高原土壤菌株的分離及抗菌活性初步評價

郭歡歡林文星胡運琪馬曉莉南澤東江志波吳秀麗

(1.北方民族大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院餐廚廢油轉(zhuǎn)化清潔能源與高附加值化學(xué)品創(chuàng)新團隊，寧夏 銀川 750021；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，寧夏 銀川 750004)

病原微生物(真菌、細菌和病毒等)引起的嚴重感染是造成臨床死亡的重要因素之一。2019年世界衛(wèi)生組織(WHO)公布的全球十大健康威脅就有埃博拉、登革熱和艾滋病毒等病原體感染[1]。2019-新型冠狀病毒(Novel coronavirus pneumonia，NCP，COVID-19)更因其嚴重的人傳人性質(zhì)，迅速引發(fā)肺炎、嚴重呼吸道綜合征、腎衰竭甚至死亡等特征，成為傳播速度最快，發(fā)病到死亡時間最短的惡性傳染性病原體。2020年1月17日WHO的一份報告指出，在研的藥物中針對革蘭氏陰性菌的很少。因此加快抗革蘭氏陰性菌藥物的研發(fā)刻不容緩[2-4]。

微生物在長期進化過程中，通過與環(huán)境和各種生命體相互作用及斗爭中獲得大量的次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇(Biosynthetic gene clusters,BGCs)，并通過編碼低分子化合物、多肽和蛋白質(zhì)等形式保障生存、繁殖和進化。微生物次級代謝產(chǎn)物及其衍生物因其形式多樣，結(jié)構(gòu)復(fù)雜且具有良好的生物活性，一直是臨床藥物的重要來源，在保障人類生命健康方面作出了重要的貢獻。20世紀40—70年代為抗生素發(fā)展的黃金時期，一大批抗生素的臨床使用，有效遏制了感染性疾病的發(fā)生和傳播。但隨著抗生素的廣泛使用和局部地區(qū)的濫用，越來越多的病原菌對已有抗生素產(chǎn)生了耐藥性。而更不利的是，自20世紀80年代以來，其研發(fā)進度嚴重減緩，目前也只有一些中小企業(yè)在堅持。2017年WHO報告全球12株致命超級細菌亟需開發(fā)新型抗生素，也給全世界藥企和相關(guān)科研單位敲響了警鐘。

抗生素發(fā)展速度減慢因素有很多，其中最主要的就是人們對陸地和淡水生境的實驗室可培養(yǎng)的微生物次級代謝產(chǎn)物進行大量研究，已經(jīng)很難從中獲得具有新結(jié)構(gòu)的活性化合物來作為新抗生素開發(fā)的先導(dǎo)化合物。而基因組挖掘技術(shù)(通過分子生物學(xué)激活潛在的隱性生物合成基因簇)獲得新結(jié)構(gòu)化合物方法，不僅受到實驗方法的限制，還需要付出高昂的代價。特殊生境微生物(指生存在火山口、深海、高原鹽湖和鹽堿地等生態(tài)環(huán)境下的菌群)通常對熱、輻射、高壓或高鹽具有耐受性，次級代謝產(chǎn)物中通常含結(jié)構(gòu)新型、活性多樣的化合物，成為當(dāng)前研發(fā)新抗生素的重要方向。

本實驗對青海湖土壤樣品和一份大型真菌進行微生物分離，共得到49株菌株。借助于平板法檢測部分菌株的抗菌活性，發(fā)現(xiàn)1株放線菌和5株真菌發(fā)酵液對普通變形菌(Proteus vulgaris)具有明顯的生長抑制作用。本實驗為進一步探究其次級代謝產(chǎn)物的多樣性奠定基礎(chǔ)，為理解青藏高原生物多樣性和以此為基礎(chǔ)的微生物藥物研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器試劑

超凈工作臺(YT-CJ-1ND)，北京亞泰科隆儀器有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋(SQ810C)，雅馬拓科技貿(mào)易(上海)有限公司；搖床(ZHWY-211C)，上海智城分析儀器制造公司；真空冷凍干燥機(FD-1A-50)，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；甲醇、氯仿、丙醇、石油醚，酵母浸膏、馬鈴薯重鉻酸鉀培養(yǎng)基，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；乙醚、青霉素，天津市北聯(lián)精細化學(xué)品開發(fā)有限公司；正己烷、鏈霉素，天津市光復(fù)精細化工研究所；葡萄糖、放線菌培養(yǎng)基，多點化學(xué)；磷酸氫二鉀(AR)，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 高氏l號培養(yǎng)基

