茯苓酸對結腸癌細胞增殖凋亡、遷移侵襲及PERK/ATF4信號通路蛋白表達的影響

劉婉，晉穎，馮曉潔，汪湃

北京市和平里醫院消化腫瘤科，北京 100013

結腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，是全球癌癥死亡相關的主要原因之一。結腸癌的發生與飲食、遺傳等因素有關，但其具體發病機制并未明確［1］。目前臨床常用的手術切除術、化學療法和免疫療法等治療方法對轉移性結腸癌的療效不理想［2］。因此，研究結腸癌的發病機制及有效治療方法仍然是目前的研究熱點。蛋白激酶RNA樣內質網（ER）激酶（Protein kinase RNA-like ER kinase，PERK）是啟動內質網未折疊蛋白反應（Unfolded protein reaction，UPR）的主要因子之一［3］，PERK的激活使真核起始因子 2α（Eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α）的磷酸化水平升高，導致轉錄激活因子4（Activating transcription factor-4，ATF4）入核活化［4］。促進PERK/ATF4通路蛋白表達，能抑制結腸癌細胞的增殖、促進細胞凋亡［5］。茯苓酸（Poria acid，PA）是從真菌茯苓中分離出來的一種三萜類化合物，具有抗炎、抗菌、抗病毒以及鎮靜等多種藥理作用［6］。PA能夠激活ER應激，促進細胞凋亡來抑制胰腺癌的發展［7-8］。但PA對結腸癌細胞的作用及其機制相關研究報道較少。2022年5—10月，我們觀察了PA對結腸癌細胞增殖凋亡、遷移侵襲及PERK/ATF4信號通路表達的影響，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 人結腸癌細胞系SW480、SW480細胞完全培養基（SNL-074、SNLM-074，中國尚恩生物）；SW480用完全培養基置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，接下來每3～4天按照1∶3傳代，傳至第4代。PA（PCS0393，成都植標化純）；PERK激活劑 CCT020312、PERK 抑 制 劑 GSK2656157（HY-119240、HY-13820，Med Chem Express公司）；MTT細胞增殖檢測試劑盒（E606334，生工生物工程）；Annexin V-FITC/PI熒光雙染細胞凋亡檢測試劑盒（PCA-201，武漢普諾賽）；PERK、p-PERK、ATF4、內質網應激相關蛋白C/EBP同源蛋白（CHOP）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）一抗（ab229912、ab192591、ab184909、ab11419、ab231303、ab92547，英國Abcam）；羊抗兔IgG H&L、羊抗小鼠IgG H&L（ab6795、ab6808，英 國 Abcam）；流 式 細 胞 儀（BD LSR Ⅱ，美國BD）；倒置顯微鏡（XSP-17C，上海光密儀器）；iBright凝膠成像儀（CL750，賽默飛世爾科技）。

1.2 PA的受試劑量篩選 采用MTT法。將第4代SW480細胞以5×103/孔接種至96孔板中，分為7組，每組5個復孔。待細胞匯合度到80%時，分別加入0、1、2、4、8、16、32 μmol/L的PA培養24 h，每孔加入MTT繼續培養4 h。棄上清液，每孔加入100 μL的DMSO。用酶標儀測算每孔在490 nm處的光密度OD值，并計算細胞的存活率及半數抑制濃度（IC50）。細胞存活率（%）=（實驗組光密度OD值/對照組光密度值）×100%。加入 0、1、2、4、8、16、32 μmol/L PA的SW480細胞存活率分別為100.00% ± 0.45%、98.16% ± 1.80%、75.64% ±2.34%、64.98% ± 2.11%、50.97% ± 1.24%、35.17% ± 0.92%、23.06% ± 1.04%。加入PA培養24 h時SW480細胞的IC50為8.393 μmol/L 因此，后續研究選擇8 μmol/L為PA的受試劑量。

1.3 SW480細胞分組及PA給予方法 將SW480細胞分為四組，每組6個復孔。PA組加入8 μmol/L的PA［9］，PA + PERK 抑制劑組加入 8 μmol/L 的 PA +2 μmol/L 的 GSK2656157［10］， PERK 激活劑組加入8 μmol/L的 CCT020312［11］，對照組用正常培養基培養。1.4 各組細胞增殖情況觀察 ①培養24 h時采用MTT法測算各組細胞存活率，方法同“1.2”，重復測算3次，取平均值。②取各組細胞，用含有10% FBS的培養基培養15 d。吸除培養液，4%聚甲醛固定細胞10 min，結晶紫染色20 min，PBS洗滌細胞并干燥。顯微鏡下對細胞克隆數進行計數。重復計算3次，取平均值。

