基于ITS 和形態(tài)學(xué)系統(tǒng)分析新疆樺木屬種間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

楊梅花 苗江林 厚富霞 王蕾蕾 程錦濤

（石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 石河子 832000）

樺木屬（Betula）是樺木科（Betulaceae）中分布在新疆的唯一屬，我國(guó)有31 種及若干變種。新疆是我國(guó)西北地區(qū)樺木屬植被地理分化中心[1]，《新疆植物志》[2]中記載有8 個(gè)種，其中鹽樺（Betula halophila）被列為瀕危物種[3]。樺木屬植物是組成溫帶和暖溫帶森林群落的優(yōu)勢(shì)樹(shù)種[1]，具有重要的生態(tài)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

核基因內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）是植物基因中進(jìn)化較快的DNA 片段。ITS 序列能提供豐富的信息位點(diǎn)。隨著分子技術(shù)快速發(fā)展，ITS 序列成為重要分子標(biāo)記，被應(yīng)用于屬及種間分類和系統(tǒng)發(fā)育研究[4-6]。國(guó)內(nèi)對(duì)于樺木屬植物分類和系統(tǒng)發(fā)育研究，區(qū)域性明顯。陳之端[7]從古植物學(xué)和地理分布等角度對(duì)樺木科植物的起源和演化進(jìn)行研究；黃金祥等[8]對(duì)河北境內(nèi)樺木屬植物進(jìn)行了形態(tài)分類與地理分布的研究；劉果厚[9]和侯安燕[10]從植物形態(tài)部位對(duì)內(nèi)蒙古和北京地區(qū)的樺木屬植物分類進(jìn)行研究；姜靜等[11]利用RAPD 標(biāo)記技術(shù)對(duì)東北地區(qū)樺樹(shù)種間親緣關(guān)系進(jìn)行分析；梅新娣等[12]應(yīng)用ITS 序列對(duì)鹽樺進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育方面的研究。

目前，從系統(tǒng)分類學(xué)對(duì)新疆樺木屬資源進(jìn)行研究報(bào)道很少。本研究選取新疆樺木屬中天山樺（Betula tianschanica）、小葉樺（Betula microphylla）、白 樺（Betula platyphylla）、垂 枝 樺（Betula pendula）、甸生樺（Betula humilis）與鹽樺6 種代表植物，以巖樺（Betula calcicola）、高山樺（Betula delavayi）、矮樺（Betula potaninii）和賽黑樺（Betula schmidtii）作為外類群，從分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)角度綜合評(píng)價(jià)新疆樺木屬植物的系統(tǒng)分類關(guān)系，以期為樺木屬植物的系統(tǒng)發(fā)育研究提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究選擇新疆樺木屬6 個(gè)種，其他樺木屬10 個(gè)種，涵蓋《中國(guó)植物志》[13]記載的中國(guó)境內(nèi)樺木屬2 組及5 亞組植物。16 種樺木屬植物ITS序列來(lái)自美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)，種名、組/亞組及ITS 序列信息見(jiàn)表1。

表1 樺木屬16 種植物ITS 序列信息Table 1 ITS sequences of genus from 16 Betula

1.2 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

運(yùn)用Clustal Omega 軟件對(duì)樺木屬16 種植物ITS 序列進(jìn)行對(duì)比分析，空位被處理為缺失。然后使用MEGA 7.0 軟件進(jìn)行自展分析重復(fù)1 000 次，評(píng)估簡(jiǎn)約樹(shù)中各分支的自展支持率，計(jì)算亞組及種間遺傳距離，構(gòu)建最大似然法（ML）系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[14]。

1.3 形態(tài)性狀的選取及編碼

參考《中國(guó)植物志》及《新疆植物志》等書籍資料中有關(guān)樺木屬植物形態(tài)性狀的記載，選取種間差異大的形態(tài)性狀，經(jīng)過(guò)SPSS 25.0 軟件KMO 檢驗(yàn)和Bartlett 球度檢驗(yàn)[15]，最終選取7 個(gè)表型性狀作為指標(biāo)進(jìn)行聚類分析（表2）。為準(zhǔn)確反映出各性狀之間的差異程度，采用邏輯順序賦值量化，確定形態(tài)學(xué)性狀的分析數(shù)據(jù)。在此基礎(chǔ)上，運(yùn)用SPSS 對(duì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分及系統(tǒng)聚類分析[16]，采用沃德聯(lián)接法構(gòu)建形態(tài)聚類譜系圖。