1.2.2 馬鈴薯培養(yǎng)基

馬鈴薯200g,加水1L，熬制泥狀，紗布過濾，定容至1L；上述溶液中依次加入葡萄糖20g，TRYPTONE 3g,瓊脂15g，MgSO41g，K2HPO40.5g，酵母浸膏1g；115℃滅菌15min。使用前，加入鏈霉素(120μg·mL-1)和青霉素(120g·mL-1)，用于真菌篩選。

1.2.3 馬丁培養(yǎng)基

葡萄糖1g,蛋白胨0.5g，KH2PO4·3H2O 0.1g，MgSO4·7H2O 0.05g，孟加拉紅溶液(0.1g·mL-1)0.33mL，瓊脂1.5～2g,蒸餾水100mL，pH6.4；115℃滅菌15min。使用前，加入2mL的2%去氧膽酸鈉溶液及0.33mL的鏈霉素溶液(10000μmol·mL-1)，迅速搖勻，作為篩選真菌的生長及保存培養(yǎng)基。

1.2.4 MH肉湯培養(yǎng)基

如果通信電纜溝中布設(shè)的人孔井?dāng)?shù)量較少，在實際作業(yè)期間，可以在原觀測點處，完成相應(yīng)的埋設(shè)，也可以通過現(xiàn)澆的方式，制作獨立水泥觀測墩，通過對其進行應(yīng)用，完成相應(yīng)的觀測工作[6]。

牛肉粉2.0g，可溶性淀粉1.5g，酸水解酪蛋白17.5g，瓊脂12～20g，蒸餾水1L，pH7.4；121℃滅菌20min。用于檢定菌株生長和抗菌活性評價。

1.2.5 Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基

酵母提取物5g，胰化蛋白胨10g，NaCl 10g，蒸餾水1L，NaOH調(diào)pH7.0，于121℃高壓滅菌20min。用于稀釋土壤樣品和植物樣品。

1.3 樣品來源

樣品于2019年07月28—31日在青海省青海湖邊和柴達木盆地采集。新鮮樣品用無菌器具采集，無菌袋密封，-20℃保藏。

1.4 實驗方法

菌株分離和樣品前處理、活性測試等方法見郭歡歡等[5]文章。

1.4.1 樣品采集與處理

采用5點采集法，取地面下40～60cm深度的土壤。將土壤樣品上下均勻混合后裝入無菌信封，標注采樣信息，所有樣品低溫保存。

1.4.1.1 土壤樣品處理

超凈臺中，取4份土壤樣品各10g，加入90mL無菌LB液體培養(yǎng)基，混合均勻。依次稀釋至0.01g·mL-1、0.001g·mL-1。

1.4.1.2 菌株生長

取2種濃度懸濁液200μL涂布在固體平板上。靜置0.5h后，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中，28℃進行培養(yǎng)。馬鈴薯培養(yǎng)基15～20d，高氏一號培養(yǎng)基5～7d，期間觀察菌落生長情況。

1.4.2 菌株分離

用無菌竹簽挑取單菌落，固體培養(yǎng)基“Z”劃線培養(yǎng)。放線菌使用高氏一號培養(yǎng)基；真菌使用馬丁培養(yǎng)基，重復(fù)3次，直至菌落在顯微鏡下觀察無異性菌。確定為單一菌落的菌株利用無菌竹簽接種至斜面培養(yǎng)基，正常生長至生長期，4℃冰箱保存；對于產(chǎn)孢放線菌使用20%甘油洗滌孢子，-70～-80℃低溫冰箱中保存；產(chǎn)孢真菌使用50%甘油洗滌孢子，保存于-70～-80℃低溫冰箱中。