1.5 各組細胞凋亡情況觀察 采用流式細胞儀術。培養24 h時取各組細胞，重懸后300 g離心5 min，PBS洗滌細胞后，加入 500 μL稀釋的1×Annexin V Binding Buffer工作液重懸細胞，加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI染色液混勻，室溫避光孵育20 min。用FACS-LSR Ⅱ流式細胞儀測算各組細胞凋亡率。重復測算3次，取平均值。

1.6 各組細胞侵襲、遷移能力觀察 采用Transwell小室。取各組細胞接種至Transwell上室，加入無血清培養基，培養24 h。將遷移至上室膜外側的細胞用甲醇固定30 min，然后結晶紫染色15 min。倒置顯微鏡下每組隨機選擇6個視野觀察。侵襲實驗將基質膠（Matrigel）按1∶8用無血清培養基稀釋，并加入到上室中，其余步驟與遷移實驗相同。使用ImageJ軟件計算各組遷移、侵襲細胞數。均重復測算3次，取平均值。

1.7 各組細胞PERK/ATF4通路相關蛋白、內質網應激相關蛋白、EMT相關蛋白檢測 采用WESTERN Blotting法檢測各組細胞通路相關蛋白（PERK、p-PERK、ATF4）、內質網應激相關蛋白CHOP、EMT相關蛋白（E-cadherin、Vimentin）。培養24 h時取各組細胞，提取總蛋白，通過SDS-PAGE凝膠電泳分離目的蛋白，并轉至PVDF膜上。接著將PVDF膜用5%的脫脂牛奶室溫振蕩孵育2 h，TBST洗膜，加入一抗稀釋液（PERK、p-PERK、ATF4、CHOP、E-cadherin、Vimentin抗體稀釋倍數1：1 000），4 ℃孵育過夜，再加入羊抗兔或羊抗鼠二抗稀釋液（稀釋倍數1：1 000），室溫振蕩孵育2 h，最后加入ECL試劑避光顯色，通過凝膠成像儀觀察蛋白條帶。以β-actin為內參蛋白，采用Gel-Pro analyzer4軟件測算目的蛋白的相對表達量。重復測算3次取平均值。

1.8 統計學方法 利用GraphPad Prism 6.0統計軟件進行數據處理。P-P圖檢驗數據的正態性，正態分布的計量資料以-表示，SNK-q檢驗比較兩兩之間的差異，單因素方差分析比較多組間差異。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞存活率及細胞克隆數比較 培養24 h時PA + GSK組、PA組、CCT組及對照組細胞存活率分別為 87.16% ± 1.80%、45.37% ± 2.11%、42.64% ± 1.63%、100.00% ± 1.54%，細胞克隆數分別為（139.47 ± 2.39）、（70.68 ± 2.08）、（116.74 ±2.26）、（67.84 ± 1.89）、（158.36 ± 2.48）個。與對照組比較，PA組和CCT組細胞存活率、克隆形成數低（P均＜0.05）；與PA組比較，PA + GSK組細胞存活率和克隆形成數高（P均＜0.05）。

2.2 各組細胞凋亡率比較 培養24 h時PA + GSK組、PA組、CCT組及對照組細胞凋亡率分別為20.76% ± 1.31%、53.17% ± 1.46%、54.96% ±2.07%、15.67% ± 1.24%。與對照組比較，培養24 h時PA組和CCT組細胞凋亡率高（P均＜0.05）；與PA組比較，培養24 h時PA + GSK組細胞凋亡率低（P＜0.05）。

2.3 各組遷移細胞數、侵襲細胞數比較 PA +GSK組、PA組、CCT組及對照組細胞遷移細胞數分別為（196.73 ± 3.26）、（140.31 ± 2.18）、（136.47 ±2.21）、（210.76 ± 3.57）個，侵襲細胞數分別為（177.26 ± 2.69）、（101.46 ± 1.54）、（（98.38 ±1.65）、（189.43 ± 2.72）個。與對照組比較，PA組和CCT組遷移細胞數、侵襲細胞數少（P均＜0.05）；與PA組比較，PA + GSK組遷移細胞數、侵襲細胞數多（P均＜0.05）。

2.4 各組細胞p-PERK/PERK、ATF4、CHOP、E-cadherin、Vimentin蛋白相對表達量比較 培養24 h時各組細胞p-PERK/PERK、ATF4、CHOP、E-cadherin、Vimentin蛋白相對表達量比較見表1。

表1 培養24 h時各組細胞p-PERK/PERK、ATF4、CHOP、E-cadherin、Vimentin蛋白相對表達量比較（）

表1 培養24 h時各組細胞p-PERK/PERK、ATF4、CHOP、E-cadherin、Vimentin蛋白相對表達量比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與CCT組比較，#P＜0.05；與PA組比較，&P＜0.05。

