滇重樓優良野生種源評價與篩選

徐永艷 李 昆 焦 蓉 汪 瓊 王占娣 石冰杰 徐 榮

（1. 西南林業大學，云南 昆明 650233；2. 中國林科院資源昆蟲所 云南 昆明 650224；3. 玉溪師范學院，云南 玉溪 653100）

滇重樓（Paris polyphyllavar.yunnanensis）為延齡草科（Trilliaceae）重樓屬多年生草本植物，是我國西南地區重要的林下中藥資源。其根莖具有止血散瘀、清熱解毒、抗腫瘤、免疫調節等功效[1-2]。是云南省傳統道地藥材，歷來為我國眾多著名中成藥如云南白藥等的主要原料[3]。滇重樓在云南分布廣，且地理種源較多[4]，具有豐富的遺傳多樣性。但是近年來，滇重樓野生資源持續掠奪式采挖，加之滇重樓根莖生長周期漫長、生長速度緩慢，生產上亟待篩選出優良種源加以保護利用。皂苷是重樓藥材主要有效藥用成份[5-6]，重樓皂苷含量及藥材質地受栽培環境、土壤、氣候等因素影響[7-8]，不同地理種源的滇重樓品質不同，皂苷含量差別較大，這也是滇重樓作為云南傳統道地藥材最為重要的特點之一。目前對滇重樓報道研究主要集中在化學成分提取分離、藥理活性、栽培技術、分子生物學、內生菌等方面，鮮有資源質量評價的研究，系統對云南主分布區滇重樓野生種質資源收集與評價未見報道。丹參（Salvia miltiorrhiza）、黃芪（Astragalus membranaceus）、人 參（Panax ginseng）、山 茱 萸（Cornus officinalis）等莖類藥用植物篩選種源時，通常以生長指標和藥用成分含量作為篩選標準，因此本研究以根莖生長速度、皂苷成分含量作為優質種源篩選標準較為科學。

本研究選用了目前市面上認可度較高的普洱景東、玉溪澄江、文山丘北、楚雄大姚、曲靖馬龍、昭通鎮雄、大理劍川、麗江永勝8 個地理種源，通過測定其皂苷含量及生長速度，篩選出皂苷含量較高、生長較快、來源豐富的滇重樓種源，對于滇重樓野生種質資源保護和產業發展意義重大，研究結果可為滇重樓中藥材栽培和產業發展提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料的收集與處理

滇重樓種源種質的收集，選擇曲靖馬龍、玉溪澄江、昭通鎮雄、楚雄大姚、大理劍川、麗江永勝、普洱景東、文山丘北共8 個云南省主要地理分布區的地理種源收集[9]。分別采集50 株7 年生野生滇重樓（經西南林業大學曾覺民教授鑒定為滇重樓），實地采樣記錄樣地海拔、經緯度及植被狀況等（表1）。

表1 滇重樓不同地理種源地信息表Table 1 Information of different geographical provenances

1.2 試劑

對照品重樓皂苷Ⅰ（YJ-111591）、皂苷Ⅱ（YJ-111592）、皂苷Ⅵ（YJ-111593）和皂苷Ⅶ（YJ-111594）均從中國藥品生物制品檢定所購買，供含量測定用。乙醇、甲醇為分析純，乙腈為色譜純。

1.3 樣品檢測與分析

1.3.1 滇重樓樣品中重樓皂苷的提取

采用加熱回流法提取重樓皂苷。每個地理種源隨機抽取20 株根莖部干燥粉碎，40 目的細篩過篩，稱取0.5 g 置于100 mL 的圓底小燒瓶。加入25 mL 乙醇后稱量（W），80 ℃加熱回流30 min；冷卻后再次稱量，乙醇補足至原來的W；混勻后移取1 mL 至離心管，2 800 r/min 轉離心15 min。

1.3.2 高效液相法測定重樓皂苷含量

色譜柱DIKMA 公司LeapsilC18，（100×4.6 mm，2.7 μm），乙腈-水流動相，203 nm 檢測波長，30 ℃柱溫，1 mL/min 流速，10 μL 進樣量。稱取對照品適量，加甲醇制成每1 mL 分別含重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ為0.372 08、0.377 34、0.355 64、0.380 00 mg 的混合溶液即得，0.45 μm 的微孔濾膜過濾對照品及樣品溶液備用。

1）線性關系分析。由低濃度到高濃度精密吸取重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ和重樓皂苷Ⅶ的標準品溶液10 μL 依次注入色譜儀。分別以進樣量、峰面積為橫坐標（X）、縱坐標（Y），繪制出標準曲線，計算線性回歸方程、相關系數以及相應的線性范圍。各標準品在表2范圍內與其峰面積呈良好的線性關系。

