分光光度法測定配制酒中氰化物的不確定度評定

葉春常，陳桂云，黎穎欣，胡雯艷，陳韻

(廣州市食品檢驗所，廣東廣州 511400)

酒中氰化物主要由原料(如木薯、代用品、豆類及其他果核或混入一些野生植物)中的氰甙類配糖體在發(fā)酵過程中水解產(chǎn)生[1]。氰化物屬于有毒物質(zhì)，極少量的氰化物就會導(dǎo)致人或者動物中毒甚至死亡。因此，氰化物是酒類一項非常重要的安全指標[2]。

目前用于測定酒中氰化物的方法主要有分光光度法[3-4]、原子吸收法[5-6]、硝酸銀滴定法[7]、氣相色譜法[8-9]、離子色譜-脈沖安培檢測法[10]等。國家標準方法GB 5009.36—2016《食品安全國家標準 食品中氰化物的測定》[11]中測定氰化物的方法就是分光光度法和氣相色譜法。在上述的檢測方法中，分光光度法是最常見的方法。

本研究參考CNAS—GL006：2019《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[12]，通過分析分光光度法測定配制酒中氰化物的過程中影響檢測結(jié)果的不確定度因素，評估該檢測的不確定度，為實驗室質(zhì)量控制提供科學(xué)、準確的依據(jù)[13]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

試驗樣品：市售配制酒。

試劑及耗材：酚酞、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、冰乙酸、無水乙醇（均為AR），廣州化學(xué)試劑廠；磷酸氫二鈉（AR），廣東光華科技股份有限公司；異煙酸（AR），阿拉丁；酒石酸、氯胺T（均為AR），國藥集團化學(xué)試劑有限公司；吡唑啉酮(AR)，上海晶純化學(xué)試劑廠；氰化物標準溶液（50 μg/mL），中國計量科學(xué)研究院。

儀器設(shè)備：U-3010 紫外可見分光光度計，日本日立公司；WD20A12E 數(shù)控水浴鍋，美國Poly-Science 公司；C-MAG HP 10（S25）控溫加熱器，艾卡廣州儀器設(shè)備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 分析步驟

參考GB 5009.36—2016 中5.2 配制酒的方法進行處理。

1.2.2 計算公式

配制酒中氰化物（以HCN計，按100 %酒精度換算）的含量按下式計算：

式中：X為樣品中氰化物含量，mg/L；X0為平均實測含量（以CN-計），μg；m 為試樣體積，mL；V 為樣品稀釋倍數(shù)；P 為酒精度，%vol；1000 為換算系數(shù)；MHCN為氰化氫（HCN）的摩爾質(zhì)量，g/mol；MCN為氰離子（CN-）的摩爾質(zhì)量，g/mol。

1.2.3 測量不確定的來源分析

根據(jù)檢驗過程及計算公式，氰化物含量的不確定度來源及其分量如表1所示。

試樣體積、實測含量和樣品制備的重復(fù)性合并為整體樣品測定重復(fù)性考慮。樣品配制酒為液體，取樣時充分搖勻，可認為試樣是均勻的，具有代表性，所以樣品均勻性對不確定度的影響可忽略不計。相應(yīng)的不確定度來源及其分量修正如表2所示。

表2 經(jīng)過修正后的不確定度來源及其分量

合成標準不確定度可用各分量的標準不確定度合成：

上式可轉(zhuǎn)換為：

2 結(jié)果與分析

2.1 試樣體積引入的不確定度urel(1)評定

渾濁或有色樣品，取25.0 mL 試樣進行蒸餾。不確定度來源為移液管的校準偏差和溫度效應(yīng)，校準偏差的計算可參照校準證書提供的擴展不確定度計算，溫度效應(yīng)根據(jù)公式（4）計算：

其中，2.1×10-4為水的膨脹系數(shù)，單位為/℃；t0為量器校準時的室溫，20 ℃；t1為配制標準溶液時的室溫，25 ℃。

移液管引入的相對標準不確定度按公式（5）計算：

其中，U 為移液管校準證書提供的擴展不確定度U=0.015 mL，k 為證書提供的包含因子k=2，V 為移液管的體積。

2.2 樣品實測含量引入的不確定度urel(2)評定

2.2.1 標準曲線擬合引入的不確定度urel(2.1)

氰化物含量是通過最小二乘法擬合的曲線計算所得，不確定度與樣品測定的次數(shù)和標準系列測定次數(shù)有關(guān)，同時和樣品平均值與標準系列平均值的差值有關(guān)。

檢測過程中，配制6個濃度點（0.00 μg、0.40 μg、0.80 μg、1.20 μg、1.60 μg、2.00 μg）的標準系列，每濃度點平行測定3次，制備10 個平行樣，得到10 個樣品測定值，用最小二乘法計算標準曲線的回歸方程：y=bx+a，根據(jù)擬合的回歸曲線求得被測樣品的氰化物含量。測定結(jié)果見表3、表4。

