基于高通量測(cè)序天麻土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

陳 瑞 楊德強(qiáng) 趙長林

（1. 西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650233；2. 云南國誠農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，云南 昭通 657000）

天麻（Gastrodia elata）又名赤箭、離母、獨(dú)搖草，為蘭科天麻屬多年生共生草本植物，主產(chǎn)于中國云南、貴州、湖南、湖北、陜西、四川等省，其中云南省昭通市彝良縣、永善縣、綏陽縣等地區(qū)所產(chǎn)天麻為特色道地藥材。天麻性平，味甘，歸肝經(jīng)，“此草獨(dú)莖而葉攢其端，無風(fēng)自動(dòng)，故曰鬼獨(dú)搖草，天麻可用于頭痛眩暈、肢體麻木、癲癇抽搐等癥的治療”[1]。此外，天麻廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域，其塊莖中主要化學(xué)成分有天麻素、香莢蘭醇、酚性化合物[2]，能增強(qiáng)細(xì)胞免疫和機(jī)體非特異性免疫[3-5]。然而，天麻栽培存在連作障礙，目前研究表明藥用植物連作產(chǎn)生的化感自毒物質(zhì)引起的土壤微生態(tài)變化是其發(fā)生連作障礙的重要原因[6]。連作障礙是指在同一塊土地上連續(xù)栽培同種作物時(shí)，盡管在正常的栽培管理?xiàng)l件下，也出現(xiàn)長勢(shì)變?nèi)酢a(chǎn)量減少、品質(zhì)降低、病蟲害加重的現(xiàn)象，其主要原因包括：土傳病害的影響、土壤微生物的影響、植物化感自毒作用、土壤酶活性變化、理化性質(zhì)的改變。隨著天麻栽培面積的不斷擴(kuò)大及中藥材規(guī)范化種植的推行，藥用植物栽培中主要是土壤環(huán)境惡化導(dǎo)致連作障礙進(jìn)而嚴(yán)重影響中藥材規(guī)范化種植及種植基地建設(shè)，連作障礙已成為限制天麻生產(chǎn)發(fā)展和體系構(gòu)建的重要因素[7-12]。

引起藥用植物連作障礙的原因主要有三方面，一是土壤微生物引起的病害，二是根際化感作用，三是土壤養(yǎng)分不足或營養(yǎng)元素缺失[13]。前人研究證實(shí)，作物根系分泌物、植株殘茬腐解物為病原菌營造了良好的繁殖條件，豐富的營養(yǎng)和寄主使病原菌快速增殖，導(dǎo)致土壤病原菌的不斷積累造成重茬問題，由于植物殘?jiān)纸馕锖椭参锔捣置谖锔淖兞烁H微生物群落組成致使土壤微生物的比例失調(diào)引起連作障礙[14-15]；導(dǎo)致連作障礙發(fā)生的原因并非單一因素，不同作物連作產(chǎn)生的主導(dǎo)因素也有所不同，因此如何解決作物連作障礙一直是農(nóng)林領(lǐng)域世界性的難題[16]。

近年來，我國藥用植物與作物連作障礙研究逐漸受到重視，該領(lǐng)域快速發(fā)展，科研水平不斷提升[10]。但我國天麻連作障礙研究較少，仍有許多卡脖子問題困惑麻農(nóng)，本研究基于在云南省昭通市彝良縣蕎山鎮(zhèn)開展天麻種植前后及方竹修復(fù)后土樣的采樣，用宏基因組測(cè)序方法揭示天麻種植土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)而為后期搞清天麻連作障礙成因及破障菌劑開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試土樣采集于云南省昭通市彝良縣蕎山鎮(zhèn)，該鎮(zhèn)屬于昭通地區(qū)天麻主產(chǎn)地，位于104°16′14″ E，27°39′33″ N，平均海拔1 650 m，年均氣溫11 ℃，年均降水量860 mm。山高坡陡，常年多霧，土壤為酸性或微酸性土，含有豐富的腐殖質(zhì)，適宜于天麻的生長。本研究分批次采樣，采樣過程中土樣設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，使用50 mL康寧離心管進(jìn)行分裝，確保土樣完整無污染。取樣完成后低溫保藏，每個(gè)樣本置于-80 ℃冰箱中保存。本次采樣區(qū)域?yàn)槁檗r(nóng)開展林下種植天麻片區(qū)的天麻原始土、天麻1 年土和方竹輪作土。采集土壤樣品名稱編號(hào)分組見表1。