表2 滇重樓標樣的線性關系考察表Table 2 Calibration data of saponins reference substances

2）精密度試驗。精密吸取對照品溶液（0.539 mg/mL）適量，按上述色譜條件重復進樣6 次，記錄峰面積。RSD 的結果為0.39%，說明所采用儀器的精密度良好。

3）穩定性試驗。吸取適量的同一供試品溶液，于放置0、4、8、12、16、24 h 時分別按上述色譜條件進樣測定。RSD 的結果表明供試品的溶液在24 h 內穩定性良好。

4）重復性試驗。取同一產地樣品適量制備供試品溶液，分別在上述色譜條件下測定重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ的含量。RSD 的結果表明：該方法重復性良好。

實驗設置3 次重復。

1.3.3 不同地理種源滇重樓的年生長量測定

滇重樓樣本栽培于西南林業大學樹木園苗圃（25°3′N，102°45′E），70%遮 陰 網 下 統 一 管理。滇重樓地上莖倒苗后，每個種源隨機挖取30 株地下根莖稱量鮮重后種回，1 a 后再次挖取稱量，2 次稱量的差值測算每株根莖年增長量和年增長率。

1.4 數據分析

利用EXCEL 進行原始數據整理和統計，SPSS 26.0 進行方差分析、多重比較、相關性和聚類分析。

2 結果與分析

2.1 滇重樓根莖皂苷含量的種源差異

由表3 可知不同種源滇重樓根莖皂苷含量具有很大差異，皂苷Ⅰ、皂苷Ⅱ、皂苷Ⅵ、皂苷Ⅶ和總皂苷（Ⅰ + Ⅱ + Ⅵ + Ⅶ）含量中，總皂苷含量變異幅度為2.145～15.749 mg/g。其中普洱景東種源含量最高，麗江永勝種源含量最低，前者是后者的7.342 倍，除大理劍川和麗江永勝外6 個種源樣品皂苷含量均達到0.6%的藥典標準，屬于優良種源。不同種源皂苷Ⅰ含量變異范圍為0.534～10.639 mg/g，皂苷Ⅱ含量變異范圍為1.248～6.793 mg/g，皂苷Ⅵ含量變異范圍為0.000～1.208 mg/g，皂苷Ⅶ含量變異范圍為0.000～0.546 mg/g。僅普洱景東、大理劍川種源檢測出皂苷Ⅵ，大理劍川、文山丘北種源未檢測出皂苷Ⅶ。方差分析表明，不同種源滇重樓根莖皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ和總皂苷（Ⅰ + Ⅱ + Ⅵ + Ⅶ）的含量存在極顯著差異（P＜ 0.01），8 個地理種源重樓皂苷含量：普洱景東＞玉溪澄江＞文山丘北＞楚雄大姚＞曲靖馬龍、昭通鎮雄＞大理劍川＞麗江永勝。8 個地理種源滇重樓皂苷成分以薯蕷類的重樓皂苷Ⅰ和重樓皂苷Ⅱ為主，偏諾類的重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ為輔。

表3 不同種源滇重樓皂苷含量差異Table 3 The difference of saponins contents of P. polyphylla var. yunnanensis from 8 provenances mg/g

2.2 滇重樓根莖皂苷含量與氣候生態因子的相關分析

由表4 可知，滇重樓根莖皂苷含量與氣候生態因子間相關性的顯著性檢驗表明，滇重樓根莖皂苷I 含量與經度及年平均溫度、 總皂苷含量與經度及緯度間相關性顯著（P＜0.05），相關系數值分別為0.797、0.826、0.787 和-0.725。說明皂苷I 含量與經度、總皂苷含量與經度、皂苷I 與年平均溫度間存在非常緊密正相關關系，總皂苷含量與緯度間存在非常緊密負相關關系。總皂苷含量與海拔間相關系數為-0.371，未達到顯著水平，存在緊密的負相關性，而總皂苷含量與年均氣溫和年均降水量間相關系數分別為0.668 和0.672，存在緊密的正相關性。

表4 滇重樓皂苷含量與種源地氣候生態因子相關分析Table 4 Correlation analysis of saponins contents and ecological factors of P. polyphylla var. yunnanensis

2.3 不同種源滇重樓根莖生長分析與比較

由表5 可知，不同種源滇重樓根莖生物年生長量及年生長速率具有很大差異，大理劍川種源滇重樓根莖生長速度最快，年生物量為35.3 g，年生長速率為21.41%，遠高于其他地理種源，麗江永勝、普洱景東、玉溪澄江種源次之，根莖生物量年生長速率分別為18.70%、17.76%、17.26%；文山丘北、楚雄大姚、曲靖馬龍、昭通鎮雄4 個地理種源的年生長速率較低，生長速度較慢。多重比較表明，曲靖馬龍和文山丘北兩地的皂苷根莖生物量年生長速率差異不顯著，其他種源根莖生物量之間差異均呈顯著差異（P＜0.05）。8 個地理種源的滇重樓根莖生物量年生長速率：大理劍川＞麗江永勝＞普洱景東＞玉溪澄江＞楚雄大姚＞文山丘北、曲靖馬龍＞昭通鎮雄。

