黃水中乳酸檢測方法的研究開發

李隆淼，李楊華，廖勤儉，胡嬌，安明哲，羅珠

（宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓 644000）

乳酸是白酒中最重要的有機酸之一，其含量的高低直接影響酒的口感和后味[1]。白酒釀造過程中微生物的活動代謝產生大量乳酸，白酒蒸餾過程糟醅中的乳酸通過拖帶等作用進入到白酒中，因此酒醅和白酒中乳酸含量均較高。據統計，原酒中乳酸含量較高，為366～1581 mg/L[2]，作為白酒四大酸（乳酸、乙酸、丁酸和己酸）之一，分析其含量是檢測工作中重要的環節之一。白酒和糟醅中乳酸的檢測方法有氣相色譜法、高效液相色譜法、比色法、綜合法、離子色譜法等[3-6]。

黃水作為白酒固態發酵過程中重要的副產物，乳酸含量極高，但黃水中乳酸的檢測報道不多見，僅有的報道均是對黃水進行簡單稀釋過濾的前處理后用液相色譜法測定。梅婕[7]對黃水經離心和稀釋的前處理后，以甲醇和磷酸二氫銨的水溶液為流動相，通過安捷倫Poroshell 120 EC C18色譜柱（4.6 mm×150 mm）進行分離，樣品的回收率較高、精密度良好；馬金同[8]將黃水樣品經稀釋、過濾，直接進樣，以0.02 mol/L 磷酸二氫鉀作流動相，采用Acquity HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm×1.8 μm）分離，建立了黃水中乳酸的分析檢測方法，精密度和回收率均滿足方法學要求。

本研究改進了前人對黃水的前處理方法，采用甲醇震蕩除雜后進樣的方式，既保持了乳酸的純度也避免了黃水中大量大分子蛋白、纖維素等對色譜柱的污染。方法學驗證表明該方法精密度良好、回收率較高，同時延長了色譜柱壽命，可用于黃水中乳酸的批量檢測。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：四川某酒企黃水樣品。

試劑：甲醇（LC/MS級，純度≥99.5 %，Sigma）；乳酸（色譜純，純度≥89.8 %，ACROS）；磷酸（分析純，純度≥85%，西隴化工股份有限公司）。

儀器設備：超高效液相色譜儀（Agilent 1100 series），美國安捷倫科技公司，配二極管陣列檢測器；超純水發生器（Milli-Q Integral 3），美國Millipore公司；萬分之一分析天平（AE200），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；移液槍（Eppendorf）；0.2 μm有機濾膜（希波氏），太倉道邦色譜科技有限公司。

1.2 實驗方法

磷酸溶液的制備：準確量取1.2 mL 磷酸至1000 mL 容量瓶中，超純水溶解并定容至1000 mL，超聲振蕩均勻備用。

標準溶液的制備：準確稱取1 g 乳酸至100 mL容量瓶中，超純水溶解并定容至100 mL，該溶液為10000 mg/L 標準樣品母液，后將其分別稀釋至1000 mg/L、500 mg/L、250 mg/L、50 mg/L、25 mg/L，測定后制作標準曲線。

黃水樣品前處理：黃水中含有大量的大分子物質如還原糖、淀粉、蛋白質等,以及部分固形物、微生物等，這類雜質若不除去會對色譜柱產生不可逆的影響，因此進樣前需進行除雜。用9 倍體積甲醇沉淀黃水中蛋白質等大分子物質，振蕩5 min，14000 r/min 離心5 min 取上清液，上清液稀釋到適當倍數后0.2 μm濾膜過濾，待上機分析。

色譜條件：Venusil ASB C18色譜柱（4.6×250 mm×5 μm）；流動相：0.12 % H3PO4溶液，0.2 μm 濾膜過濾，流動相流速1 mL/min；檢測波長214 nm，柱溫箱30 ℃，進樣量10 μL。

2 結果與分析

2.1 乳酸色譜定性分析

取適量乳酸標準樣品母液用0.12 %磷酸溶液稀釋至1000 mg/L，按照1.2 中的前處理方法處理黃水樣品，檢測對比兩樣品以進行乳酸峰的定性分析。標準樣品和黃水樣品色譜檢測分析結果見圖1和圖2。從圖1 可以看出，乳酸標準品及黃水樣品色譜圖中乳酸保留時間一致，分別為4.979 min 和4.976 min，黃水樣品乳酸峰與乙酸峰分離度較好，判定該方法滿足測量需求。

圖1 乳酸標準樣品液相色譜圖

圖2 黃水樣品液相色譜圖

2.2 標準曲線的建立

以2.2 中5 個標準樣品濃度梯度作定量分析，以峰面積Y 為縱坐標，質量濃度（mg/L）X 為橫坐標進行線性回歸，檢測結果見表1，線性關系見圖3。

從表1 和圖3 得出以下結論：在25～1000 mg/L范圍內，乳酸濃度與峰面積的比值呈線性關系，回歸方程式為Y=0.2657X-0.0613,相關系數R2=1。

圖3 乳酸標準曲線

表1 不同濃度的標準樣品峰面積

2.3 精密度實驗

對同一黃水樣品和1000 mg/L標準樣品進行精密度試驗，在重復性條件下獲得平行測定結果的相對標準偏差（RSD值），評價其方法的重現性。驗證結果如表2 所示：在重復性條件下平行測定的標準樣品和黃水樣品的RSD 值分別為0.04 %、0.74 %、0.03%和0.52%，精密度符合方法學的要求。

表2 精密度實驗

2.4 加標回收率

取白酒黃水樣品，一份經1.2 中前處理方法處理后，作為空白樣品及本底值，另外3 份分別加入10000 mg/L、15000 mg/L、20000 mg/L 乳酸標準溶液，再經1.2 中前處理方法處理后，進行回收率測定。檢測結果見表3。

從表3 可以看出，在黃水樣品中加入已知濃度的乳酸標準品的回收率較好，低、中、高濃度的回收率分別為101.14 %、89.47 %和91.38 %，滿足回收率的要求。

表3 黃水中乳酸回收率

3 結論

本研究建立了用高效液相色譜快速檢測黃水中乳酸含量的分析方法。黃水經過甲醇除雜前處理稀釋過濾并直接進樣，等度洗脫分析，乳酸出峰時間保持在5 min 左右；在25～1000 mg/L 范圍內，有較好的線性關系，R2為1，加標回收率為89.47%～101.14%，檢出限為1.15 mg/L，定量限為3.83 mg/L。該方法前處理用甲醇沉淀黃水中的蛋白質、纖維素等大分子物質可以保持樣品的純度，同時保證色譜柱不被污染，延長其壽命，適用于黃水中乳酸的分析檢測。