1.4.3 菌株鑒定

1.4.3.1 光學(xué)顯微鏡鏡檢

超凈臺中，將滅菌的蓋玻片45°斜插入各個培養(yǎng)基中，每個培養(yǎng)基插入3～5片，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2d，根據(jù)菌株生長情況取蓋玻片進行顯微鏡觀察，保存菌絲體清晰的圖片，并記錄。

1.4.3.2 電子顯微鏡成像

將導(dǎo)電膠于超凈臺中紫外燈照射滅菌，用無菌牙簽挑取單菌落，將單菌落均勻涂抹在導(dǎo)電膠上。蔡司掃描電子顯微鏡(EVO MA 10/LS 10型)觀察視野中完整菌株，分別獲取×50、×200、×2000倍圖像。以圖片編輯工具給出菌株的直徑(或長、寬)，記錄菌株的形態(tài)。

1.4.4 活性評價方法

1.4.4.1 樣品制備

固體發(fā)酵瓊脂塊搗碎，乙酸乙酯超聲萃取3次，每次20mL。合并有機溶劑，減壓蒸餾回收有機溶劑。殘留物以2mL甲醇溶解，作為待測液。

液體搖瓶發(fā)酵液10mL，上樣至固相萃取色譜柱中，以10mL蒸餾水洗滌后，依次使用2mL的50%甲醇水溶液、95%甲醇水溶液洗滌，減壓干燥，樣品存放于玻璃瓶中，于4℃下保存。

1.4.4.2 活性測試方法

直徑6mm的加厚濾紙上滴加200μL樣品，自然風(fēng)干(2h)，并平鋪于檢定菌(金黃色葡萄球菌)的平板上。金黃色葡萄球菌檢定板于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24h。觀察樣品的抑菌情況。

2 結(jié)果

2.1 青海湖邊土壤樣品中菌株分離結(jié)果

利用特異性菌株篩選培養(yǎng)基從青海湖邊土壤樣品中獲得23株菌株，包括17株真菌，見圖1(QHH-1～17)，6株放線菌，見圖1(QHH-18～23)。真菌在馬鈴薯培養(yǎng)基生長狀態(tài)顯示菌落較大，形態(tài)各異。除QHH-6、QHH-7、QHH-11、QHH-16外，其它真菌皆有明顯的同心環(huán)。所有真菌均有絨狀氣生菌絲。

放線菌的菌落直徑約為真菌的1/10。QHH-18和QHH-19 2株放線菌無氣生菌絲，菌落光滑，有顏色較淺的色素分泌，其中QHH-18分泌色素為淡黃色。QHH-20菌體顯示為紅色，可能為放線紫紅素。QHH-18與QHH-23外觀非常相似，也同樣具有淡黃色的色素代謝物，比較明顯的差別在于QHH-23具有白色氣生菌絲。

2.2 柴達木盆地土壤樣品中菌株分離結(jié)果

柴達木盆地土壤樣品比較干燥，從中分離得到了24株菌株，包括16株真菌和8株放線，見圖1。從菌落形態(tài)來看，DLHX-1、DLHX-3、DLHX-4形態(tài)相似，都存在同心環(huán)，差別在于菌絲體顏色和代謝產(chǎn)物色素的顏色差別較大。DLHX-1中心圈顯色為白色，而DLHX-3和DLHX-4分別為黑色和紫色。DLHX-10和DLHX-13可能都是霉菌，差別在于DLHX-10菌絲為青色，DLHX-13為綠色。放線菌中DLHX-18、DLHX-19、DLHX-20無氣生菌絲，菌體表面光滑，有微微凸起。DLHX-20菌株可分泌亮黃色色素與其它菌株差別較明顯。DLHX-22菌株中心為綠色菌絲體，周邊有白色絨毛狀氣生菌絲，在所有放線菌中少見。DLHX-21～24具有氣生菌絲，可能為放線菌屬的鏈霉菌。具體菌株分離還將通過其它理化性質(zhì)和16S或18S rRNA測序鑒別。