組別PA + GSK組PA組CCT組對照組Vimentin 1.46 ± 0.15#&0.54 ± 0.06*0.52 ± 0.07*1.55 ± 0.12 p-PERK/PERK 0.19 ± 0.03#&0.69 ± 0.08*0.72 ± 0.06*0.18 ± 0.02 ATF4 0.37 ± 0.04#&1.20 ± 0.11*1.25 ± 0.12*0.34 ± 0.05 CHOP 0.27 ± 0.03#&1.20 ± 0.10*1.18 ± 0.09*0.23 ± 0.02 E-cadherin 0.48 ± 0.06#&1.36 ± 0.12*1.38 ± 0.14*0.41 ± 0.05

3 討論

結腸癌是導致全球死亡率增加的癌癥之一。PA作為中藥藥用真菌茯苓的提取物，不僅具有抗氧化、降血糖、抗炎、鎮靜及催眠等作用，對腫瘤也有一定的抑制作用［12］。比如，PA能夠通過誘導癌細胞凋亡來抑制卵巢癌的發展，且抑制胃癌的轉移和侵襲［8］。本研究結果發現，CCT組和PA劑量組的結腸癌細胞SW480存活率和克隆形成數量均低于對照組，細胞凋亡率高于對照組，揭示了PA能夠抑制結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，促進癌細胞凋亡，從而抑制結腸癌的發展，但其作用機制還未深入研究。

EMT是導致癌癥轉移的關鍵機制之一。EMT最初是一種發育程序，已被腫瘤細胞用來促進它們在遠處的遷移、侵襲和最終定植，從而導致癌癥患者預后不良，其導致的細胞間相互粘附作用的喪失是引起腫瘤細胞的遷移和侵襲的主要原因［13］。在EMT過程中，相關分子不僅可以作為腫瘤侵襲性的生物標志物，還可以作為癌癥治療的新潛在靶點，臨床發現，上皮標志物E-cadherin和間充質標志物N-cadherin等異常表達可以調節腫瘤的生長和轉移擴散［14］。本研究結果顯示，與對照組相比，CCT組和PA組結腸癌細胞SW480中EMT相關蛋白E-cadherin表達升高，Vimentin表達降低。PA可以加強SW480細胞間的相互黏附作用，抑制細胞從上皮向間充質的轉化，抑制結腸癌細胞的轉移和侵襲。

ER應激也在腫瘤的轉移和侵襲中起關鍵作用，比如PERK/ATF4信號通路被激活能夠抑制細胞增殖、遷移、侵襲以及EMT過程。PERK是內質網的一種跨膜蛋白激酶，介導ER反應。ER應激是由于各種因素的刺激，導致ER腔內積累了大量未折疊或者錯誤折疊的蛋白質。在ER應激條件下，PERK、需肌醇酶1（IRE-1）和轉錄激活因子6（ATF6）這三種ER膜蛋白被激活，從而激活相應的下游調節相關靶基因表達的途徑，減少ER腔的負荷，維持細胞內的環境穩定［15］。當PERK通過自磷酸化二聚化并被激活后，促進其下游eIF2α磷酸化，導致大多數mRNA翻譯受到抑制。然而，過度和持續的內質網應激可直接導致ER應激相關的細胞凋亡，在該過程中，ER應激可以跳過eIF2α磷酸化并激活ATF4，使其mRNA的翻譯增加，并易位到細胞核來調節細胞凋亡、脂質代謝等基因的表達［16］。例如，ATF4作為與蛋白質折疊相關的轉錄激活因子，可以誘導CHOP、p53等基因的表達，從而促進腫瘤細胞死亡，其在癌癥治療中有巨大潛力。CHOP是一種關鍵的促凋亡分子，可通過阻止細胞周期和誘導細胞死亡來導致身體損傷［17］。

PA能夠通過激活ER應激通路，誘導細胞凋亡且抑制細胞增殖來對肺癌、宮頸癌等產生抗癌活性。本研究結果顯示，CCT組和PA劑量組結腸癌細胞SW480中通路相關蛋白p-PERK/PERK、ATF4、CHOP的表達顯著高于對照組。表明在PA刺激后，ER應激被激活，PERK被活化，從而激活下游核轉錄因子ATF4的表達，該途徑的啟動會增加CHOP基因表達，觸發ER應激特異性級聯進而達到促進細胞凋亡的目的。進一步加入PERK抑制劑GSK發現，GSK消除了PA對結腸癌的抑制作用，同時ATF4和CHOP的表達降低，揭示了PA可能是通過激活PERK/ATF4信號通路抑制結腸癌細胞的轉移、侵襲和增殖，促進細胞凋亡。

綜上所述，PA可能通過促進PERK/ATF4通路蛋白、CHOP、E-cadherin蛋白表達，抑制Vimentin蛋白表達，抑制結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡。但本研究只采用體外細胞實驗，PA在體內對結腸癌細胞的影響還需進一步動物實驗研究與驗證。