根據(jù)擬合得到的曲線，按照表3、表4、公式（6）、公式（7）計算urel(2.1)，相關(guān)數(shù)據(jù)填入表5中。

表3 回歸曲線的吸光度計算

表5 標準曲線擬合引入的不確定度urel(2.1)計算

2.2.2 標準溶液引入的不確定度urel(2.2)評定

標準溶液引入的不確定度包括標準溶液濃度的不確定度urel(2.2.1)和標準溶液配制過程引入的不確定度urel(2.2.2)，則：

2.2.2.1 標準溶液濃度的不確定度urel(2.2.1)評定

根據(jù)標準物質(zhì)證書，氰化物標準溶液標準值為50.0 μg/mL，相對擴展不確定度為1 %（k=2），轉(zhuǎn)換成相對標準不確定度：

2.2.2.2 標準溶液稀釋過程引入的不確定度urel(2.2.2)評定

標液稀釋：用單標吸管吸取2.00 mL 標準溶液至100 mL 容量瓶中，用2 g/L 氫氧化鈉溶液定容，為標準使用液。2 mL 刻度吸管分別吸取0 mL、0.40 mL、0.80 mL、1.20 mL、1.60 mL、2.00 mL 標準使用液于10 mL 具塞比色管中。標準溶液稀釋過程中的體積受玻璃量器的容量偏允差和實驗室溫度的波動影響，配制過程中使用單標吸管、容量瓶、刻度吸管、具塞比色管，將各類量器相應(yīng)的數(shù)據(jù)填入表6中，參考公式（4）、（5）分別計算出各量器的相對標準不確定度。

表6 量器引入的不確定度

按B 類評定計算相對標準不確定度標準溶液稀釋過程引入的不確定度urel(2.2.2)：

2.2.3 儀器示值引入的不確定度urel(2.2.3)評定

檢測過程使用的分光光度計的示值分辨率會對吸光度值讀數(shù)產(chǎn)生影響，從而引入了不確定度，儀器計量證書提供的擴展不確定度U=0.3 %（k=2），由樣品實測含量平均值X0代入回歸方程y=bx+a 中得到平均吸光度值A(chǔ)=0.324，儀器示值引入的不確定度計算可按公式（12）進行。

樣品實測含量引入的相對標準不確定度urel(2)為：

2.3 樣品制備引入的不確定度urel(3)評定

試樣進行蒸餾后定容至50 mL比色管，用2 mL單標吸管吸取2.0 mL 餾出液測定。此時不確定度來源為餾出液移取移液管urel(3.1)和定容比色管體積不確定度urel(3.2)。由公式（14）、表6得：

2.4 樣品酒精度引入的不確定度評定urel(4)評定

樣品氰化物含量平均值X0（以CNˉ計）需經(jīng)酒精度換算為試樣中氰化物（以HCN計，按100%vol酒精度換算）的含量，酒精度的結(jié)果引入了不確定度。經(jīng)測定，樣品酒精度含量P=41.2%vol，擴展不確定度U=0.3 %vol（k=2），酒精度的相對標準不確定度為：

2.5 樣品重復(fù)性測定引入的不確定度urel(5)評定

制備10 個平行樣，每個樣品測定2 次。測定結(jié)果如表4。

單次測量的不確定度為：

測量結(jié)果相對標準不確定度為：

2.6 氰化氫摩爾質(zhì)量引入的不確定度urel(6)評定

從現(xiàn)行有效的IUPAC 原子量表中查得HCN 和CN-各元素的原子量和不確定度：

表7 HCN中各元素的原子量和不確定度

對于每一個元素來說，標準不確定度是將IUPAC 所列不確定度做為矩形分布的邊界計算得到的。因此相應(yīng)的標準不確定度等于查得數(shù)值除以。

HCN的摩爾質(zhì)量為：

相對標準不確定度為：

2.7 氰離子摩爾質(zhì)量引入的不確定度urel(7)評定

表8 各分量的不確定度匯總

CN-的摩爾質(zhì)量為：

相對標準不確定：

2.8 合成標準不確定度及擴展不確定度計算

2.8.1 合成標準不確定度

將上述數(shù)據(jù)urel(1)—urel(7)代入公式（2）得到被測樣品含量的合成相對標準不確定度uc,rel(X)，再按公式（22）轉(zhuǎn)換成合成標準不確定度uc(X)：

2.8.2 擴展不確定度

測量結(jié)果符合正態(tài)分布，取置信概率p=95%，包含因子k＝2，則擴展不確定度U為：

2.9 結(jié)果報告

樣品中氰化物的含量為(2.5±0.1)mg/L，k=2。

3 結(jié)論

本研究采用分光光度法對配制酒中的氰化物含量進行檢測，分析評估檢測過程的各個不確定度來源及其大小。結(jié)果表明，實測含量、測定重復(fù)性引入的不確定度最大，樣品制備和酒精度引入的不確定度次之，試樣體積、氰化物和氰離子的分子量引入的不確定度最小。因此，在檢測過程中，標準溶液的配制要準確，儀器應(yīng)該嚴格按要求及時校準并保持良好的狀態(tài)，規(guī)范檢測過程中的操作，才能更好提高檢測的準確度。