表1 土壤樣品編號(hào)及分組Table 1 Soil sample number and assigned group

1.2 試驗(yàn)方法步驟

1.2.1 基因組DNA 提取

使用特定的DNA 提取試劑盒，提取樣本的總基因組，DNA 提取后使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增

引物：16S 引物V3 + V4 區(qū)域；

341F: CCTACGGGNGGCWGCAG；

806R: GGACTACHVGGGTWTCTAAT。

1.2.3 PCR 產(chǎn)物檢測(cè)、純化和定量

電泳檢測(cè)，使用Thermo Scientific 公司Gene-JET 試劑盒純化并回收產(chǎn)物。

1.2.4 建庫測(cè)序

用illumina 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，主要有如下3 個(gè)步驟：1）PE reads 拼接：使用FLASH v1.2.7軟件；2）Tags 過濾：使用Trimmomatic v0.33 軟件；3）去除嵌合體：使用UCHIME v4.2 軟件。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

劃分OTU（Operational taxonomic units）、多樣性及差異性分析，利用Qiime2[17]進(jìn)行數(shù)據(jù)處理：拼接（vsearch）[18]，去除引物（cutadapt）[19]，過濾低質(zhì)量數(shù)據(jù)[20]，基于有效數(shù)據(jù)進(jìn)行去噪和物種分類分析，形成擴(kuò)增子序列變屏（Amplicon Sequence Variants，ASV）和物種分類等級(jí)的物種特征表（Feature table）。

1.2.6 聚類分析

使用QIIME（Version 1.8.0）軟件[17]中的UCLUST[21]對(duì)Tags 在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類、獲得OTU，基于Siva （細(xì)菌）分類學(xué)數(shù)據(jù)庫，用柱形圖顯示各樣品的分類學(xué)注釋和OTU個(gè)數(shù)。

1.2.7 物種組成分析

利用相關(guān)軟件繪制樣本各分類學(xué)水平下的群落結(jié)構(gòu)圖，用特定的物種分類樹進(jìn)行研究，利用Venn[22]圖展示樣本之間共有、特有ASV 數(shù)目，直觀地表現(xiàn)出樣本間ASV 的重合情況，結(jié)合 ASV所代表的物種，找出不同環(huán)境中的核心微生物。

1.2.8 物種差異分析

通過統(tǒng)計(jì)分析，找出分組間豐度變化差異顯著的物種，比較組內(nèi)差異和組間差異的大小，判斷不同分組間的群落結(jié)構(gòu)差異是否具有顯著意義。在門、綱、目、科、屬、種水平下進(jìn)行組間物種差異顯著性分析和物種Metastat 差異分析；用軟件STAMP[23]做組間的Welch's t-test 檢驗(yàn)，找出差異顯著的物種。

1.2.9 物種多樣性分析

進(jìn)行Alpha、Beta 多樣性分析，并對(duì)物種注釋在各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。通過UniFrac 分析[24]利用系統(tǒng)進(jìn)化的信息來比較樣本間的物種群落差異，主要有：

1）主成分分析：主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）將多組數(shù)據(jù)的差異反映在坐標(biāo)圖上，通過分析不同樣品OTU（97%相似性）組成反映樣品的差異和距離。

2）主坐標(biāo)分析：主坐標(biāo)分析（Principal coordinates analysis，PCoA）與PCA 類似，基于binary jaccard, bray curtis, unweighted unifrac 和weighted unifrac 距離進(jìn)行分析，選取貢獻(xiàn)率最大的主坐標(biāo)組合進(jìn)行作圖展示。

3）主加權(quán)組平均分析：通過非加權(quán)組平均法（ Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Mean，UPGMA），所產(chǎn)生的聚類樹聚類分析，樹枝的距離和聚類的遠(yuǎn)近可以觀察樣本間相似性。

4）基于OTU-Table 和上述4 種距離矩陣?yán)L制樣本聚類熱圖，從聚類中了解樣本之間的相似性，進(jìn)行多樣性指數(shù)與環(huán)境因子的相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土樣細(xì)菌OTU 組成與分析

