基于單細胞拉曼光譜研究大蒜提取物對金黃色葡萄球菌的作用

劉雯潔，吳忻禹，劉碧涵，何 林，張陸成，黎永青

（1.廣西醫科大學再生醫學與醫用生物資源開發應用省部共建協同創新中心，廣西 南寧 530021；2.廣西醫科大學生命科學研究院生物醫學光子學研究中心，廣西 南寧 530021；3.東莞理工學院電子工程與智能化學院，廣東 東莞 523808）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus，SAU）是一種革蘭陽性球菌，是人類和動物微生物感染的重要病原體[1]，在全球范圍內，每年在引起的不復雜的皮膚感染數量難以估計，可能有數十萬到數百萬例更嚴重的侵入性感染[2]，可以造成呼吸道以及創口的感染，心內膜炎，引起菌血癥等[3]，食源性的SAU 可造成嘔吐、腹瀉等癥狀，而SAU 感染的治療通常是使用β-內酰胺類抗生素，隨著抗生素的廣泛使用，逐漸出現了對抗生素耐藥的現象，甲氧西林等被開發使用，而耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）就應運而生了[4]。細菌對抗生素耐藥現象的日益凸顯，迫切需要尋找抗生素替代治療的藥物。

大蒜具有悠久的藥用歷史，具有廣泛的抗菌活性，直到1944 年才被確定大蒜中主要的抗菌活性成分為大蒜素[5]，同時還含有多種活性成分，包括乙烯基二硫磷脂（vinyldithiins）、阿霍烯（ajoenes）和diallyl polysulfides[6]。大蒜中的大蒜素不論是單獨使用還是聯合用藥均對細菌具有抑制效果[7]。為了進一步了解其抑菌機制，我們使用拉曼光譜從單細胞層面來描述大蒜提取物對SAU 的抑制效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

使用金黃色葡萄球菌（ATCC25923），菌株保存在-80℃，復蘇使用；新鮮大蒜購買自市場。LB 培養基以及LB 瓊脂培養基，活細菌/死細菌雙染試劑盒（MX4234-40T）。

所用儀器包括恒溫培養搖床（上海一恒THZ100），旋渦混勻器（上海滬析Vortex-1），超純水機（YYTIII-20L），超低溫冰箱（海爾DW-86L578J），培養箱（ZXDPA2160），醫用冷藏冰凍冰箱（海爾HYCD-282），生物安全柜（海爾HR40-IIA2），冰凍離心機（5840R），超聲波清洗機（舒美KQ-50TDE），拉曼光譜儀（Horiba LabRAM HR Evolution）。

1.2 試驗方法

1.2.1 從新鮮大蒜中獲得大蒜提取液

挑選外表完好、無發芽的大蒜碾碎后分裝8g 至50ml 的離心管中，隨后在40℃的水浴鍋30 分鐘孵育，隨后加入1ml 蒸餾水繼續孵育60 分鐘，最后高速離心取上清，并重復5 次，通過0.22um 的過濾器，獲得大蒜提取液。

1.2.2 測定SAU 在大蒜提取液的MIC 值

獲得的大蒜提取物的濃度記錄為100%，將細菌復蘇后，傳代三次，隨后使用試管法二倍稀釋大蒜提取物測定金黃色葡萄球菌在大蒜提取液中的MIC 值。

1.2.3 大蒜提取物對SAU 生物膜的清除作用

傳代三次后，將菌液稀釋，調整OD600=0.5，準備96 孔板，每塊板實驗分為三組，每組5 孔，一組為空白對照，僅加100ulLB 培養基，其余兩組均為100ul 的菌液。隨后37℃過夜培養，隨后棄掉上清，空白對照組加入LB 培養基，兩個實驗組分別加入大蒜提取物濃度為0%以及 25%的LB 培養基，其余4 塊96 孔板重復上述操作，分別標記為1h，3h，5h，9h，16h，隨后放入37℃培養箱靜止培養，使用結晶紫按照上述時間點對生物膜進行濃度測試。

1.2.4 使用拉曼光譜表征大蒜提取液作用下的SAU的損傷程度

將傳代3 次的SAU 分別接種至不含有大蒜提取物以及濃度為25%的培養基中，并在不同時間點取100ul的菌液，然后從每個濃度和時間點隨機測定30 個細胞的拉曼光譜，扣除背景并去基線以及平滑。

2 結果

2.1 大蒜提取物

使用蒸餾水作為溶劑，從新鮮大蒜中所獲得大蒜提取物為淡黃色澄清液體，具有大蒜的特殊氣味。

2.2 金黃色葡萄球菌在大蒜提取物中的MIC 值

使用二倍稀釋法測定其MIC 值，實驗表明大蒜提取物對SAU 具有明顯的抑制作用，且存在濃度依賴性，濃度越高抑制作用越強，在大蒜提取物濃度為100%時，溶液澄清透亮，未發現細菌生長，其OD600 值處于低水平狀態，而提取物濃度為零時，試管溶液出現渾濁，當大蒜提取物濃度在溶液中的濃度低于0.4%以后，出現了細菌的生長，可以確定其MIC 值為0.4%。