2.3 青藏高原大型真菌樣品中菌株分離結(jié)果

大型真菌采集于西寧至青海湖途中日月鄉(xiāng)。從大型真菌外壁培養(yǎng)得到1株真菌(MGWC-1)，而將其組織破碎后，通過培養(yǎng)得到1株放線菌(MGWC-2)。真菌MGWC-1在培養(yǎng)時間10d之前為氣生菌絲，白色；10d以后中心部位出現(xiàn)綠色菌絲體。放線菌MGWC-2培養(yǎng)到第5天時出現(xiàn)氣生菌絲白色；第3天開始產(chǎn)生黃色素，且其擴散性強，提示可能為水溶性物質(zhì)。

注：QHH-1～17為真菌；QHH-18～23為放線菌；DLHX-1～16為真菌；DLHX-17～24為放線菌。

2.4 抗菌活性測定結(jié)果

普通變形桿菌屬于變形桿菌屬(Proteus)，廣泛存在于水、土壤、腐敗有機物以及人和動物的腸道中，最常見的是普通變形桿菌(P.vulgaris)，此外還有奇異變形桿菌(P.mirabilis)、摩根氏變形桿菌(P.morganii)及瑞特杰爾變形桿菌(P.rettgeri)，性狀皆大同小異。普通變形桿菌有明顯的多形性，可呈球形和絲狀等多形態(tài)，無芽孢、無莢膜，有周鞭毛，運動活潑。本實驗以普通變形桿菌(P.vulgaris)為檢定菌，利用平板擴散法(液體發(fā)酵樣品)和紙片擴散法(含有機溶劑樣品)，對23株菌株樣品進行了抑菌活性測試。測定結(jié)果顯示，柴達木盆地土壤來源真菌DLHX-5和放線菌DLHX-1～5具有對P.vulgaris生長抑制作用。

3 討論

土壤菌株多樣性是全球生物多樣性的重要組成部分，不僅是通過病原或共生與植物形成非常密切的聯(lián)系，而且還是凋落物和植物殘體降解的“主力軍”。研究表明，從局部領(lǐng)域尺度到全球領(lǐng)域尺度，植物多樣性與土壤菌株多樣性的耦合關(guān)系并非一致，特別是在高寒生態(tài)系統(tǒng)的植物生產(chǎn)力、植物多樣性和菌株多樣性的關(guān)系還不是很明確。

青藏高原作為全球海拔居首位的高原，被稱為“第三極”。該地區(qū)氣候低、養(yǎng)分貧乏以及生態(tài)系統(tǒng)也是十分的脆弱，全球氣候變化極為敏感。盡管青藏高原自然環(huán)境差，但是該區(qū)域依舊棲息著大量的微生物，促使整個生態(tài)系統(tǒng)的元素生物有序的循環(huán)。對整個高原生態(tài)系統(tǒng)的組成和維持具有不可忽視的作用，同時具有重要的研究意義。

中國科學(xué)院南京土壤研究所褚海燕教授課題組研究了青藏高原高寒草原土壤菌株的多樣性以及菌落組成。著重討論了地上植物與土壤菌株在空間分布上的耦合關(guān)系。研究結(jié)果表明，地上植物的β多樣性和α多樣性與土壤菌株的β多樣性和α多樣性呈現(xiàn)出強烈的耦合關(guān)系。偏最小二乘回歸模型、多元線性回歸以及方差分解，分析共同揭示了植物多樣性對土壤菌株多樣性的驅(qū)動作用，但植物生產(chǎn)對菌株多樣性的作用并不明顯，該研究指出，制約土壤菌株多樣性的首要因素是地上植物多樣性。此外，溶解性有機碳、土壤碳氮比和土壤總磷對土壤菌株多樣性也有顯著影響，結(jié)果對我國高寒草原土壤菌株多樣性的資源開發(fā)利用以及保護具有一定的意義。

4 結(jié)論

本論文通過系統(tǒng)菌株分離純化，從青海湖和柴達木盆地2份土壤和1株大型青藏高原菌株樣品中分離得到49株菌，有真菌34株、放線菌15株。所有菌株進行斜面或甘油保存，為進一步探究其次級代謝產(chǎn)物多樣性奠定基礎(chǔ)。對青藏高原微生物多樣性研究國內(nèi)起步比較晚，文獻報道，與其它生境生長的微生物相比，青藏高原土壤微生物具有耐寒和耐紫外線活性，本論文由于時間關(guān)系無法考究所有菌株的這些性質(zhì)。