基于有效OTU 數(shù)據(jù)進(jìn)行去噪和物種分類得到各個(gè)樣本細(xì)菌ASV（圖1），由圖1 可知Zhaochang l 021 細(xì)菌ASV 最大，為2 034；Zhaochangl 019 細(xì)菌ASV 最小，為1 038，樣本的細(xì)菌總ASV 為3 004。

圖1 各樣本ASVFig. 1 ASV number per sample

將豐度小于0.001 的ASV 過濾掉，比較3 組樣本細(xì)菌ASV（圖2），由圖2 可知3 組樣本共有細(xì)菌ASV 為95，從charlle001、charlle002 和charlle006 特有細(xì)菌ASV 可知，原壤charlle001 特有細(xì)菌數(shù)量最多，其次為方竹壤charlle006，二者均高于一麻壤charlle002 所含有的特有細(xì)菌數(shù)量。結(jié)果表明：天麻原壤具有最多的特有細(xì)菌，但種植1 年天麻后土壤種特有細(xì)菌減少，隨后將地方經(jīng)濟(jì)作物方竹種植于一麻壤后，土壤中特有細(xì)菌數(shù)量呈現(xiàn)回升趨勢(shì)。

圖2 3 組樣本ASV 花瓣圖Fig. 2 ASV petal maps of 3 groups of samples

3 組樣本細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果見圖3，不同顏色的扇形表示3 個(gè)不同的樣品，扇形的大小表示該樣品在該分類上相對(duì)豐度的比例大小。餅圖下方的拉丁名代表相應(yīng)的分類階元，從系統(tǒng)發(fā)育分類樹上可明確3 組樣本細(xì)菌按門主要可分為Acidobacteria、Chloroflexi、Firmicutes、Proteobacteria、Planctomycetes 和Verrucomicrobia；按綱主要可分為Actinobacteria、Alphaproteobacteria、Anaerolineae、Chloroflexi、Gammaproteobacteria、Holophagae、 Ktedonobacteria、 Pedosphaerae、 Phycisphaerae、 Planctomycetia 和Verrucomicrobiae； 按目主要可分為Bryobacterales、Burkholderiales、Chthoniobacterales、Ktedonobacterales、Pedosphaerales、Lachnospirales、Rhizobiales、Solibacterales 和Tepidisphaerales；按科主要可分為Bacteoidales、Bryobacteraceae、Chthoniobacteraceae、Koribacteraceae、Ktedonobacteraceae、Lachnospiraceae、Muribaculaceae、Nitrosomonadaceae、Pedosphaeraceae 和Solibacteraceae；按屬主要可分為Acidibacter、Acidothermus、Bryobacter、Clostridia、Koribacter、Solibacter和Udaeobacter。

圖3 樣本細(xì)菌分類學(xué)系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 The taxonomic phylogenetic tree of the sample bacteria

2.2 土樣細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及相對(duì)豐度

本研究將豐度低的部分物種合并為Others 在圖4 中顯示，圖5 中Unknown 代表未得到分類學(xué)注釋的ASV，一種顏色代表一個(gè)物種，色塊長度表示物種所占相對(duì)豐度比例。單個(gè)樣本在門水平分析的樣本豐度（圖4）和種水平分析的樣本豐度（圖5）分析結(jié)果表明：樣本豐度按門等級(jí)主要可分為Acidobacteria、Actinobacteriota、Bacteroidota、Chloroflexi、Firmicutes、Gemmatimonadota、Latescibacterota、Myxococcota、Nitrospirota、Patescibacteria、Planctomycetota、 Proteobacteria、 SAR324、 Verrucomicrobiota 和WPS-2，其中Acidobacteria 豐度占比最大；按種等級(jí)主要可分為Bellilinea 和Holophaga；其中未得到分類學(xué)注釋的細(xì)菌物種Unknown 豐度所占比例較大。