表2 性狀及編碼Table 2 Traits and coding

2 結(jié)果與分析

2.1 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析

研究結(jié)果顯示，樺木屬16 種植物的ITS 序列長(zhǎng)度范圍為604～612 bp，當(dāng)空位作為缺失處理時(shí)，排序后的長(zhǎng)度為612 bp。序列位點(diǎn)比對(duì)顯示共有46 個(gè)變異位點(diǎn)，占序列總長(zhǎng)的7.52%，其中26 個(gè)為簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。由表3 可知，樺木亞組（Subsect. Betula）與柴樺亞組（Subsect. Fruticosae）、黑樺亞組（Subsect. Dahuricae）之間遺傳距離較小，均為0.004 7。碩樺亞組（Subsect. Costatae）內(nèi)絕對(duì)遺傳距離較小，為0.003 3。新疆樺木屬所在的樺木亞組和柴樺亞組遺傳距離較近為0.004 7，樺木亞組內(nèi)部絕對(duì)遺傳距離為0.006 0。

表3 樺木屬內(nèi)各亞組間與各亞組內(nèi)遺傳距離Table 3 Genetic distance between and within each subgroup of Betula

由圖1 可知，16 種樺木屬植物被分為四大支。首先外類群堅(jiān)樺亞組的巖樺、矮樺、高山樺和賽黑樺聚為F 分支，西樺組的長(zhǎng)穗樺（Betula cylindrostachya）、亮葉樺（Betula luminifera）和西樺（Betula alnoides）與碩樺亞組的糙皮樺（Betula utilis）和紅樺（Betula albosinensis）各自聚為E 和D 分支。在樺木屬M(fèi)L 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，西樺組E 分支支持率達(dá)到78%，組內(nèi)種間序列的自相似度高。新疆樺木屬所在的樺木亞組C 分支和柴樺亞組B 分支交錯(cuò)分布，同時(shí)該大支中包含有黑樺亞組的黑樺（Betula dahurica）。在樺木亞組分支中，小葉樺與鹽樺距離較遠(yuǎn)，與天山樺距離相對(duì)較近。

由圖2 可知，新疆樺木屬6 種植物中，天山樺與小葉樺、白樺與垂枝樺各自聚集在一小支，遺傳距離分別為0.005 0 和0.001 7。甸生樺與鹽樺單獨(dú)聚為一支，遺傳距離為0.003 3。

圖1 基于ITS 序列分析構(gòu)建16 種樺木屬植物系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 1 Phylogenetic trees of 16 Betula based on ITS sequence analysis

圖2 基于ITS 序列分析構(gòu)建新疆樺木屬植物系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 2 Phylogenetic tree of Betula in Xinjiang based on ITS sequence analysis

2.2 主成分分析及聚類分析

2.2.1 主成分分析

運(yùn)用SPSS 軟件對(duì)樺木屬16 種植物的7 個(gè)形態(tài)性狀編碼進(jìn)行特征值和方差百分率計(jì)算，以特征值大于1 為準(zhǔn)則提取主成分。由表4 可知，前3 個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)84.5%，第1、2、3 主成分構(gòu)成比例分別為48.7%、20.5%和15.3%。第1 主成分的特征值為3.407，特征向量中載荷最高且符號(hào)為正的性狀有生活型和樹(shù)皮剝裂及紋路，其特征向量為0.816 和0.889。第2 主成分特征值為1.437，從載荷值的大小看，第2 主成分反映葉片形狀。第3 主成分特征值為1.071，載荷值最高且符號(hào)為正的性狀主要是果苞背部被毛，特征向量為0.837。從3 個(gè)主成分的特征向量和貢獻(xiàn)率分析，生活型、樹(shù)皮剝裂及紋路是樺木屬分類較為重要的性狀。

表4 樺木屬植物主要性狀主成分分析Table 4 Principal component analysis of main characters of Betula

