子結(jié)合等。生物過(guò)程最重要的術(shù)語(yǔ)包括類(lèi)血管生成的陽(yáng)性調(diào)節(jié)、內(nèi)皮細(xì)胞的正向調(diào)節(jié)、膠原分解代謝過(guò)程、細(xì)胞蛋白質(zhì)代謝和細(xì)胞外間質(zhì)拆卸等過(guò)程。KEGG通路分析顯示(圖3)，lncRNA NONHSAT017458涉及相關(guān)的通路，其中細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)受體相互作用通路呈現(xiàn)明顯富集性，另外還包括有PI3K-Akt信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路，NF-kappaB(NF-kB)信號(hào)通路及TNF信號(hào)通路等。這些通路均可能參與結(jié)腸癌的致癌作用。見(jiàn)圖3。

2.3lncRNA NONHAST017458的qRT-PCR驗(yàn)證 基于高通量測(cè)序結(jié)果，本研究使用qRT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證lncRNA NONHAST017458表達(dá)水平。結(jié)果顯示在結(jié)腸癌組織中，lncRNA NONHAST017458表達(dá)水平明顯高于結(jié)腸癌旁正常組織(P<0.05)(圖4A)。與高通量測(cè)序中結(jié)腸癌中l(wèi)ncRNA NONHAST017458表達(dá)上調(diào)結(jié)果基本一致。在結(jié)腸腺瘤組織中，lncRNA NONHAST017458表達(dá)水平與腺瘤旁正常組織中無(wú)明顯差異(P>0.05)(圖4B)，故與高通量測(cè)序中結(jié)腸癌中l(wèi)ncRNA NONHAST017458表達(dá)上調(diào)結(jié)果不一致。見(jiàn)圖4。

注：圖A:CRC-normal代表結(jié)腸癌旁正常組織，CRC-Tumor代表結(jié)腸癌組織；圖B：CRA-normal代表結(jié)腸腺瘤旁正常組織，CRA-Tumor代表結(jié)腸腺瘤組織；與對(duì)照組相比:*P<0.05。圖4 結(jié)腸癌組織中l(wèi)ncRNA NONHSAT017458的qRT-PCR驗(yàn)證

2.4lncRNA NONHAST017458表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 lncRNA NONHAST017458表達(dá)情況與結(jié)腸癌患者性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均無(wú)明顯相關(guān)性(均P>0.05)(表4)。

表4 患者臨床特征分布與lncRNA NONHSAT017458表達(dá)量的相關(guān)性

3 討 論

結(jié)腸癌是世界上常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，也是導(dǎo)致癌癥發(fā)病率和死亡率的第四大常見(jiàn)原因。目前研究認(rèn)為飲食、微生物及其代謝物與結(jié)腸癌發(fā)生有關(guān)，但結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚不明確。LncRNA是那些有超過(guò)200個(gè)核苷酸(nt)并且不會(huì)被翻譯成蛋白質(zhì)的RNA[11]。它顯示了在調(diào)節(jié)關(guān)鍵細(xì)胞功能，包括基因調(diào)控的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后和表觀遺傳機(jī)制的作用[12]。許多腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與lncRNA表達(dá)的異常調(diào)節(jié)有關(guān)。LncRNA在結(jié)腸癌中具有復(fù)雜的生物學(xué)功能，其具體的調(diào)控機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