2.3 大蒜提取物對金黃色葡萄球菌生物膜的清除作用

大蒜提取物能夠對SAU 所形成的生物膜起到明顯的清除作用，在沒有大蒜提取物作用的實驗組中，從1h～16h 其OD570 保持在較高水平，生物膜濃度高，而在含有25%的大蒜提取物的實驗組中，其吸光度值隨作用時間增加而下降，生物膜濃度呈現逐漸下降的現象，在3h～5h 間出現明顯下降，大蒜提取物對生物膜的清除作用隨著作用時間的延長而增強，到了16h，其吸光度值降到了比較低的水平。（見圖1）

圖1 使用25%大蒜提取物作用于金黃色葡萄球菌的生物膜，持續作用16h，在3h 至5h 間出現生物膜濃度驟降的現象

2.4 拉曼光譜表征金黃色葡萄球菌的損傷

SAU 在含有不同濃度大蒜提取物的培養基中培養的，使用單細胞拉曼光譜動態監測不同時間點大蒜提取物SAU 的作用效果，其單細胞拉曼光譜存在顯著差異，對比未添加大蒜提取物的實驗組，在25%大蒜提取物作用以后，單細胞拉曼光譜中，其724cm-1、782cm-1和1573 cm-1出現明顯變化。

3 討論

SAU 為常見的食源性致病菌，可引起食物中毒事件，對機體健康帶來危害，其耐藥性是非常普遍的，尋找可替代的藥物是非常必要的。大蒜是常見的一種食材，可作為蔬菜或者調味劑，屬于百合科地下鱗莖的植物，來源非常廣泛，而且成本低廉，具有很好的藥用價值，是潛在的抗生素替代選擇或聯合用藥的參考。本研究首先使用蒸餾水提取大蒜提取物，能夠獲得淡黃色、液態、具有特殊氣味的大蒜提取物，隨后使其作用于SAU 以探索其抑菌效果，經過實驗，提取物對SUA 具有較明顯抑制作用，其MIC 值為0.4%。SAU 在生長過程中容易形成生物膜，該膜是SAU 在96孔板中黏著、生長所形成的具有獨特三維結構的細胞外的生物膜基質，包含有多糖，蛋白質以及DNA等物質，通過感知外界環境調控基因的表達，從而改變生物膜的合成更好地適應環境，當使用抗生素進行殺菌時，生物膜能夠阻礙抗生素與細菌的接觸，起到屏障作用，這也是導致細菌對抗菌藥物耐藥的主要原因之一，于是出現反復感染以及感染難以清除等臨床常見的問題。本次研究所獲得的大蒜提取物能夠有效清除生物膜，將大蒜提取物與其他抗菌藥物使用聯合使用，或許能夠取得更好的療效。

此外，從單細胞拉曼光譜的結果來看，在大蒜提取物的作用下，代表核酸的拉曼光譜波段724cm-1、780cm-1、1573cm-1的強度減弱[8]，可能的原因是大蒜提取物對細菌的細胞壁發生作用，其致使通透性發生改變，隨著作用時間的延長，通透性逐漸增大，細胞內容物的流失也就更多了。

4 結語

SAU 作為院內感染的主要病原菌，以及耐藥性的問題日益嚴峻，是臨床上亟需解決的問題。

第一，本研究使用蒸餾水作為溶劑提取到的大蒜提取物不同于甲醇或乙醇等化學試劑所獲得的，存在化學污染的可能性，該方法獲得的大蒜提取液具有安全無毒，無副作用等優點，且大蒜容易獲得，更有利于其藥用價值的推廣。

第二，本 實驗明確了在該提取條件下，僅需0.4%的濃度即可達到MIC 值，在低濃度仍具有較好的抑制效果。

第三，本研究明確了大蒜提取物對SAU 生物膜的清除效果，隨著作用時間的延長，其清除效果是非常顯著的。

第四，本實驗使用單細胞拉曼光譜動態監測描述大蒜提取物對SAU 的殺傷效果，在大蒜提取物質的作用下，代表核酸的拉曼峰強度下降，包括724cm-1、780cm-1以及1573cm-1。該實驗方法不僅能夠無損傷無標記在原位上來反映細菌的生化信息，更具有方便快捷的優點，能省去冗長繁瑣的培養步驟，為研究工作提供便利。使用大蒜提取物能夠對SAU 產生抑制作用，為臨床上細菌對抗生素的耐藥性提供新的參考，有助于尋找抗生素的替代療法，以及對于減少耐藥菌的產生均具有重要意義。