2.2.2 聚類分析

如圖3 所示，16 種樺木屬植物的形態(tài)性狀聚類所呈現(xiàn)結(jié)果與經(jīng)典形態(tài)分類學(xué)擬合度較高。歐氏距離為5 時(shí)，長(zhǎng)穗樺、亮葉樺和西樺聚為一類，均屬西樺組。歐氏距離為4.5 時(shí)，外類群堅(jiān)樺亞組4 個(gè)種聚為一支。歐氏距離為3 時(shí)，新疆樺木屬6 種植物中，樺木亞組的鹽樺和柴樺亞組的甸生樺聚為混合類群，而天山樺、小葉樺、垂枝樺和白樺另聚為一個(gè)類群。相類似的黑樺亞組的黑樺和碩樺亞組的糙皮樺與紅樺聚為一個(gè)混合類群。可見(jiàn)，本研究中主成分分析貢獻(xiàn)率較高的性狀能反映形態(tài)分類的主要特點(diǎn)，說(shuō)明主成分提取方法可行，結(jié)果可信。

圖3 16 種樺木屬植物形態(tài)性狀聚類圖Fig. 3 Cluster analysis of 16 Betula

由圖4 可知，歐氏距離為5 時(shí)，新疆樺木屬植物被聚為兩大支，分別為單支和混合支。歐氏距離為3 時(shí)，柴樺亞組的甸生樺與樺木亞組的鹽樺聚為一個(gè)混合支，處在樹(shù)狀圖的基部位置。另一大支中，樺木亞組的天山樺和小葉樺與垂枝樺和白樺各聚為一單支。總體而言，新疆樺木屬的形態(tài)性狀聚類結(jié)果與經(jīng)典形態(tài)分類學(xué)中的《新疆植物志》分類結(jié)果擬合性較高。

圖4 新疆樺木屬植物形態(tài)性狀聚類圖Fig. 4 Cluster analysis of Betula in Xinjiang

3 結(jié)論與討論

3.1 新疆樺木屬進(jìn)化關(guān)系

在分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和形態(tài)學(xué)聚類結(jié)果中，新疆樺木屬中天山樺和小葉樺均聚集在一起。地理分布上，小葉樺主要分布在阿爾泰山一帶，而天山樺則主要分布在天山山脈[17]，但兩物種的分布海拔范圍重疊程度較高。結(jié)合生長(zhǎng)環(huán)境來(lái)看，小葉樺和天山樺都同屬于山地森林樹(shù)種，且從外部形態(tài)上均為高大喬木，有著很多共同的特征，如小堅(jiān)果卵形、樹(shù)皮灰色，葉菱形等。ITS 分子水平兩者的遺傳距離為0.005 0，同質(zhì)性比較高。這一研究結(jié)果顯示，小葉樺與天山樺在形態(tài)學(xué)與分子學(xué)分類中具有相似性。對(duì)于該類樺木屬植物，ITS 分子鑒定能夠快速準(zhǔn)確的進(jìn)行物種鑒別，這與宮霞等[18]對(duì)葡萄科各屬的結(jié)論和蔡洪月等[19]對(duì)杜鵑屬的研究結(jié)果相一致。

白樺和垂枝樺在2 個(gè)ITS 序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中均聚為一支，支持率大于60%，并且在樺木屬系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中處于較原始的位置，這與姜景民[1]和楊萬(wàn)波等[20]研究樺木屬的進(jìn)化關(guān)系結(jié)果類似。白樺與垂枝樺在形態(tài)學(xué)聚類中也聚為一支，與《中國(guó)植物志》記載的樺木屬分類結(jié)果相似，驗(yàn)證了兩者在ITS 序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中位置的結(jié)論。

《中國(guó)植物志》分類中甸生樺歸屬于柴樺亞組，鹽樺歸屬于樺木亞組，而《新疆植物志》中兩者被劃分在柴樺亞組。本研究中甸生樺和鹽樺在形態(tài)性狀聚類和ITS 序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上均聚為一支，說(shuō)明其形態(tài)性狀具有一定的共源性，且ITS 序列同源性較高、遺傳距離較近。本研究結(jié)果支持鹽樺與甸生樺分在同一亞組。此外，鹽樺與甸生樺都分布在新疆溫帶草原區(qū)，鹽樺生活型從小喬木演化為與甸生樺相類似的灌木，反映了相似自然生境對(duì)植物的生活型有一定影響[1]。同時(shí)，王亞玲等[21]在研究木蘭科植物時(shí)也有相類似的結(jié)果。