圖4 單個(gè)樣本在門水平上的相對(duì)豐度Fig. 4 Relative abundance of a single sample

圖5 單個(gè)樣本在種水平上的相對(duì)豐度Fig. 5 Relative abundance of a single sample

組間樣本豐度門水平分析（圖6）表明：3 個(gè)組中Acidobacteria 細(xì)菌豐度最大，charllle006 ＞charllle002 ＞ charllle001；Proteobacteria 細(xì) 菌 豐 度charllle006 ＞ charllle002 ＞ charllle001；Gemmatimonadota 細(xì) 菌 豐 度 charllle001 ＞ charllle002 ＞charllle006；Verrucomicrobiota 細(xì)菌豐度charllle006 ＞charllle002 ＞ charllle001。

通過circos[25]繪制物種豐度與樣本相互關(guān)系（圖7），揭示各分組樣本中不同物種所占的比例以及物種在不同分組中的比例關(guān)系。篩選相對(duì)豐度大于0.01 的物種以目水平繪圖，第1 圈左半邊為物種，右邊為樣本分組，第2 圈左邊一半為物種中各樣本的比例，右邊一半為樣本中各物種的比例，內(nèi)2 圈與外2 圈標(biāo)注相同，最里面連線為物種豐度與樣本分組之間的連線。在系統(tǒng)分類的細(xì)菌目中，3 組優(yōu)勢(shì)菌組成較為相似，均以Acidobacterales、 AD3、 Bacteroidales、 Burkholderiales、 Bryobacterales、 Ktedonobacterales、 Pedosphaerales、 Rhizobiales、 Subgroup-2、 和WPS-2 細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)菌，但各優(yōu)勢(shì)菌相對(duì)豐度有一定差異。其中，charlle001 目水平相對(duì)豐度較大的主要優(yōu)勢(shì)菌依次為：Bacteroidales ＞ Subgroup-2 ＞Ktedonobacterales ＞ AD3 ＞ Acidobacterales ＞ WPS-2 ＞Bryobacterales ＞ Burkholderiales ＞ Rhizobiales ＞ Pedosphaerales；charlle002 目水平相對(duì)豐度較大的主要優(yōu)勢(shì)菌依次為：Subgroup-2 ＞ Acidobacterales ＞AD3 ＞ Ktedonobacterales ＞ Rhizobiales ＞ WPS-2 ＞Burkholderiales ＞ Pedosphaerales ＞ Bryobacterales ＞Bacteroidales；charlle006 目水平相對(duì)豐度較大的主要優(yōu)勢(shì)菌依次為：Subgroup-2 ＞ Acidobacterales ＞Ktedonobacterales ＞ Pedosphaerales ＞ WPS-2 ＞Rhizobiales ＞ Burkholderiales ＞ Bryobacterales ＞Bacteroidales ＞ AD3。Bacteroidales 細(xì) 菌 豐 度 在charlle001 中 最 大（ 20%）， 在 charlle002 和charlle006 中幾乎沒有；Subgroup-2 細(xì)菌豐度在charlle006 中最大（20%），在charlle001 中最小（10%）；Acidobacterales 細(xì)菌豐度在charlle006中最大（18%），在charlle001 中最小（8%）；Ktedonobacterales 細(xì)菌豐度在charlle006 中最大（14%），在charlle001 和charlle002 中較小。上述結(jié)果表明，3 組土樣主要優(yōu)勢(shì)菌屬大致相同，但各組優(yōu)勢(shì)菌相對(duì)豐度存在較大差異；原壤charlle001 中Bacteroidales 細(xì)菌較多，但通過種植1 年天麻后，一麻壤charlle002 中Bacteroidales 細(xì)菌急劇減少，且細(xì)菌物種數(shù)量也呈減少趨勢(shì)；方竹壤中Subgroup-2、Ktedonobacterales 細(xì)菌豐度呈現(xiàn)回升態(tài)勢(shì)，均在10%以上。進(jìn)而可以得出結(jié)論：該地區(qū)原壤通過種植天麻導(dǎo)致土壤中細(xì)菌物種總數(shù)和總豐度呈降低趨勢(shì)，通過種植方竹，一麻壤得到修復(fù)，物種總數(shù)和總豐度再次回升，進(jìn)而推測(cè)天麻連作障礙與土壤中細(xì)菌物種總數(shù)和豐度密切相關(guān)。