在本研究中，我們進(jìn)一步運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)分析了結(jié)腸癌組織、結(jié)腸腺瘤組織以及正常對(duì)照組中的lncRNA表達(dá)譜，我們發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌與正常對(duì)比中呈現(xiàn)明顯基因表達(dá)差異。在對(duì)照組與結(jié)腸癌組中對(duì)比中，表達(dá)上調(diào)的lncRNA有35個(gè)(P<0.05，F(xiàn)DR<0.05)。其中l(wèi)ncRNA NONHSAT017458表達(dá)倍數(shù)是5.35*1011倍。在結(jié)腸腺瘤與結(jié)腸癌組中，表達(dá)上調(diào)的lncRNA有50個(gè)(P<0.05，F(xiàn)DR<0.05)。其中l(wèi)ncRNA NONHSAT017458表達(dá)倍數(shù)是4.56倍。對(duì)照組與結(jié)腸腺瘤組中，表達(dá)上調(diào)的lncRNA有2個(gè)(P<0.05，F(xiàn)DR<0.05)，其中l(wèi)ncRNA NONHSAT017458(1.17*1011倍)。通過(guò)以上結(jié)果發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸腫瘤中l(wèi)ncRNA呈現(xiàn)明顯表達(dá)差異，其中l(wèi)ncRNA NONHSAT017458表達(dá)差異最明顯。我們由此假設(shè)結(jié)腸癌的發(fā)生可能與lncRNA NONHSAT017458的異常調(diào)控密切相關(guān)。目前l(fā)ncRNA NONHSAT017458的功能機(jī)制尚不明確，我們通過(guò)GO分析和KEGG通路注釋分析lncRNA NONHSAT017458的潛在功能。GO分析顯示lncRNA NONHSAT017458參與生物過(guò)程、細(xì)胞組成及分子功能三部分。包括鈣整合素結(jié)合蛋白、蛋白質(zhì)綁定、內(nèi)皮細(xì)胞的正向調(diào)節(jié)、膠原分解代謝過(guò)程、細(xì)胞蛋白質(zhì)代謝等過(guò)程。lncRNA NONHSAT017458異常調(diào)節(jié)通過(guò)這些生物學(xué)過(guò)程從而引起結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展。KEGG通路富集分析顯示lncRNA NONHSAT017458與PI3K-Akt信號(hào)通路、NF-kappaB(NF-kB)信號(hào)通路及TNF信號(hào)通路等通路相關(guān)，而這些通路在以往研究已充分證實(shí)與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[13-15]。我們針對(duì)我們進(jìn)一步通過(guò)高通量測(cè)序篩選發(fā)現(xiàn)lncRNA NONHSAT017458有眾多的共表達(dá)基因，其中IL-8相關(guān)性最高。

白介素-8(IL-8，也稱(chēng)為CXCL8)是結(jié)腸癌中常見(jiàn)的一種細(xì)胞因子，屬于彈性蛋白樣重組體(ELR)+CXC趨化因子家族[16]。它通過(guò)對(duì)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的趨化作用及刺激中性粒細(xì)胞活性而引發(fā)炎癥反應(yīng)[17]。IL-8啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性與NF-kB結(jié)合相關(guān)[18]。因此IL-8在腫瘤增殖、遷移和侵襲中起到重要作用。研究認(rèn)為CXCL8(即IL-8)可通過(guò)PI3K/AKT/NF-kB信號(hào)軸誘導(dǎo)激活結(jié)腸癌誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的作用[19]。目前l(fā)ncRNA在結(jié)腸癌中行使復(fù)雜生物學(xué)功能，其詳細(xì)的調(diào)控機(jī)制尚不明確，仍有待深入研究。因此，本研究將進(jìn)一步研究lncRNA在結(jié)腸癌中的調(diào)控作用，以明確與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及通路之間的聯(lián)系。針對(duì)前期研究結(jié)果，我們通過(guò)高通量測(cè)序篩選出結(jié)腸癌中異常表達(dá)的lncRNA NONHSAT017458，并同時(shí)篩選出與lncRNA NONHSAT017458相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子及參與通路。我們可以將lncRNA NONHSAT017458其作為結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制的研究對(duì)象，研究lncRNA NONHSAT017458表達(dá)異常是否通過(guò)調(diào)控NF-kB通路中IL-8的表達(dá)從而引起結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。這可成為后續(xù)研究重點(diǎn)。目前我們已經(jīng)在結(jié)腸癌組織中驗(yàn)證其表達(dá)水平的變化。但它是否為結(jié)腸癌特異的lncRNA仍需要更多病例樣本來(lái)驗(yàn)證，同時(shí)其在細(xì)胞中的表達(dá)情況以及如何參與通路并與轉(zhuǎn)錄因子作用的機(jī)制仍需進(jìn)一步體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)來(lái)明確。lncRNA NONHSAT017458在結(jié)腸癌中起到重要作用，后續(xù)有望成為結(jié)腸癌的早期診斷的分子標(biāo)志物及預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)，并為結(jié)腸癌的早期治療提供新的思路。