3.2 分類群進(jìn)化及親緣關(guān)系

通過(guò)主成分分析可以選擇出有效的評(píng)價(jià)參數(shù)和指標(biāo)，對(duì)樺木屬形態(tài)性狀的主成分分析中，生殖器官果苞的形態(tài)特征構(gòu)成第3 主成分，營(yíng)養(yǎng)器官枝葉性狀特征構(gòu)成第2 主成分，這與從古植物學(xué)角度分析樺木屬植物系統(tǒng)發(fā)育的研究結(jié)果一致[10]。

堅(jiān)樺亞組、碩樺亞組和西樺組在ITS 序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中各自聚為一支，且支持率均大于50%。在分子水平上，西樺組與樺木組之間距離較大，絕對(duì)遺傳距離為0.020 5。樺木組內(nèi)的堅(jiān)樺亞組與碩樺亞組之間的遺傳距離為0.017 5，而各自亞組內(nèi)部絕對(duì)遺傳距離為0.011 3 和0.003 3，證實(shí)堅(jiān)樺亞組與碩樺亞組的親緣關(guān)系較西樺組的親緣關(guān)系近。樺木屬內(nèi)各組、亞組和種間都表現(xiàn)出高的遺傳相似性，說(shuō)明ITS 分子標(biāo)記鑒定技術(shù)的高效性和復(fù)雜性[4-5]。演化起源上，西樺組分布于我國(guó)西南地區(qū)樺木屬原始起源中心[1]，保留的原始性狀比較多，因而與樺木組的堅(jiān)樺亞組和碩樺亞組遺傳特性明顯，同時(shí)也驗(yàn)證了兩者之間遺傳距離較遠(yuǎn)。

樺木亞組、柴樺亞組和黑樺亞組聚為一個(gè)混合支，存在不同程度的跨組聚類，與饒龍兵等[22]研究榿木屬中出現(xiàn)的情況一致。這可能是因?yàn)楹跇鍋喗M和柴樺亞組與樺木亞組的遺傳距離均比較小，為0.004 7，表明3 個(gè)亞組之間的親緣關(guān)系比較近。研究結(jié)果與姜靜等[11]發(fā)現(xiàn)黑樺亞組和樺木亞組親緣關(guān)系較近的結(jié)論一致，但與本研究中形態(tài)學(xué)聚類結(jié)果差異較大。黑樺、糙皮樺和紅樺在形態(tài)學(xué)聚類時(shí)聚為一個(gè)混合類群，但是它們?cè)诮?jīng)典形態(tài)分類學(xué)中屬于不同亞組種。新疆樺木屬植物的研究結(jié)果中也出現(xiàn)了類似情況，如甸生樺和鹽樺跨亞組聚為一類。推測(cè)原因是經(jīng)典形態(tài)分類學(xué)主要以形態(tài)性狀為依據(jù)，而植物表型性狀受自然環(huán)境和人為因素的影響，有時(shí)難以闡明種質(zhì)資源表型性狀的差異。特別是樺木屬植物為屬內(nèi)多倍體木本植物，不同種之間倍性差異大[5,23]，長(zhǎng)時(shí)間的自然選擇和適應(yīng)環(huán)境，使得分子遺傳和形態(tài)性狀上不能很好地吻合，導(dǎo)致屬內(nèi)植物的分類系統(tǒng)十分復(fù)雜[24]。ITS 序列在樺木屬各亞組間和亞組內(nèi)遺傳距離存在一定間隔，可將各種類進(jìn)行區(qū)分，是樺木屬植物較為理想的DNA 條形碼候選序列。本研究對(duì)新疆樺木屬植物的分類及其親緣關(guān)系，從分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和形態(tài)學(xué)聚類進(jìn)行嘗試，今后研究還需結(jié)合更多的樣本及分子手段進(jìn)行綜合分析。