通過門水平Heatmap 熱圖聚類分析 (圖8)顯示物種豐度與不同物種的相似情況，圖8 中包含物種信息及樣本信息。2 個(gè)物種豐度越相似，距離越近，枝長越短；橫向聚類表示不同樣本的各物種豐度的相似情況，默認(rèn)最多展示豐度最高的前35 個(gè)物種。研究結(jié)果顯示：1）Zhaochangl 019、Zhaochangl 020、Zhaochangl 021 聚至charlle 001； Zhaochangl 015、 Zhaochangl 016、Zhaochangl 017 聚至charlle 002；Zhaochangl 032、Zhaochangl 033 聚至charlle 006；2）全部樣本聚為兩個(gè)大類：charlle001 與charlle 006（group I）、charlle002（group II），結(jié)果揭示兩類細(xì)菌物種總豐度存在差異；3）原壤中Zhaochangl 020 和Zhaochangl 021 樣 品 內(nèi)4 門Bacteroidales、Campilobacterota、Cyanobacteria 和Firmicutes 細(xì)菌豐度極高，而一麻壤和方竹壤樣品內(nèi)該4 門細(xì)菌豐度極低；原壤中Zhaochangl 019, Zhaochangl 020 和Zhaochangl 021 樣品內(nèi)3 門Actinobacteriota,Myxococcota, Proteobacteria 細(xì)菌豐度較低，而一麻壤和方竹壤樣品內(nèi)該3 門細(xì)菌豐度較高。該結(jié)果揭示天麻原壤經(jīng)過種植1 年天麻，細(xì)菌群落發(fā)生變化，有益細(xì)菌減少，再次種植天麻將導(dǎo)致連作障礙，如一麻壤種植方竹后，其方竹壤內(nèi)有益細(xì)菌再次增加，待方竹豐收后，該樣地還可繼續(xù)種植天麻，進(jìn)而提升土地利用效率。樣品Zhaochangl 019 內(nèi)4 門Bacteroidales、Campilobacterota、Cyanobacteria、Firmicutes 細(xì) 菌 豐 度 較 低，推測(cè)主要原因?yàn)樵摬蓸狱c(diǎn)附近有可能種植過天麻。

圖6 組間樣本在門水平的相對(duì)豐度Fig. 6 Relative abundance of samples among groups

圖7 樣本與物種豐度circos 圖Fig. 7 Circos plots of samples and species abundance

圖8 物種相對(duì)豐度聚類熱圖Fig. 8 Clustering heatmap of relative species abundance

2.3 土樣細(xì)菌多樣性分析

使用Qiime2 軟件，對(duì)樣本Alpha 多樣性指數(shù)進(jìn)行評(píng)估。為比較樣本間的多樣性指數(shù)，分析時(shí)將Feature table 先均一化之后再計(jì)算多樣性指數(shù)。Alpha 多樣性是反映豐富度和均勻度的綜合指標(biāo)，豐富度表示物種的有無和群落中物種分配上的均勻性，即物種豐度大小是否均勻，群落豐富度的指數(shù)主要包括Richness、Chao1 和Ace 等指數(shù)。既考慮豐富度又考慮均勻性的指數(shù)包括Shannon 和Simpson 等指數(shù)，各樣本Alpha 多樣性指數(shù)值統(tǒng)計(jì)如表2 所示。

表2 樣本細(xì)菌 Alpha 多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistical analysis of bacterial Alpha diversity index of the samples

表2 中各樣本細(xì)菌物種數(shù)及Alpha 多樣性指數(shù)揭示樣本Zhaochangl 015、 Zhaochangl 016、Zhaochangl 017 物種數(shù)較均衡， 原壤樣本Zhaochangl 021 物種數(shù)最大，Zhaochangl 019 物種數(shù)最小。辛普森指數(shù)越大，對(duì)應(yīng)樣本中細(xì)菌群落多樣性越小，Zhaochangl 015 的辛普森指數(shù)最大，其次是Zhaochangl 017，表明這兩種樣本中細(xì)菌群落多樣性較小。

使用R 語言ggplot2 包繪制 PCA 散點(diǎn)圖（圖9），組間PCA 分析結(jié)果表明：縱坐標(biāo)水平顯示方竹壤charlle006 介于原壤charlle001 和一麻壤charlle002 之間，3 組樣本中各樣本離散程度不同，其原因可能與采樣點(diǎn)距離不同有關(guān)。PCoA 分析（圖10）結(jié)果表明：charlle002 和charlle006 樣本聚類較近，charlle001 樣本較分散，該結(jié)果與細(xì)菌群落聚類分析結(jié)果一致。