表5 滇重樓不同種源根莖年生長Table 5 Annual growth of rhizomes of different provenances

2.4 不同種源滇重樓聚類分析與優良種源篩選

以滇重樓根莖皂苷含量和根莖年生長速率為特征指標，對8 個滇重樓種源聚類分析。從圖1可以看出，以歐氏距離17 為分界閾值，可將滇重樓種源聚類為3 個類群，分別為低皂苷含量、高生長速率類群，高皂苷含量、高生長速率類群和中皂苷含量、低生長速率類群。其中大理劍川和麗江永勝種源屬低皂苷含量、高生長速率類群，普洱景東和玉溪澄江屬高皂苷含量、高生長率類群，昭通鎮雄、曲靖馬龍、楚雄大姚和文山丘北屬中皂苷含量、低生長速率類群。

圖1 不同種源滇重樓總皂苷含量、年生長率聚類分析Fig. 1 Cluster analysis of total saponin contents and annual growth rate in different provenances

通過不同地理種源滇重樓總皂苷含量及根莖年生長速率2 個指標綜合比較，普洱景東種源最優，玉溪澄江次之，普洱景東種源和玉溪澄江種源的滇重樓為優質種源。大理劍川、麗江永勝種源的皂苷含量未達到藥典要求，但其光合面積大，芽多，根莖年生長量較大，也可以適當引種栽培。

3 結論與討論

滇重樓皂苷含量與光照強度、日照時數、病蟲害、土壤養分、微生物等因素密切相關[10-11]，李澤東等[12]發現日照、溫度、營養等影響三七（Panax notoginseng）生長和皂苷類成分的合成。滇重樓為陰生植物，喜斜射光或散光，適宜的遮蔭率對重樓生長和產量有重要作用[13-14]。普洱景東地區年均溫度18.3℃、年均降雨量1 087 mm，均高于其他種源地，研究發現人參皂苷含量與與日照時數和年降水量呈明顯的正相關[15]，故推測其皂苷含量高與日照時數和年降水量高有很大關系。本研究結果顯示氣溫較低地區，滇重樓根莖生長速度并非最慢，推測該地區晝夜溫差大，導致根莖生長量積累較多。不同地理種源生物量差異比較大[16]，大理劍川、麗江永勝種源生長快，該兩地種源具有矮桿多芽多葉的特點，其光合面積較大故根莖年生長量較大；普洱景東、玉溪澄江種源生長也較快，跟生長期長、芽壯、莖粗而高大等特性有關。降雨量、日照時數、晝夜溫差、土壤等因素都會影響其根莖生長速度，本研究皂苷含量與生態因子相關性分析表明總皂苷含量與海拔有一定的負相關性，而總皂苷含量與年均氣溫和年均降雨量間相關系數存在一定的正相關性，與人參、枸杞（Lycium chinense）、龍葵（Solanum nigrum）等有效成分累積的研究結果一致[17-19]。優良的氣候條件是道地藥材的形成基礎，重樓品質與氣溫、濕度、土壤pH 值及土壤微生物等有關[20-23]。普洱景東位于云南省中南部，橫斷山脈南端，屬亞熱帶季風型氣候，海拔高、垂直變化明顯，年平均氣溫18.3 ℃，年平均相對濕度77%，年均降水量1086.7 mm，年均日照2 131.6 h，無霜期355 d，非常適合滇重樓生長及生物量積累[24]。昭通鎮雄、曲靖馬龍氣溫較低且為單芽滇重樓，故生長最慢。通過聚類分析可將滇重樓種源分為3 個類群，大理劍川和麗江永勝種源屬低皂苷含量、高生長速率類群，普洱景東和玉溪澄江屬高皂苷含量、高生長速率類群，昭通鎮雄、曲靖馬龍、楚雄大姚和文山丘北屬中皂苷含量、低生長速率類群。

目前，滇重樓栽培生產中存在種源混亂、良莠不齊、品質不佳等諸多問題。利用滇重樓在云南分布區域多樣性的特點篩選優質種源，是解決滇重樓產業發展中高品質原材料短缺問題的必要前提。本研究結果顯示，普洱景東種源總皂苷含量最高達1.57%，生長速度較快，根莖年生物量為30.1 g，增長率為17.76%，為優質地理種源；不同地理種源中的生長速度差異顯著，大理劍川種源生長速度最快，根莖年增長率達21.41%，可以在合適區域種植；綜合皂苷含量和根莖生長速度兩個指標，玉溪澄江種源也可作為優良滇重樓種源。通過篩選出普洱景東和玉溪澄江種源為優良種源，對于滇重樓野生種植資源保護及產業發展具有一定的科學意義。