圖9 樣本PCA 散點(diǎn)圖Fig. 9 Sample PCA scatter plot

圖10 樣本PCoA 分析圖Fig. 10 Sample PCoA analysis graphics

通過R 語言ggplot2 采用非加權(quán)配對(duì)平均法對(duì)樣本進(jìn)行層次聚類，以判斷各樣本間物種組成的相似性。樣本層次聚類樹和相對(duì)豐度（圖11）分析表明： Acidobacteriota、Chloroflexi 和Proteobacteriota 細(xì)菌為樣本主要優(yōu)勢(shì)菌，樣本Zhaochangl 020 和Zhaochangl 021 中Acidobacteriota 細(xì)菌豐度明顯較低，原壤Zhaochangl 020、Zhaochangl 021中Bacteroidota 和Firmicutes 細(xì)菌豐度較高，而一麻壤和方竹壤中幾乎沒有，推測(cè)Bacteroidota 和Firmicutes 細(xì)菌可能是天麻種植土壤中的有益菌。一麻壤的3 樣本聚類為一支，表明樣本細(xì)菌組成與豐度較相似。方竹壤兩樣本Zhaochangl 032 和Zhaochangl 033 聚為一類，樣本中Acidobacteriota 豐度最大，同時(shí)Verrucomicrobiota 豐度也較大。

圖11 UPGMA 樣本聚類樹分析Fig. 11 UPGMA sample cluster tree analysis

2.4 樣本細(xì)菌差異分析

通過R 語言pheatmap 繪制樣本聚類熱圖（圖12），根據(jù)顏色梯度的變化可直觀地看出樣本間的差異性。圖12 中左側(cè)和上方展示了樣本的聚類關(guān)系，中間顏色梯度變化代表各樣本表達(dá)量，紅色越深表示樣本表達(dá)量越高。圖12 中顏色梯度變化明顯，同組樣本聚類在一起表明樣本間具相似性；charlle006 兩個(gè)樣本與charlle002 的3 個(gè)樣本距離較遠(yuǎn)，揭示兩組間細(xì)菌群落組成差異較大。

LDA Effect Size[26]分析能夠在組與組之間尋找具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的Biomarker，即組間差異顯著的物種。不同組中豐度差異顯著物種包括細(xì)菌的門、綱、目，柱狀圖的長度代表差異物種的影響大小。圖13 表明：charlle001 中顯著差異細(xì)菌為p-Bacteroidota、 c-Bacteroidia 和 o-Anaerolineales；charlle002 中顯著差異細(xì)菌為o-Tepidisphaerales、c-Holophagae、o-Nitrospirales、p-Nitrospirota 和c-Nitrospiria；charlle006 中 顯 著 差 異細(xì) 菌 為 c-Acidobacteria、 p-Acidobacteriota、o-Acidobacteriales、 c-Ktedonbacteria、 o-Ktedonbacterales、o-Elsterales和o-Solibacterales。

在目水平做組間Welch's 檢驗(yàn)，3 組樣本charlle001、charlle002 和charlle006 兩兩比較做組間物種差異分析（圖14），圖14 左邊為組間差異物種豐度展示，右邊為組間差異置信度展示。圖14a 表明：原壤charlle001 和方竹壤charlle006組間細(xì)菌Pedosphaerales 和Acidobacteriales 相對(duì)豐度差異顯著，且兩目細(xì)菌在charlle006 中豐度更高，其余各目細(xì)菌差異不明顯。

原壤charlle001 和一麻壤charlle002 組間圖14b 表明：Rhizobiales、Chthoniobacterales、Pirellulales、 Holophagales、 Xanthomonadales、 Gaiellales、Fankiales 和Solirubrobacterales 細(xì)菌相對(duì)豐度差異顯著，其中Rhizobiales 最為突出，該目細(xì)菌在charlle002 中豐度極高。

圖14c 表明：一麻壤charlle002 和方竹壤charlle006 組 Tepidisphaerales、 Gemmatales、 Pedosphaerales 和Chthoniobacterales 細(xì)菌相對(duì)豐度差異顯著，Pedosphaerales 在charlle006中豐度更高，而 Tepidisphaerales、 Gemmatales 和 Chthoniobacterales 在charlle002 中豐度更高，其余細(xì)菌無顯著差異。

圖12 樣本聚類熱圖Fig. 12 Sample clustering heatmap

圖13 差異物種LDA 柱狀圖Fig. 13 LDA histogram of different species

圖14 樣本微生物群落差異比較Fig. 14 Comparison of microbial community differences in samples

3 結(jié)論與討論

本研究共分析8 個(gè)土樣Zhaochangl 015、Zhaochangl 016、Zhaochangl 017、Zhaochangl 019、Zhaochangl 020、 Zhaochangl 021、 Zhaochangl 032，Zhaochangl 033，分為3 組原壤charlle001、一麻壤charlle002、方竹壤charlle006。土壤高通量測(cè)序分析結(jié)果揭示了各個(gè)土樣細(xì)菌種類與物種豐度，并通過各樣本細(xì)菌組成和群落結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)搞清了彝良縣蕎山鎮(zhèn)天麻種植區(qū)土樣優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為Acidobacteria、Actinobacteriota、Bacteroidota、Chloroflexi、Firmicutes、Gemmatimonadota、Latescibacterota、 Myxococcota、 Nitrospirota、 Patescibacteria、Planctomycetota、Proteobacteria 和Verrucomicrobiota。

3 組樣本群落結(jié)構(gòu)比較表明：1）Acidobacteria 為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，其次是Proteobacteria 和Chloroflexi；2）Firmicutes、Bacteroidota 細(xì) 菌 在 原 壤中豐度最高，而在一麻壤和方竹壤中幾乎沒有；3）組內(nèi)各樣本細(xì)菌群落組成較相似，但不同樣本中各細(xì)菌豐度不同。

各組間細(xì)菌數(shù)比較：3 組樣本共有細(xì)菌ASV為95 個(gè)，基于charlle001、charlle002 和charlle006特有細(xì)菌ASV 分析表明：原壤charlle001 特有細(xì)菌數(shù)量最多，其次為方竹壤charlle006，二者均高于一麻壤charlle002 特有細(xì)菌數(shù)量。原壤與一麻壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌比較分析顯示：優(yōu)勢(shì)細(xì)菌Acidobacteria、Planctomycetota 和Proteobacteria 在 原 壤 中豐度明顯低于一麻壤中，且原壤中Bacteroidota、Firmicutes 兩門細(xì)菌豐度顯著高于一麻壤；一麻壤與方竹壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌比較分析顯示：Chloroflexi 和Planctomycetota 在一麻壤中豐度明顯高于方竹壤，但方竹壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌Acidobacteria 豐度最大且Bacteroidota 細(xì)菌豐度高于一麻壤；原壤與方竹壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌比較分析顯示：方竹壤中Acidobacteria、Proteobacteria 豐度顯著高于原壤。云南省內(nèi)關(guān)于森林及農(nóng)田土壤細(xì)菌多樣性的測(cè)序研究表明，正常土壤中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門主要為Proteobacteria、 Actinobacteria、 Acidobacteria、 Firmicutes 和Gemmatimonadetes[27-28]，土壤細(xì)菌群落的多樣性和豐度越高，越有利于植株生長，土壤微生物的相對(duì)豐度發(fā)生改變，其功能也發(fā)生相應(yīng)變化[29]，基于上述分析推斷Firmicutes、Bacteroidota 細(xì)菌是天麻種植土壤中重要有益菌；猜測(cè)天麻連作障礙原因與其土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度變化有緊密的關(guān)聯(lián)，而連作菌塘種植方竹能緩解并一定程度修復(fù)天麻連作土壤。

連作障礙是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中普遍存在的問題，連作導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)和病蟲害等問題的發(fā)生，故稱“障礙”，對(duì)很多農(nóng)作物[30-36]造成不可估量的經(jīng)濟(jì)損失。由于大部分藥用植物特別是栽培根類藥材的連作障礙問題較突出，藥材品質(zhì)和產(chǎn)量均大幅下降[16,37-47]。天麻是我國特有的名貴中藥材，也是近年發(fā)展迅速的中藥大品種之一，因其對(duì)氣候、土壤、真菌等環(huán)境有特殊要求，因此傳統(tǒng)上云南省以昭通市境內(nèi)為主要種植地。近年來，中藥材已規(guī)范化種植，栽培土壤環(huán)境惡化及連作障礙問題備受關(guān)注，隨著社會(huì)需求量不斷增加，天麻栽培面積擴(kuò)大，天麻價(jià)格不斷上漲，連作障礙己成為限制天麻生產(chǎn)的重要因素。天麻產(chǎn)業(yè)發(fā)展與產(chǎn)品質(zhì)量提升和連作障礙的矛盾，已成為制約現(xiàn)代云藥產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展的主要屏障。因此，明確天麻土壤微生物群落結(jié)構(gòu)是揭開連作障礙的第一層面紗。

引起藥用植物連作障礙因素較多，其中植物根際土壤以及根際微生物是重要的環(huán)境和生物因子[48-49]。鄧文祥等[50]通過對(duì)白及（Bletilla striata）根部?jī)?nèi)生真菌的篩選，揭示土壤理化性質(zhì)影響白及根部?jī)?nèi)生真菌物種組成。土壤微生物研究對(duì)探討植物生長有重大意義，土壤微生物結(jié)構(gòu)的多樣性，加強(qiáng)了土壤自肥作用[51]，但連作常引起植物根際微生物變化，引起土壤病原菌增多肥力下降等問題，使作物產(chǎn)量和品質(zhì)下降[52]，如隨著靈芝栽培年數(shù)增加，靈芝種植土壤中優(yōu)勢(shì)菌多樣性降低，病原菌增多[53]。大部分研究表明細(xì)菌與土壤肥力相關(guān)，馮金玲等[54]試驗(yàn)5 種栽培模式說明土壤細(xì)菌可作為判斷土壤肥力狀況的生物學(xué)指標(biāo)。研究土壤微生物群落結(jié)構(gòu)均表明：土壤中真菌數(shù)量、真菌與細(xì)菌數(shù)量比值越低，土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定程度越高，抑制病害能力越強(qiáng)，在連作障礙土壤微生物研究中常見細(xì)菌型土壤轉(zhuǎn)變?yōu)檎婢屯寥繹55-58]。

作物連作后根際土壤微生態(tài)發(fā)生改變，主要表現(xiàn)在有益菌數(shù)目減少、病原菌數(shù)目增多，基于研究連作土壤微生物菌群演替規(guī)律，明確引入特殊土壤功能菌和有益微生物，可抑制病原菌增殖，同時(shí)恢復(fù)穩(wěn)定的微生物群落并防控連作障礙[58]。基于Illumina Hi Seq 高通量測(cè)序技術(shù)，探討植物與微生物的互作關(guān)系，研究連作土壤中細(xì)菌群落或真菌群落多樣性及豐度，提高有益菌群在土壤中的比例，降低有害菌群在土壤中的相對(duì)含量，研究結(jié)果推動(dòng)了人類對(duì)連作障礙的認(rèn)知[59]。本研究通過高通量測(cè)序技術(shù)揭示3 種類型天麻土壤細(xì)菌在種群組成、數(shù)量和分布上存在差異性，并明晰了連作前后及修復(fù)后細(xì)菌物種數(shù)量及組成的變化，與前人對(duì)連作白術(shù)（Atractylodes macrocephala）根際土壤變化[44]和連作土壤微生物區(qū)系分析、調(diào)控及高通量研究分析結(jié)果相似[60]，但大部分細(xì)菌的分類僅限于屬的水平，測(cè)序分析無法定位到特定細(xì)菌物種，且同一屬的不同細(xì)菌種在土壤中可能會(huì)行使不同的功能，不同屬的細(xì)菌也可能在土壤中行使同樣的功能，研究所得到的結(jié)果可能會(huì)有偏差。

天麻連作障礙一直被視為該領(lǐng)域的卡脖子問題，其連作機(jī)制與修復(fù)方案未曾問世，只因其基礎(chǔ)研究一直擱淺，因此研究天麻土壤中微生物結(jié)構(gòu)組成及豐度變化，便于接下來對(duì)天麻種植土壤更深層次的研究和探索。